超聲波分離sar反應(yīng)器生物膜的研究

超聲波分離sar反應(yīng)器生物膜的研究

在貧化條件下，生物膜中的生物量降低。傳統(tǒng)的測(cè)定方法(如磷脂法、耗氧呼吸速率等)檢出限無(wú)法達(dá)到測(cè)定要求。而分子生物學(xué)方法(如FISH等)又對(duì)分析設(shè)備、試劑、操作及定量方法等有較高的要求。因此,探索一種操作方便且能對(duì)生物膜進(jìn)行定量分析的方法十分有意義。BAR(BiologicalAnnularReactor)反應(yīng)器是一種用于模擬飲用水管網(wǎng)中各種水質(zhì)參數(shù)和水力條件對(duì)管壁生物膜影響的實(shí)驗(yàn)室物理模型。筆者研究了使用超聲波清洗器分離載片上生物膜的可行性,應(yīng)用該法對(duì)BAR反應(yīng)器中不銹鋼載片上分離出的生物膜進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù),對(duì)生物膜的形成過(guò)程進(jìn)行了初步研究。1試驗(yàn)設(shè)備和方法1.1洗槽容積及工作頻率選用KQ-500B型超聲波清洗器,超聲電功率為500W,工作頻率為40kHz,洗槽容積為22.5L。超聲波對(duì)細(xì)菌的滅活效果、對(duì)生物膜的分離作用試驗(yàn)均在洗槽中進(jìn)行(溫度為15℃),裝置如圖1所示。1.2轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)模擬反應(yīng)器組成見(jiàn)圖2。其中掛有12個(gè)載片(材質(zhì)為聚碳酸酯或不銹鋼),安裝于轉(zhuǎn)子上,轉(zhuǎn)子在電機(jī)的驅(qū)動(dòng)下旋轉(zhuǎn)。隨著轉(zhuǎn)子的旋轉(zhuǎn),載片與水體的交界面間產(chǎn)生剪切力,可模擬管網(wǎng)中的水力條件。反應(yīng)罐體積約為1.5L,水力停留時(shí)間為2h,載片掛膜面積為32cm2。1.3超聲波清洗法分離溫度在進(jìn)行生物膜分離測(cè)試前首先測(cè)定超聲波對(duì)懸浮菌液中細(xì)菌的滅活能力。懸浮菌液分別采用增殖培養(yǎng)后的自來(lái)水土著細(xì)菌和大腸桿菌配制,考察超聲波對(duì)兩種菌液中細(xì)菌的滅活效果。在BAR反應(yīng)器運(yùn)行約15d后,取出2片載片,載片材料為聚碳酸酯(Ploycarbonate)。首先使用無(wú)菌水淋洗載片表面,將未附著在載片表面上的細(xì)菌沖洗掉。然后:①使用2根滅菌棉簽先后向下擦拭載片掛膜面各5次,擦拭完后將兩根棉簽一起放入盛有10mL緩沖溶液的試管中,使用超聲波清洗器清洗,每隔10min從試管中取出100μL水樣稀釋,進(jìn)行平板計(jì)數(shù),考察超聲波對(duì)棉簽上細(xì)菌的分離清洗作用。②將另一載片直接放入盛有100mL緩沖液的錐形瓶,使用超聲波清洗器清洗,每隔10min從錐形瓶中取出1mL水樣稀釋,進(jìn)行平板計(jì)數(shù),考察超聲波對(duì)載片上細(xì)菌的直接分離清洗作用。1.4計(jì)數(shù)法和染色方法總細(xì)菌計(jì)數(shù)采用吖啶橙染色直接計(jì)數(shù)法(AODC,AcridineOrangeDirectCounts)?；罴?xì)菌計(jì)數(shù)采用活菌直接計(jì)數(shù)法(DVC,DirectViableCounts)和異養(yǎng)菌平板計(jì)數(shù)法(HPC,HeterotrophicPlateCounts),其中平板計(jì)數(shù)采用R2A培養(yǎng)基,活菌直接計(jì)數(shù)采用CTC(5-cyano-2,3-ditolyltetra-zoliumchloride,5-氰基-2,3-聯(lián)甲苯四唑鹽酸鹽)作為染色劑。總大腸菌群計(jì)數(shù)采用濾膜法。2試驗(yàn)結(jié)果與討論2.1細(xì)菌、大腸桿菌滅活率采用超聲波對(duì)飲用水中的懸浮土著細(xì)菌及大腸桿菌進(jìn)行滅活的試驗(yàn)表明,在1h的作用時(shí)間內(nèi)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)滅活效果有所增強(qiáng),但是對(duì)土著細(xì)菌最大滅活率僅為11.1%,對(duì)大腸桿菌的最大滅活率僅為16.6%,且前20min內(nèi)基本無(wú)效果。因此,采用清洗、超聲波分離生物膜或混勻懸浮液中的細(xì)菌,只要將作用時(shí)間控制在一定范圍內(nèi)基本不會(huì)造成生物量的損失。2.2面積載片污染情況按照1.3中所述方法進(jìn)行生物膜分離試驗(yàn),結(jié)果表明,兩種方法均在20min左右達(dá)到最佳分離效果。但是直接從載片上分離得到的細(xì)菌數(shù)最大為10588CFU/cm2(單位面積載片上的細(xì)菌數(shù)),而使用棉簽的方法得到的為33750CFU/cm2,是直接分離方法的3.2倍。由此可見(jiàn),采用棉簽擦洗然后超聲分離的方法更適于生物膜分離。超聲波作用60min后,將試管中的棉簽取出,重新放入10mL新鮮的緩沖液中用超聲波再次清洗。20min后從緩沖液中取水樣進(jìn)行平板計(jì)數(shù),計(jì)數(shù)結(jié)果為608CFU/cm2?？梢?jiàn),棉簽上98.2%的細(xì)菌被清洗下來(lái),分離率很高。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出,將超聲波作用時(shí)間控制在20min左右既可以保證水樣中細(xì)菌的活性又可最大程度地清洗分離棉簽上的細(xì)菌。2.3不銹鋼載片表面生物膜細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果采用棉簽+超聲波的方式分離不銹鋼載片上的生物膜,超聲波作用時(shí)間控制在20min。不銹鋼載片取自BAR反應(yīng)器,細(xì)菌計(jì)數(shù)方法分別采用AODC、DVC和HPC。反應(yīng)器進(jìn)水條件如表1所示,試驗(yàn)結(jié)果如圖3~5所示。可見(jiàn)不同計(jì)數(shù)方法測(cè)得的生物膜中細(xì)菌數(shù)量有明顯不同,計(jì)數(shù)結(jié)果大小順序?yàn)锳ODC>DVC>HPC,但是不同計(jì)數(shù)方法反映出的膜生長(zhǎng)規(guī)律相同,均表明不銹鋼載片表面生物膜的生長(zhǎng)在16~19d內(nèi)可達(dá)假穩(wěn)態(tài)。當(dāng)生物膜達(dá)到假穩(wěn)態(tài)時(shí),總細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果(AODC)為3.5×106CFU/cm2,活細(xì)菌直接計(jì)數(shù)結(jié)果(DVC)為4.8×105CFU/cm2,平板計(jì)數(shù)結(jié)果(HPC)為1.2×105CFU/cm2。DVC計(jì)數(shù)結(jié)果約占AODC的14%。由于自然環(huán)境中大多數(shù)微生物是不可培養(yǎng)的(Nonculturable),所以DVC結(jié)果高于平板計(jì)數(shù)結(jié)果。而AODC計(jì)數(shù)并不區(qū)分活菌和死菌,因此其計(jì)數(shù)結(jié)果最高。3生物膜的清洗利用①通過(guò)試驗(yàn)證明,棉簽+超聲波是一種分離載片上生物膜的有效方法。盡管超聲波對(duì)細(xì)菌有一定的滅活效果,但是只要將作用時(shí)間控制在20min內(nèi),就基本不會(huì)造成生物量的損失,而且還可最大程度地清洗分離棉簽上的細(xì)菌。②采用該法對(duì)BAR反應(yīng)器中不銹鋼載片表面生物膜的研究結(jié)果表明:AODC、DVC和HPC三種不同計(jì)數(shù)方法測(cè)得的生物膜中細(xì)菌數(shù)量有明顯不同,達(dá)假穩(wěn)態(tài)時(shí)總細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果(AODC)為3.5×106CFU/cm2