五倍子不同組分對致齲菌生長的影響

五倍子不同組分對致齲菌生長的影響

預(yù)防和預(yù)防蟲洞疾病一直是牙科科學(xué)家的重點(diǎn)。在過去的30年里，許多關(guān)于預(yù)防和治療蟲洞疾病的藥物已經(jīng)被廣泛傳播?？股仡惾缜嗝顾?、紅霉素、四環(huán)素及螺旋霉素等,雖具有一定的防齲效果,但長期使用可引起口腔及腸道菌群失調(diào)而導(dǎo)致其他疾病;免疫防齲面臨著增強(qiáng)免疫原性與生物活性的問題,同時對口腔菌群生態(tài)影響的問題仍亟待解決;氟化物防齲是研究最多且廣為認(rèn)可的方法,但其應(yīng)用仍有諸多局限性,如氟濃度的穩(wěn)定性、毒副作用以及口腔耐氟菌株的產(chǎn)生等問題尚未解決。因此,尋找安全而又有效的防齲藥物已成為齲病防治研究的重點(diǎn)。近年來國內(nèi)外許多學(xué)者致力于防齲藥物的研究,有的從化學(xué)與生物制劑中尋求,有的則從天然藥物中分離活性成分。天然藥物包括植物藥、動物藥和礦物藥等,其來源豐富,取材方便,用法簡單,療效顯著且副作用甚微,有著廣泛的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn),五倍子水煎劑對變形鏈球菌的生長產(chǎn)酸有一定的抑制作用;對口腔致齲菌的體外實(shí)驗(yàn)研究也表明,五倍子可抑制變形鏈球菌的產(chǎn)酸、粘附,并可阻止齲病的進(jìn)一步發(fā)展。但是目前的研究都只停留于使用五倍子的粗體物,如水提物、醇提物,劑型粗糙,未能鑒定五倍子的抗齲藥效活性成分,本研究擬采用現(xiàn)代分離方法,對五倍子具體有效成分進(jìn)行研究。1材料和方法1.1倍子總復(fù)合凝膠電泳稱取五倍子粉1000g,以去離子水3000ml60~70℃恒溫水浴10h,振搖,過濾,濾液重復(fù)上述操作,合并兩次濾液,加活性炭50g,60℃攪拌加熱半小時,放置過夜,過濾,濾液濃縮至干即得淡黃色五倍子總鞣質(zhì)(GallaChinensisextract,GCE)約160g。取總鞣質(zhì)5g,使其溶解后通過葡聚糖凝膠SephadexLH_20(凝膠用量200g)。以水∶甲醇系統(tǒng)梯度洗脫,收集各組分,硅膠G薄層板點(diǎn)樣檢查合并各組分(展開系統(tǒng)為氯仿∶甲醇∶甲酸=40∶10∶0.5,磷鉬酸顯色)。按洗脫先后順序先后得到4個組分,五倍子1(GCE1),五倍子2(GCE2),五倍子3(GCE3),五倍子4(GCE4)。經(jīng)過高效液相色譜,光譜分析(1H_NMR,13C_NMR),其中五倍子1及五倍子3分別為沒食子酸及沒食子酸甲酯;而五倍子2、五倍子4含量少,極不穩(wěn)定,在空氣中易變色。1.2其他放線菌actwell-uspc變形鏈球菌StreptococcusmutansATCC25175,血鏈球菌StreptococcussanguisATCC10556,唾液鏈球菌StreptococcussalivariusSS196,內(nèi)氏放線菌ActinomycesnaeslundiiWVU627,粘性放線菌ActinomycesviscosusATCC19246,乳酸桿菌LactobacillusrhamnosusAC413由口腔生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(四川大學(xué))提供。將復(fù)蘇48h的菌種接種于TPY液體培養(yǎng)基,80%N2、20%CO2、37℃下厭氧培養(yǎng)18h,涂片檢查為純培養(yǎng)后將菌液在4℃下3000r/min離心15min,收集細(xì)菌,無菌生理鹽水洗菌2次,并用無菌生理鹽水調(diào)整,使菌懸液540nm處吸光度OD為1.0,備用。1.3菌株生藥量及培養(yǎng)條件使用96孔板法測定藥物對6種細(xì)菌的MIC。將五倍子總鞣質(zhì)及各不同組分按2倍稀釋法溶于含1%葡萄糖的TPY液體培養(yǎng)基中,使其生藥終濃度達(dá)到16000、8000、4000、2000、1000、500、250、125、63mg/L。按配制的菌液與含藥的TPY液體培養(yǎng)基1∶1比例分別接種6種細(xì)菌于96孔板中,80%N2、20%CO2、37℃下厭氧培養(yǎng)48h。以肉眼觀察無細(xì)菌生長的最低藥物濃度為其MIC值。1.4生長曲線的繪制使用活菌計數(shù)法測量五倍子精提物及GCE1,GCE3,GCE1及GCE3混合物(重量比為1∶1)對變形鏈球菌生長的影響。以0.05%洗必泰溶液為陽性對照,以TPY液體培養(yǎng)基為陰性對照。將五倍子精提物及各組分配制成為含有五倍子藥物的TPY液體培養(yǎng)基,濃度為8g/L。將復(fù)蘇48h的菌種接種于TPY液體培養(yǎng)基中,80%N2、20%CO2、37℃下厭氧培養(yǎng)18h,涂片檢查為純培養(yǎng)后使用比濁儀,調(diào)整菌懸液最終濃度達(dá)到5×107cfu/ml,按菌懸液與TPY液體培養(yǎng)基1∶10比例將細(xì)菌接種于含有五倍子藥物的TPY液體培養(yǎng)基中,80%N2、20%CO2、37℃下厭氧培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)5、10、30min,1、2、4、6、18、24h提取菌液,PBS緩沖液梯度稀釋后取5μl菌液接種于TPY固體培養(yǎng)基上,80%N2、20%CO2、37℃下厭氧培養(yǎng)48h后計算活菌菌落計數(shù)(cfu/ml),以活菌數(shù)(lgcfu/ml)為縱坐標(biāo),時間為橫坐標(biāo),作圖繪制生長曲線?；罹嫈?shù)減少99.9%即差異≥3lgcfu/ml者視為有殺菌作用,活菌計數(shù)減少1~3lgcfu/ml者視為有抑菌作用。2結(jié)果2.1倍子3,4對實(shí)驗(yàn)菌株的抑制作用五倍子精提物及各組分對致齲菌生長的MIC值見表1,從表1可以看出,五倍子2,4對實(shí)驗(yàn)菌株的抑制作用較五倍子1,3更強(qiáng),但是與五倍子總鞣質(zhì)抑菌作用相當(dāng)。2.2倍子1+3的抑制作用五倍子提取物對變形鏈球菌生長的影響見圖1,從圖1可以看到五倍子1+3對于細(xì)菌生長的抑制作用最強(qiáng),但是各組對變形鏈球菌生長均有較好的抑制作用,在1h后作用更明顯。而在0.05%洗必泰溶液中細(xì)菌的生長被完全抑制。3倍子及其他各成分對口腔致鉞菌生長的影響研究表明,許多天然藥物都具有較強(qiáng)的防齲作用,如茶多酚等能抑制口腔細(xì)菌的產(chǎn)糖與產(chǎn)酸能力。天然藥物五倍子是一種五倍子蟲刺傷鹽膚木葉子而生成的蟲癭,具有收斂止血的作用。國內(nèi)研究表明五倍子水提物對一些致齲菌的生長、產(chǎn)糖、產(chǎn)酸及對羥磷灰石的粘附有抑制作用,對牙本質(zhì)齲膠原的分解有抑制作用。然而這些研究使用的都是五倍子的粗提物,對五倍子的有效成分的研究尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)通過使用SephadexLH_20葡聚糖凝膠從五倍子鞣質(zhì)中分離得到4個組分,通過測量其最低抑菌濃度發(fā)現(xiàn)他們在抗菌活性上差異不大,其中五倍子1及五倍子3經(jīng)鑒定,分別為沒食子酸及沒食子酸甲酯,并發(fā)現(xiàn)其對口腔致齲菌的生長具有明顯的抑制作用。而五倍子2及五倍子4由于含量少,極不穩(wěn)定,目前無法進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。因此在對變形鏈球菌生長的影響研究中沒有使用五倍子2和五倍子4。五倍子鞣質(zhì)及五倍子1、3組分在6h以內(nèi)對變形鏈球菌都只能起到抑制作用,而沒有明顯的殺菌作用,而洗必泰作為一種口腔科常用消毒劑在很短的時間內(nèi)就殺死了細(xì)菌。提示,使用五倍子作為口腔用藥對細(xì)菌僅僅有抑制其生長增殖的作用,而不會全面殺死細(xì)菌,從而能夠有效維持口腔內(nèi)細(xì)菌的微生態(tài)平衡。據(jù)文獻(xiàn)報道五倍子的主要成分為水解性沒食子鞣酸,因此推測,五倍子2、4的主要成分為沒食子鞣酸。已有很多研究證明,鞣質(zhì)可抑制口腔中變形鏈球菌、粘性放線菌、唾液鏈球菌等多種細(xì)菌的生長,可降低牙菌斑的聚集,抑制葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性,進(jìn)而影響致齲菌生長代謝。研究證實(shí)沒食子鞣酸成分能通過抑制細(xì)菌產(chǎn)生水不溶性胞外多糖的關(guān)鍵酶——葡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性,在菌斑形成的早期能減少粘附細(xì)菌的數(shù)量,也可通過細(xì)菌間的相互聚集而從口腔中清除。五倍子鞣質(zhì)的這些作用可能是它與蛋白質(zhì)結(jié)合而使之沉淀,也就是鞣質(zhì)的收斂性所致。這些結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致,可以推測,五倍子對細(xì)菌的抑制作