內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特征及臨床運(yùn)用

內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特征及臨床運(yùn)用Abstract:Endothelialprogenitorcells（EPCs）aretheprecursorcellsofthevascularendothelialcells.EPCsisnowbeingmoreandmoreintroducedintothebasicresearchinmedicine,cellbiologyandotherfieldsaboutvasculardiseasewiththestudyofitsculture,identification,hominganddifferentiation.Studieshaveshownthatendothelialprogenitorcellscanpromotewoundhealingandtherecoveryofvascularfunction,becominganewmethodtoconstructcardiovasculartissueengineering.ThispaperreviewedthebiologicalcharacteristicsofEPCsanditsapplicationinanimalischemiamodelsandclinicaltrial.ThepaperalsoanalyzedthechallengeofEPCsapplication.Finally,weprospectedtheresearchdirectionofEPCsinthefuture.Keyword:endothelialprogenitorcell;exvivoexpansion;biologicalproperties;vasculogenesis;clinicalapplication;1997年，日本學(xué)者Asahara等[1]首次從人外周血中分離出血管內(nèi)皮生長因子受體2（vasucularendothelialgrowthfactorreceptor2,VEGFR-2）和CD34均為陽性的單核細(xì)胞，而且能夠表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞的特異性抗原，故命名為內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelialprogenitorcells,EPCs）,也稱為成血管細(xì)胞（angioblast）,在生理或病理等因素的刺激下，可從骨髓動(dòng)員到外周血參與損傷血管的修復(fù)，通過遷移、歸巢到靶組織并進(jìn)入新生血管，定向增殖分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)維持血管內(nèi)膜的穩(wěn)定性起著重要作用[2,3];此外，研究發(fā)現(xiàn)EPCs既參與血管生成，也參與機(jī)體和器官損傷后的血管修復(fù)與新生，在心腦血管疾病、外周血管疾病、腫瘤血管形成及創(chuàng)傷愈合等方面均發(fā)揮重要作用，并為缺血性疾病的治療提供了新思路，具有廣闊的應(yīng)用前景[4~6].然而，EPCs治療仍面臨諸多困難，從高齡病人分離的EPCs數(shù)量低、質(zhì)量差，達(dá)不到理想的治療效果[7].本文就內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特征及臨床應(yīng)用等研究概況作簡(jiǎn)要概述，以期為內(nèi)皮祖細(xì)胞的應(yīng)用研究提供參考。1、EPCs的生物學(xué)特性1.1EPCs的鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞在體外有兩種，分早期和晚期。早期EPCs呈現(xiàn)紡錘形，晚期EPCs形成鋪路石樣的橢圓形結(jié)構(gòu)。單從形態(tài)學(xué)特征上無法辨認(rèn)出早期EPCs,由于血液與血管的發(fā)生聯(lián)系緊密，其細(xì)胞也共享許多細(xì)胞表面標(biāo)記。研究發(fā)現(xiàn)，HSCs和EPCs都起源于血管干細(xì)胞，因此他們具有相同的表面標(biāo)記（CD34、CD133）[8].人類EPCs的表面標(biāo)記物有CD34、CD133、FLK-1/KDR、CXCR4和CD105等，而在小鼠中其表面標(biāo)志物則為C-kit+/Sca-1+/Lin-（KSL）[1,9~11],這些細(xì)胞群在缺血條件下參與血管形成，表明它們具有血管再生能力?，F(xiàn)在最常用的鑒定EPCs的表面分子抗原組合有VEGFR-2、CD133和CD34,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為同時(shí)具有CD34+、CD133+及VEGFR-2等表面抗原的稱為EPCs[12],但單獨(dú)一個(gè)表面分子抗原是不具有特異性的。例如，CD34+在骨髓來源的內(nèi)皮細(xì)胞和造血干細(xì)胞（hematopoieticstemcells,HSCs）上都有所表達(dá)[13].VEGFR-2是胚胎血管發(fā)育時(shí)的關(guān)鍵受體，是血液血管干細(xì)胞的表面標(biāo)記，在出生后也表達(dá)于早期造血干細(xì)胞和成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞上[14].CD133選擇性地表達(dá)于早期造血細(xì)胞和胚胎肝、骨髓以及外周血的祖細(xì)胞，在成熟內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)[15].由此可見，EPCs在不同發(fā)育階段可能表達(dá)不同的表面標(biāo)記。最近有研究顯示，起源于臍血單核細(xì)胞的CD34+/CD14-或CD34-/CD14+的細(xì)胞也可分化為EPCs[16],此外，還能通過多種方法鑒定EPCs,內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelialnitricoxidesynthase,eNOS）也是它的特征之一[17].通過電鏡可觀察到內(nèi)皮細(xì)胞特有的細(xì)胞器Weibel-palade小體[18],它是一種分泌性桿狀的細(xì)胞器，含有多種生物活性分子，如血管性血友病因子（vonwillebrandfactor,vWF）,受到刺激后可以非常迅速的釋放這些內(nèi)容物，參與止血、炎癥和血管生成等生理功能。內(nèi)皮細(xì)胞吞噬低密度脂蛋白是其重要的生物學(xué)功能之一，EPCs在分化過程中能表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞免疫表型，且具有吞噬乙?；兔芏戎鞍缀徒Y(jié)合荊豆凝集素的能力[19],可以利用這種能力對(duì)EPCs進(jìn)行檢測(cè)，通過Dil標(biāo)記乙?；兔芏戎鞍缀虵ITC標(biāo)記的荊豆凝集素雙染實(shí)驗(yàn)來鑒定EPCs表型。非造血系EPCs的來源不是HSCs,它可能來自組織或器官，非造血系EPCs通過連續(xù)培養(yǎng)獲得，它們具有分化為內(nèi)皮細(xì)胞的能力，這種細(xì)胞又被稱為EOCs[20],它們?cè)隗w外培養(yǎng)條件下呈內(nèi)皮細(xì)胞樣特征，培養(yǎng)7d后，匯合形成鵝卵石樣單層多角形細(xì)胞。這種EPCs亞型表達(dá)CD31、CD34、CD105、CD146、VE-cadherin和VEGFR-2,而不表達(dá)造血系表面標(biāo)志物CD133[21].這類EPCs能形成毛細(xì)血管和產(chǎn)生NO,從而增強(qiáng)后肢血管的新生能力[22].盡管這類具有血管生成潛能的EPCs能應(yīng)用于細(xì)胞治療，但在培養(yǎng)的過程中，它們的增殖活性減弱和逐步衰老的現(xiàn)象使之用于治療受到限制[23],若同時(shí)考慮到分離技術(shù)和培養(yǎng)方法，這些非造血系EPCs是不適用于臨床的。1.2EPCs的歸巢和分化EPCs的歸巢是在血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromalcellderivedfactor,SDF-1）的參與下，使外周血中的EPCs遷移到組織缺血或內(nèi)皮損傷部位，黏附并結(jié)合到受損血管的過程。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)將含有VEGF的填充物移植到缺血部位，可引起移植部位EPCs的聚集，促進(jìn)血管新生，表明VEGF有促進(jìn)EPCs歸巢的作用[24].另外，還有研究人員發(fā)現(xiàn)，小窩蛋白（caveolin）通過VEGF/NO通路來調(diào)控SDF-1介導(dǎo)的EPCs歸巢，從而直接影響血管的新生[25].SDF-1是動(dòng)員EPCs向缺血部位聚集的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一，能誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞遷移和EPCs的形成。EPCs向缺血損傷部位歸巢，形成集群后修復(fù)損傷組織[26].因此EPCs的克隆形成能力及其檢測(cè)方法對(duì)于研究血管的生成是很重要的。有研究人員從外周血或臍血中分離出單個(gè)核細(xì)胞，并培養(yǎng)出了內(nèi)皮細(xì)胞克隆團(tuán)（colony-formingunit-endothelialcells,CFU-ECs）[27].新的EPCs克隆形成（EPCscolonyformingassay,EPCs-CFA）方法可以估計(jì)祖細(xì)胞的數(shù)量，也能評(píng)估克隆團(tuán)的質(zhì)量[28].利用EPCs-CFA方法可以把兩種細(xì)胞群體區(qū)分開來，即原始的（?。〦PCs群體和成熟的（大）EPCs群體。這兩類細(xì)胞群體各有特點(diǎn)，原始的（?。〦PCs具有高度的增殖能力，而成熟的（大）EPCs具有分化和促進(jìn)血管修復(fù)的能力[29].有學(xué)者認(rèn)為CD133/CD14表達(dá)的喪失，同時(shí)伴隨vWF及其他成熟內(nèi)皮特異性標(biāo)志物和特征的形成就表明內(nèi)皮細(xì)胞分化成熟[30].目前的研究認(rèn)為EPCs除了分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞以外，還可以分化為骨骼肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和心肌樣細(xì)胞[31].有研究發(fā)現(xiàn)，PPAR7受體激動(dòng)劑通過上調(diào)eNOS的表達(dá)使EPCs向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化，而抑制其向平滑肌細(xì)胞分化[32].而用C-反應(yīng)蛋白處理EPCs,可通過抑制eNOSmRNA的表達(dá)，顯著抑制EPCs的分化，并加速其凋亡[33].有研究發(fā)現(xiàn)，層流切應(yīng)力促進(jìn)EPCs向動(dòng)脈ECs分化，而抑制其向靜脈ECs分化。剪切力在促進(jìn)EPCs向ECs分化的同時(shí)，抑制了干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、CD34的表達(dá)[34].也有研究表明纖維連接蛋白促進(jìn)EPCs分化[35].2、EPCs的應(yīng)用2.1EPCs在動(dòng)物肢體缺血模型中的應(yīng)用目前，EPCs治療肢體缺血疾病被廣泛研究。當(dāng)肢體缺血患者因?yàn)闆]有藥物治療，不適合手術(shù)而只能選擇截肢時(shí)，EPCs治療給他們帶來了希望。利用EPCs治療動(dòng)物損傷模型的治療方法有所差異，有的學(xué)者利用新分離的細(xì)胞，也有學(xué)者利用多種細(xì)胞因子/生長因子組合培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞。研究人員利用鼠類和兔進(jìn)行了大量的研究，外源性EPCs能夠修復(fù)后肢缺血模型中受損的血管[36,37].這些實(shí)驗(yàn)表明，EPCs在缺血損傷時(shí)參與毛細(xì)血管生成和改善組織灌注。由于造血干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞具有共同的表面標(biāo)記，利用當(dāng)前的技術(shù)無法將它們區(qū)分。最近，有研究表明通過CD34陽性分選可以得到一部分EPCs,對(duì)肢體缺血的糖尿病小鼠局部注射CD34+細(xì)胞，結(jié)果表明CD34+細(xì)胞具有促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和促進(jìn)血管生長的功能[38].Li等[39]發(fā)現(xiàn)分離自骨髓的CD34+在移植后具有更高的募集能力。Elsharawy等[40]將人CD34+細(xì)胞移植到后肢缺血的糖尿病裸鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)明顯恢復(fù)了血流。2.2EPCs在臨床試驗(yàn)上的應(yīng)用治療性血管生成的主要目的是強(qiáng)化合適的血管形成和改善組織灌注。一些理想的動(dòng)物研究結(jié)果促進(jìn)了早期臨床試驗(yàn)的開展。促進(jìn)肢體缺血患者的側(cè)支血管生成和血管新生是減少組織損傷與嚴(yán)重缺血的主要治療策略。根據(jù)細(xì)胞來源，治療方式可分為非選擇性EPCs治療和選擇性EPCs治療，非選擇性EPCs治療利用骨髓來源的單個(gè)核細(xì)胞（mononuclearcells,MNCs）,它包括EPCs部分和非EPCs部分；選擇性EPCs治療利用的是外周血（peripheralblood,PB）或BM-MNCs中分離和純化的EPCs[40,41].純化的CD34+細(xì)胞能參與血管新生和內(nèi)皮修復(fù)，BM-MNCs在收到促進(jìn)動(dòng)員、歸巢和分化的信號(hào)后，能形成成熟的內(nèi)皮細(xì)胞。生理?xiàng)l件下循環(huán)血中的EPCs數(shù)量很少，粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocytecolony-stimulatingfactor,G-CSF）可以促進(jìn)EPCs從骨髓中動(dòng)員到外周血中，因此，促進(jìn)BM-MNCs動(dòng)員和歸巢會(huì)增強(qiáng)EPCs介導(dǎo)的血管新生[42,43].有學(xué)者利用BM-MNCs治療外周動(dòng)脈疾?。╬eripheralarterialdisease,PAD）,他們使用的就是細(xì)胞移植治療血管生成方法。隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)表明，肌肉注射自體BM-MNCs能顯著改善腿部疼痛范圍、潰瘍大小和疼痛自由行走距離，這種良性結(jié)果能夠維持至少2年[44].Kawamoto等[45]報(bào)道了一個(gè)自體移植的I/II期臨床試驗(yàn)，通過G-CSF動(dòng)員下肢嚴(yán)重缺血患者的BM-EPCs,G-CSF能有效地動(dòng)員BM-EPCs進(jìn)入血液，分離所得到的CD34+細(xì)胞即為EPCs.所有患者在細(xì)胞治療12周后，病情得到明顯改善，CD34+細(xì)胞移植后各項(xiàng)病理指標(biāo)得到明顯改善。研究顯示，將自體動(dòng)員的CD34+細(xì)胞移植到頑固性糖尿病足患者體內(nèi)，I/II期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，5例患者中3例未發(fā)生小截肢、復(fù)發(fā)、死亡及其他嚴(yán)重不良事件。另外，當(dāng)以高劑量EPC-CFU和CD34+/KDR+細(xì)胞進(jìn)行治療時(shí)，傷口愈合效果明顯改善，無復(fù)發(fā)或異位潰瘍[44].這些結(jié)果表明，EPCs的數(shù)量和血管生成潛力直接影響細(xì)胞療法的療效。因此，較高劑量的EPC-CFU和CD34+/KDR+細(xì)胞是EPCs進(jìn)行有效治療的關(guān)鍵。細(xì)胞治療對(duì)于下肢嚴(yán)重缺血患者基本沒有限制，具有一定的安全性和可行性。3、EPCs的應(yīng)用挑戰(zhàn)要成功地將EPCs介導(dǎo)的血管修復(fù)和血管生成應(yīng)用于臨床，還需要更好地理解EPCs的生物學(xué)特性。目前，EPCs治療應(yīng)用主要受到數(shù)量和質(zhì)量的限制。由于外周血中的EPCs較少，細(xì)胞分離過程中細(xì)胞質(zhì)量會(huì)降低，不得不進(jìn)行多次動(dòng)員和分離EPCs從而加重了病人的負(fù)擔(dān)。研究發(fā)現(xiàn)PBCD34+細(xì)胞移植治療功能性血管再生具有劑量依賴效應(yīng)[46].在一些特殊情況下，如高齡、糖尿病、心血管疾病和其他風(fēng)險(xiǎn)因素等都能損害EPCs的功能，使其遷移和歸巢到靶組織的能力受到影響[47,48].年齡的升高會(huì)減弱內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能，產(chǎn)生保護(hù)性細(xì)胞因子，并造成生長因子的量減少，且活性減弱，導(dǎo)致患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加[49].老齡化也與血管壁內(nèi)源性的改變有關(guān)，主要是內(nèi)皮細(xì)胞的流失導(dǎo)致了內(nèi)皮功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定性冠心?。╟oronaryarterydisease,CAD）患者術(shù)前的循環(huán)EPCs隨著年齡的增加而減少，隨著VEGF水平下降而減少。而同齡人中，含較少EPCs的人更易患心血管疾病。多因素分析表明，EPCs的減少預(yù)測(cè)了心血管疾病不良的預(yù)后[50],通過減少風(fēng)險(xiǎn)因素能夠恢復(fù)循環(huán)中EPCs的正常水平[51].由于糖尿病和EPCs功能損傷有關(guān)，糖尿病通常伴隨著很多血管并發(fā)癥，缺乏血管內(nèi)皮再生和血管再生受損是糖尿病血管并發(fā)癥的根本原因。糖尿病患者的內(nèi)環(huán)境含有大量的活性氧簇，它們由活性NADPH氧化酶產(chǎn)生，NADPH氧化酶能降低NO的生物學(xué)利用度，從而導(dǎo)致糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生和加重，抑制NADPH氧化酶的活性能恢復(fù)CD34+細(xì)胞的遷移和歸巢到靶組織的能力[52].由于病人內(nèi)源性EPCs的數(shù)量少、質(zhì)量差，與健康人相比自體EPCs移植治療效果不好。在治療糖尿病足患者時(shí)，PBCD34+細(xì)胞修復(fù)組比對(duì)照組的治療效果差，老年患者EPCs動(dòng)員數(shù)量降低，缺血性損傷可由正常人的CD34+細(xì)胞修復(fù)，但糖尿病患者的CD34+細(xì)胞治療效果很差[50].為了克服這一問題，可使用細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù)增強(qiáng)EPCs的存活率和細(xì)胞增殖。此外，收集和分離細(xì)胞的漫長過程也會(huì)影響患者的康復(fù)。如前體祖細(xì)胞的增殖或前處理等步驟會(huì)造成移植時(shí)間的推遲?？傊?，盡管臨床試驗(yàn)表明自體EPCs治療具有安全性和有效性，但仍然需要克服一些缺陷，如：分離技術(shù)和過程、細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞數(shù)量。4、展望內(nèi)皮祖細(xì)胞以其獨(dú)特的生物學(xué)特性成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中重要的治療工具，在機(jī)體缺血、組織損傷、細(xì)胞因子或藥物刺激下，EPCs可從骨髓向靶部位動(dòng)員、增殖、分化，形成新生血管，在多種缺血性疾病和血管損傷方面有著廣闊的應(yīng)用前景。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將必要的基因轉(zhuǎn)給EPCs,從而增強(qiáng)其增殖或新生血管的能力，擴(kuò)大在臨床上的應(yīng)用范圍。此外，EPCs在組織工程和腫瘤治療方面也有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值。但是，我們必須要先理解EPCs的生物學(xué)特性，并繼續(xù)研究了解EPCs在健康和疾病中的身份和角色。這些努力將提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)來指導(dǎo)研究者對(duì)細(xì)胞治療進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)。參考文獻(xiàn)[1]AsaharaT,IsnerJM.Isolationofputativeprogenitorendothelialcellsforangiogenesis[J].Science,1997,275（5302）:964.[2]TakahashiT,KalkaC,MasudaH,etalIschemia-andcytokine-inducedmobilizationofbonemarrow-derivedendothelialprogenitorcellsforneovascularization[J].Nat.Med.,1999,5（4）:434-438.[3]FadiniGP,LosordoD,DimmelerS.Criticalreevaluationofendothelialprogenitorcellphenotypesfortherapeuticanddiagnosticuse[J].Circul.Res.,2012,110（4）:624.[4]KawamotoA,LosordoDW.Endothelialprogenitorcellsforcardiovascularregeneration[J].TrendsCardiovasc.Med.,2008,18（1）:33-37.[5]ZhaoYH,YuanB,ChenJ,etalEndothelialprogenitorcells:Therapeuticperspectiveforischemicstroke[J].CNSNeurosci.Therapeut.,2013,19（2）:67-75.[6]RuraliE,BassettiB,PerrucciGL,etalBMageing:implicationforcelltherapywithEPCs[J].Mechan.Age.Dev.,2016,159:4-13.[7]DiSR,FeliceF,PiniS,etalImpactofdepressiononcirculatingendothelialprogenitorcellsinpatientswithacutecoronarysyndromes:Apilotstudy[J].J.Cardiovasc.Med.,2014,15（4）:353.[8]RufaihahAJ,HaiderHK,HengBC,etalTherapeuticangiogenesisbytransplantationofhumanembryonicstemcellderivedCD133+endothelialprogenitorcellsforcardiacrepair[J].Regenerat.Med.,2015,5（2）:231-244.[9]LeeJH,LeeSH,YooSY,etalCD34hybridcellspromoteendothelialcolony-formingcellbioactivityandtherapeuticpotentialforischemicdiseases[J].Arterioscl.Thrombo.Vascul.Biol.,2013,33（7）:1622-1634.[10]YangJ,IiM,KameiN,etalCD34+Cellsrepresenthighlyfunctionalendothelialprogenitorcellsinmurinebonemarrow[J].PLoSONE,2011,6（5）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