烏飯樹葉提取物抗氧化活性的研究

烏飯樹葉提取物抗氧化活性的研究

這是越南的一棵寶貴的、有開發(fā)前景的食用和觀賞植物。這是一種非常寶貴和有發(fā)展前景的綠色植物。這是多年生和落葉灌木，在全國各地都分布著，尤其是在長江以南的山區(qū)。烏飯樹樹葉富含濃縮型單寧(condensedtannin)、槲皮素等為代表的多酚類化合物,濃縮型單寧主要由兒茶素或表兒茶素構(gòu)成,但至今已分離到的絕大多數(shù)濃縮型單寧的黃烷單元都沒有超過6個(gè)。濃縮型單寧無毒、水溶性,且具有較強(qiáng)抗氧化性。本文通過對烏飯樹葉提取物進(jìn)行抗氧化能力研究,欲為開發(fā)相關(guān)保健食品和醫(yī)藥用品提供理論依據(jù),為工業(yè)化生產(chǎn)新的天然抗氧化物提供原料資源。1材料表面1.1基自由基dpph烏飯樹葉:采自浙江新昌,自然陰干,粉碎、過40目篩,密閉冷藏備用。二苯代苦味?；杂苫鵇PPH·(1,1-dipheny-2-picryl-hydrazyl),ALDRICH,USA;亞油酸,Fluka,USA;Vc(L-壞血酸),食品級(jí);甲醇,色譜純;赤血鹽、FeCl3、Tween60及其他試劑均為分析純。1.2儀器與設(shè)備紫外-可見分光光度計(jì)(UV-2450,SHIMADZUCorporation),真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52D,上海安亭實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),超聲波振蕩器(SK2200LH,上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。2實(shí)驗(yàn)方法2.1提取的黑李子2.1.1烏炭樹葉粗提物的提取稱取5.00g烏飯樹葉粉末于100mL具塞錐形瓶中,加入75mL體積分?jǐn)?shù)60%乙醇,在室溫下,于超聲波振蕩器中以59kHz的頻率進(jìn)行震蕩提取20min,重復(fù)2次,合并提取液,用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至大約20mL(水浴溫度不得超過70℃),待濃縮液冷卻至室溫后,加入到20mL無水乙醇中,振搖,濾除沉淀,濾液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮直至得到浸膏,此即烏飯樹葉粗提物。將烏飯樹葉粗提物配制成濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1mg/mL的溶液,冷藏,備用。2.1.2烏炭樹葉精提物的制備取20mL烏飯樹葉粗提物浸膏于100mL錐形瓶中,然后向瓶中加入20mLCHCl3,振搖,過濾,收集濾渣,濾渣繼續(xù)加入20mL乙酸乙酯,振搖,過濾,收集濾渣,此即為烏飯樹葉精提物。將烏飯樹葉精提物配制成濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1mg/mL的溶液,冷藏,備用。2.2lc溶液的制備將Vc配成濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1mg/mL的溶液,冷藏,備用。2.3抗逆效應(yīng)的測定測定抗氧化活性的方法有很多,本研究采用還原力測定、脂質(zhì)過氧化能力測定及DPPH·自由基清除能力測定3種方法。2.3.1%的赤血鹽溶液、三氯乙酸及fecl3溶液的制備分別取4mL烏飯樹葉粗提物、烏飯樹葉精提物和Vc的系列溶液置于10mL試管中,分別向其中加入1mL的磷酸緩沖液(pH=6.6)和1mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的赤血鹽溶液,于50℃下反應(yīng)20min,冰浴。冷卻到室溫后,向試管內(nèi)加入1mL10%三氯乙酸,然后以2500r/min的速度離心,時(shí)間為20min。取5mL上清液于另一試管中,并加入5mL的去離子水,最后加入1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的FeCl3溶液。10min后,用紫外-可見分光光度計(jì)于700nm下測定其吸光值。同時(shí)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)。還原力=樣品吸光值-空白對照組的吸光值2.3.2dpph甲醇溶液的制備分別取4mL烏飯樹葉粗提物、烏飯樹葉精提物和Vc的系列溶液置于10mL試管中,然后向試管中加入4mL濃度為0.08mg/mL的DPPH甲醇溶液,混合均勻,以錫箔遮蓋試管,靜置30min,用紫外-可見分光光度計(jì)于517nm處測定其吸光值。同時(shí)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)。清除能力/%=空白吸光值?樣品吸光值空白吸光值×100/%=空白吸光值-樣品吸光值空白吸光值×1002.3.3苯甲酸分光光度法分別取0.5mL烏飯樹葉粗提物、烏飯樹葉精提物和Vc的系列溶液置于10mL試管中,然后向試管中加入10mL的0.01mol/L亞油酸溶液(將0.28g的亞油酸與0.28gTween60混合均勻,然后用pH=6.5的磷酸鹽緩沖溶液定容至100mL),在37℃恒溫暗室中反應(yīng)15h后,冰浴。冷卻后,取反應(yīng)液0.5mL,加入20mL體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇溶液,用紫外-可見分光光度計(jì)在波長234nm下測定其吸光值。同時(shí)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)。抑制率/%=空白吸光值?樣品吸光值空白吸光值×100/%=空白吸光值-樣品吸光值空白吸光值×1003結(jié)果和分析3.1還原力對vc突出穩(wěn)定性的影響從圖1中可知,Vc、烏飯樹葉粗提物和精提物的還原力都隨著濃度的升高而增大,但增幅有所不同,Vc的還原能力雖明顯強(qiáng)于后兩者。如果將1mg/mL的Vc的還原力定為1,那么同濃度的烏飯樹葉精提物和粗提物的還原力分別為0.88和0.51。Vc是一種有強(qiáng)還原性的不穩(wěn)定酸性物質(zhì),雖不含自由羧基,但它有2個(gè)鄰位烯醇式的羥基,此羥基又能各釋放出一個(gè)H+,而成為脫氫抗壞血酸,因而不但具有酸性,且有很強(qiáng)的還原性,可使活性氧自由基在此鄰位羥基上發(fā)生共振,以穩(wěn)定自由基;此外,Vc還具有一個(gè)羰基(CO)官能團(tuán),可提高共振結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定度,因此Vc的還原能力最佳。而對于烏飯樹葉提取物中的濃縮單寧,其主要由兒茶素通過C-4位和另一單元的C-8或C-6位連接而成,其B環(huán)上雖也有2個(gè)鄰位烯醇式羥基,但并無羰基,此為其還原能力要較Vc差的原因。3.2清除自由基的能力DPPH·為一相當(dāng)穩(wěn)定的自由基,其甲醇溶液在517nm附近有強(qiáng)的吸光值,當(dāng)被抗氧化劑還原,或與另外一個(gè)自由基結(jié)合時(shí),吸光值都會(huì)降低,其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系。因而可用分光法進(jìn)行定量分析,并以此來判斷樣品捕捉自由基的能力。清除DPPH·自由基的能力主要與酚環(huán)結(jié)構(gòu)上的羥基有關(guān),其羥基越多,供給DPPH·自由基的H+也就越多,那么其清除自由基的能力也就越強(qiáng)。如圖2所示,烏飯樹葉精提物的清除率最高,因?yàn)榫嵛镏械臐饪s單寧的每一個(gè)結(jié)構(gòu)單元上都具有4～5個(gè)酚羥基,可以很容易地向DPPH·自由基供應(yīng)H+,而Vc只有2個(gè)易供氫的雙烯醇式羥基,所以烏飯樹精提物的清除率要高于Vc。至于烏飯樹粗提物,因?yàn)榭s合單寧的含量相對較低,所以其清除DPPH·自由基的能力也低。如果將1mg/mL的Vc清除DPPH·自由基的能力定為1,那么同濃度的烏飯樹葉精提物和粗提物的清除能力分別為1.4和0.55。3.3vc對脂質(zhì)自由基的抑制作用脂質(zhì)一旦被氧化,就會(huì)變成脂質(zhì)過氧化自由基,其氧化能力很強(qiáng),會(huì)去攻擊周圍的脂肪酸,而后產(chǎn)生新的脂質(zhì)自由基,此為一連鎖循環(huán)反應(yīng),除非有抗氧化劑的存在,可以接受自由基電子,且本身又非常穩(wěn)定,否則此反應(yīng)會(huì)一直連續(xù)下去。脂質(zhì)自由基的抑制效果主要取決于化合物本身是否可供H+,并使脂質(zhì)自由基在此化合物的結(jié)構(gòu)中共振,進(jìn)而使產(chǎn)生的過氧化物穩(wěn)定下來。因?yàn)閂c供H+能力雖然要比烏飯樹葉精提物弱,但因其結(jié)構(gòu)中有一個(gè)羰基(CO)官能團(tuán),可使脂質(zhì)自由基在雙烯醇式羥基上的共振更加穩(wěn)固下來。另外,在抗脂質(zhì)過氧化作用的研究中發(fā)現(xiàn),在所有的黃酮類化合物中具有兒茶素結(jié)構(gòu)的類黃酮活性最低,所以如圖3所示,Vc對脂質(zhì)自由基的抑