細(xì)胞工程動物要點(diǎn)總結(jié)

第十章動物染色體工程動物染色體倍性改造染色體倍性改造工程是指有目的、有計劃地增加或減少一組或幾組同源或異源染色體，以創(chuàng)造動植物新品種的一項(xiàng)染色體工程技術(shù)，主要包括多倍體育種和單倍體育種。染色體加倍技術(shù)1、化學(xué)誘導(dǎo)方法：（1）秋水仙素：秋水仙素能抑制和破壞紡錘絲的形成。因此，用秋水仙素處理正在分裂的細(xì)胞，可使染色體正常復(fù)制而細(xì)胞不發(fā)生分裂，從而形成同源多倍體的細(xì)胞。（2）細(xì)胞松弛素B：通過抑制動物的肌動蛋白聚合成微絲，阻止細(xì)胞質(zhì)的分裂。（3）麻醉劑N2O等。2、 物理誘導(dǎo)法：（1）溫度休克法：包括略低于致死溫度的冷休克法（0?5°C）和略高于致死溫度的熱休克法（30C左右）兩種。溫度休克法廉價、易操作，是誘導(dǎo)動物細(xì)胞多倍體化的常用手段。它受三個因素的制約：溫度處理的開始時間，即受精后的時間（TA）處理持續(xù)時間（D）處理溫度（T）。（2）水靜壓法:采用較高的水靜壓（65kg/cm。）來抑制第二極體的放出或第一次卵裂產(chǎn)生多倍體。（3）高鹽高堿法.3、 生物學(xué)方法生物學(xué)方法主要是通過雜交方法，尤其是種間或不同屬、科間的遠(yuǎn)緣雜交，使染色體加倍，也稱為染色體組的合并技術(shù)。如獅子和老虎雜交，馬和驢雜交。多倍體的倍性鑒定1、直接法：（1）染色體計數(shù)法：染色體計數(shù)是鑒定多倍性的一個準(zhǔn)確的直接方法，但比較費(fèi)時。質(zhì)量好的染色體標(biāo)本可以從胚胎獲得，因?yàn)榕咛ゼ?xì)胞分裂指數(shù)高。（2）DNA含量測定：流式細(xì)胞儀（flowcytomety）可以簡單、快速及準(zhǔn)確測定單細(xì)胞DNA含量，從而確定細(xì)胞的倍性。2、間接法：（1）細(xì)胞體積測量：按照一般規(guī)律，細(xì)胞大小與染色體數(shù)目成比例增加，而且為維持恒定的核質(zhì)比例，隨著細(xì)胞核的增大，細(xì)胞大小也按比例增加。但多倍體的器官或身體并不一定都比二倍體大。紅細(xì)胞體積測量簡便易行。（3）蛋白質(zhì)電泳（3）生化分析：二倍體和三倍體的血液成分和細(xì)胞組成比例不一樣。動物多倍體育種的意義：（1）誘導(dǎo)的多倍體動物多數(shù)都具有良好的生長率（2）低等動物（如魚類等）的種間雜交優(yōu)勢也非常明顯。人工單性生殖：⑴雌核發(fā)育：雌核發(fā)育是指精子雖然能正常地進(jìn)入卵子中并激活卵子，但精子的細(xì)胞核并未參與卵球的發(fā)育，胚胎的發(fā)育僅在母體遺傳物質(zhì)的控制下進(jìn)行。（人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育是用經(jīng)物理化學(xué)方法處理后失活的精子來“受精”，再在適當(dāng)時間施以冷、熱、高壓等物理處理，以抑制第二極體的排出，使卵子發(fā)育為正常的二倍體動物。）（2）雄核發(fā)育雄核發(fā)育是用物理化學(xué)方法處理的卵子與正常的精子受精，再在適當(dāng)時間施以冷、熱或高壓等物理處理，使進(jìn)入卵子內(nèi)的精子染色體加倍，而發(fā)育為完全為父本性狀的二倍體。相比之下，雄核發(fā)育研究比雌核發(fā)育要少得多。動物染色體結(jié)構(gòu)的改造：（1）放射線誘導(dǎo)發(fā)生染色體缺失突變（放射線可以使染色體產(chǎn)生缺失、易位、倒位、復(fù)制及基因內(nèi)的點(diǎn)突變。）（2）Cre2對loxP位點(diǎn)介導(dǎo)的染色體重組：loxP的位置和方向不同，Cre重組酶介導(dǎo)重組形成的產(chǎn)物亦不相同，可以導(dǎo)致染色體的倒位、刪除和易位，實(shí)現(xiàn)染色體的定點(diǎn)操作，克服了用放射線誘導(dǎo)產(chǎn)生的突變不能定位的缺點(diǎn)。人工染色體指人工構(gòu)建的含有天然染色體基本功能單位的載體系統(tǒng)。其中包括3個關(guān)鍵序列：自主復(fù)制DNA序列（ARS）、著絲粒DNA序列（CEN）、端粒DNA序列（TEL）。種類包括酵母人工染色體（YAC）、細(xì)菌人工染色體（BAC）、P1派生人工染色體（PAC）、哺乳動物人工染色體（MAC）和人類游離人工染色體（HAEC）。組織工程：核心是由種子細(xì)胞和生物活性材料構(gòu)成三維空間復(fù)合體?；痉椒ǎ菏紫扔勺泽w或異體組織分離干細(xì)胞，經(jīng)體外擴(kuò)增達(dá)到一定的細(xì)胞數(shù)量后，將這些細(xì)胞作為種子細(xì)胞種植在預(yù)先構(gòu)建好的聚合物骨架上，這種骨架提供了細(xì)胞三維生長的支架，在適宜的生長條件下細(xì)胞沿聚合物骨架遷移、鋪展、生長和分化，最終發(fā)育形成具有特定形態(tài)及功能的工程組織。第九章轉(zhuǎn)基因動物與動物生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)基因動物:指借助基因工程技術(shù)將外源基因?qū)胧荏w動物染色體內(nèi)，外源基因與動物基因整合后隨細(xì)胞的分裂而擴(kuò)增，在體內(nèi)表達(dá)并能穩(wěn)定地遺傳給后代的動物。動物生物反應(yīng)器:動物生物反應(yīng)器是利用轉(zhuǎn)基因活體動物，高效表達(dá)某種外源蛋白的器官或組織，進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)功能蛋白質(zhì)的技術(shù)。（以動物的乳腺為主）制備轉(zhuǎn)基因動物的主要方法有（這個得看書）（1） 基因顯微注射法：基本原理是通過顯微注射儀將外源基因直接注射到受精卵的雄原核內(nèi)，使外源基因整合到DNA中，發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。（2） 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法：將目的基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組上，人為感染著床前或著床后的胚胎，或直接將胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單層細(xì)胞共培養(yǎng)而達(dá)到轉(zhuǎn)染的目的。（3） 胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法：把外源DNA導(dǎo)入體外培養(yǎng)的ES細(xì)胞，經(jīng)篩選后獲得整合穩(wěn)定和表達(dá)好的陽性細(xì)胞，然后將這些細(xì)胞注入受體囊胚腔中，分化成為包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的所有組織細(xì)胞。（4） 精子載體導(dǎo)入法：直接以精子作為外源DNA載體的轉(zhuǎn)基因方法。（5） YAC介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移（6） 細(xì)胞核移植技術(shù)轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用：1）改良動物品種（2）用作乳腺生物反應(yīng)器制備藥物（3）建立診斷和治療人類疾病的動物模型（4）生產(chǎn)可用于人體器官移植的動物器官（5）基因治療，指將外源功能性目的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，通過調(diào)控目的基因表達(dá)，抑制、替代或補(bǔ)償缺陷基因，從而恢復(fù)受累細(xì)胞、組織或器官的生理功能，達(dá)到疾病治療目的。如何生產(chǎn)一頭乳汁含有綠色熒光蛋白的牛？第七章干細(xì)胞與組織工程干細(xì)胞的分類：1）胚胎干細(xì)胞（2）成體干細(xì)胞（3）人工誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞 成體干細(xì)胞（1）胚胎干細(xì)胞包括ES（胚胎干細(xì)胞）細(xì)胞和EG（胚胎生殖細(xì)胞）細(xì)胞。ES細(xì)胞:當(dāng)受精卵分裂發(fā)育至囊胚期，胚胎細(xì)胞在囊胚腔內(nèi)成團(tuán)存在，稱為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。將細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞分離出來進(jìn)行培養(yǎng)，在一定條件下這些細(xì)胞可在體外“無限期”地增殖傳代，同時還保持其全能性。這種干細(xì)胞稱為胚胎干細(xì)胞即ES細(xì)胞。EG細(xì)胞是由原始生殖細(xì)胞培養(yǎng)分離得到。胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性.形態(tài)結(jié)構(gòu)和核型（1） 細(xì)胞體積小、核大、核質(zhì)比高，有一個或多個突出的核仁，細(xì)胞中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)少、結(jié)構(gòu)簡單。（2） 體外培養(yǎng)時，細(xì)胞排列緊密，呈集落狀生長。細(xì)胞克隆和周圍存在明顯界限，形成的克隆細(xì)胞彼此界限不清、形態(tài)多樣，多數(shù)呈島狀或巢狀。ES細(xì)胞具有XX和XY兩種核型。xx的沒有X染色體失活現(xiàn)象。ES細(xì)胞的全能性主要體現(xiàn)在以下幾方面：形成畸胎瘤，將ES細(xì)胞注入同源動物皮下可形成畸胎瘤，包括三個胚層細(xì)胞；形成類胚體，將ES細(xì)胞在非黏附底物中懸浮培養(yǎng)生長，或控制增殖細(xì)胞數(shù)目，能夠使之生成類胚體，是一個與畸胎瘤相似的多種系混雜的集合體，具有三個胚層組織；直系分化，通過控制ES細(xì)胞生長環(huán)境或遺傳操縱特定基因表達(dá)，ES細(xì)胞可直接分化成某特定種系細(xì)胞；形成嵌合體，將ES細(xì)胞注射到同種動物囊胚腔中后，可以形成嵌合體，ES細(xì)胞可以參與嵌合體各個器官包括生殖腺的發(fā)育，這是檢驗(yàn)一個細(xì)胞系是否為ES細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。ES細(xì)胞的鑒定（1） 形態(tài)學(xué)檢測細(xì)胞形態(tài)為圓形或扁圓形，均呈單層或多層密集堆積而形成島狀、巢狀群體生長狀態(tài)。（2） 堿性磷酸酶（AKP）活性的檢測堿性磷酸酶在早期胚胎的干細(xì)胞中含量較高，而在已分化的細(xì)胞中活性明顯降低。用固藍(lán)KR或其B鹽溶于萘酚AS-TR中，染色未分化干細(xì)胞后呈深藍(lán)紫色。（3） 畸胎瘤實(shí)驗(yàn)畸胎瘤實(shí)驗(yàn)是將ES細(xì)胞懸液化注射給同種動物皮下。制作切片染色可觀察到畸胎瘤的形成。（4） 體外分化實(shí)驗(yàn)將ES細(xì)胞懸液培養(yǎng)形成囊狀簡單胚體或類胚體這類細(xì)胞多為自發(fā)分化，隨培養(yǎng)條件和細(xì)胞密度而有所不同。（5） 核型分析法主要是檢測已建立的ES細(xì)胞是否具有二倍體正常的核型，可用核型分析加以檢驗(yàn)。（6） OCT活性檢測OCT基因是小鼠胚胎發(fā)育早期生殖細(xì)胞譜系以及體外培養(yǎng)的多能干細(xì)胞特異性表達(dá)的一種發(fā)育多能性的標(biāo)志基因。用OCT抗血清和間接免疫熒光法可檢測ES和EG細(xì)胞中OCT基因的表達(dá)產(chǎn)物。制備嵌合體動物利用ES細(xì)胞可以獲得具有來自兩個或多個合子體細(xì)胞的個體，即嵌合體，又叫鑲嵌體.精原干細(xì)胞（EG）指位于曲精細(xì)管基膜上既能自我更新維持自身適量恒定，又能定向分化產(chǎn)生精母細(xì)胞的一類原始精原細(xì)胞。（2）成體干細(xì)胞造血干細(xì)胞造血干細(xì)胞是發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的一種成體干細(xì)胞。它是體內(nèi)各種血細(xì)胞的惟一來源，主要存在于成體的骨髓、外周血、臍帶血中。神經(jīng)干細(xì)胞來源：胚胎及成年動物的神經(jīng)組織中分離。腦和脊髓由于血腦屏障的存在使之在干細(xì)胞移植到中樞神經(jīng)系統(tǒng)后不會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。（3）人工誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（IPS）第四章細(xì)胞培養(yǎng)（這章建議和ppt書籍一起學(xué)）培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特征 :（1）體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型（2）培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)（3）培養(yǎng)細(xì)胞的生長與增殖過程（4）培養(yǎng)細(xì)胞的遺傳學(xué)特征（5）體內(nèi)外細(xì)胞的差異及培養(yǎng)細(xì)胞的分化（1）體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型：.貼壁型細(xì)胞貼附是有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本方式，包括細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互接觸和連接和細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互接觸兩種方式，進(jìn)行物質(zhì)和能量的交流。根據(jù)體外培養(yǎng)細(xì)胞在支持物上貼附生長時的形態(tài)，大致分為四種類型。（1）上皮細(xì)胞型 細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中間有胞核，彼此緊密相連，呈單層生長狀態(tài)。（2） 成纖維細(xì)胞型細(xì)胞貼壁后呈梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出2?3個長短不同的突起。起源于中胚層的細(xì)胞，如心肌、平滑肌.（3）游走細(xì)胞型 細(xì)胞質(zhì)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運(yùn)動，貼附于支持物上散在生長，一般不連接成片。多起源于巨噬細(xì)胞。（4） 多形型細(xì)胞生長時像神經(jīng)細(xì)胞那樣呈多角形，并伸出較長的神經(jīng)纖維，很難確定它們的形狀，起源于神經(jīng)細(xì)胞。.懸浮型細(xì)胞某些細(xì)胞在體外培養(yǎng)時不需要貼附在支持物上，而是呈懸浮狀態(tài)生長，如血液中的淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞以及某些腫瘤細(xì)胞等。優(yōu)點(diǎn)：能繁殖大量細(xì)胞，容易進(jìn)行傳代培養(yǎng)。缺點(diǎn)：但在觀察細(xì)胞病變時不如貼壁細(xì)胞方便。（2）培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)1?貼附接觸抑制:這種由細(xì)胞因接觸而抑制細(xì)胞運(yùn)動的現(xiàn)象稱為接觸抑制。.密度抑制：當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。培養(yǎng)細(xì)胞的生長與增殖過程.單個細(xì)胞的生長過程細(xì)胞周期是指一個母細(xì)胞分裂結(jié)束后形成的細(xì)胞至下一次再分裂結(jié)束形成兩個子細(xì)胞的時期，可分為G1期、S期、G2期和M期等各個階段。G1期即DNA合成前期。S期即DNA合成期，主要機(jī)能活動為進(jìn)行DNA的合成。G2期為DNA合成后期，又稱細(xì)胞分裂前期。M期為有絲分裂期，此時每個細(xì)胞分裂成兩個子細(xì)胞。.細(xì)胞系的生長過程細(xì)胞株：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的培養(yǎng)物稱為細(xì)胞株。細(xì)胞系：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功即稱為細(xì)胞系。細(xì)胞系在培養(yǎng)中能夠存活時間的長短，主要取決于細(xì)胞的種類、性狀和原供體的年齡等情況。(1)原代培養(yǎng)期原代培養(yǎng)期也稱初代培養(yǎng)期，指從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代的階段。原代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織相似性大。傳代期原代細(xì)胞生長一定時間之后，如是貼附型細(xì)胞就會連接成片而鋪滿瓶底，這時就需要將原代細(xì)胞分開至多個新的培養(yǎng)瓶中，這個過程叫傳代。(目前世界上常用細(xì)胞系旨在不出10代內(nèi)凍存)衰退期此期細(xì)胞仍生存，但不增殖或增殖很慢，最后衰退死亡。(在細(xì)胞生命期中，少數(shù)可發(fā)生細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化。也就是細(xì)胞獲得永久性增殖能力，成為連續(xù)細(xì)胞系(株)。連續(xù)細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在傳代期。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞可能具有惡性性質(zhì)，也可能僅有不死性而無惡性。)0責(zé)吒攔U 細(xì)康4宇階段 -4———-CEiSMN——I I連續(xù)細(xì)她系原代培養(yǎng)：是指由體內(nèi)取出組織或細(xì)胞進(jìn)行的首次培養(yǎng)，也叫初代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)離體時間短，遺傳性狀和體內(nèi)細(xì)胞相似，適于做細(xì)胞形態(tài)、功能和分化等研究。較為嚴(yán)格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實(shí)際上，通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。最常用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。所謂細(xì)胞“一代”，僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間。每代細(xì)胞的生長曲線傳代培養(yǎng)：細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過程稱之為傳代或者再培養(yǎng)。體外培養(yǎng)的細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞數(shù)量會不斷增加，當(dāng)增長到一定程度后，由于發(fā)生接觸性抑制或培養(yǎng)空間及營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，其生長會逐漸減慢，甚至停止及死亡，所以需要傳代培養(yǎng)。⑴貼壁細(xì)胞的消化法傳代貼壁細(xì)胞一般用胰蛋白酶和EDTA混合液進(jìn)行消化。當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，可立即吸除或倒掉消化液，向瓶內(nèi)注入Hank’s液數(shù)毫升，把殘余消化液沖掉，然后再加培養(yǎng)液，終止消化。貼壁細(xì)胞傳代時應(yīng)注意下述問題：1） 擇適當(dāng)時機(jī)進(jìn)行傳代。若細(xì)胞沒有生長到生長基質(zhì)的80%表面面積以前，不要急于傳代。2） 不同細(xì)胞的傳代要區(qū)別對待。各種細(xì)胞對消化反應(yīng)不同，有的敏感，有的遲鈍，因此應(yīng)根據(jù)所用細(xì)胞特點(diǎn)制定適宜消化措施。3） 消化液濃度要適宜，過濃時消化作用強(qiáng)烈，細(xì)胞反應(yīng)快，所需消化時間短，掌握不好，細(xì)胞易流失。4） 首次傳代的細(xì)胞接種數(shù)量可適當(dāng)多一些，使細(xì)胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利于細(xì)胞生存和增殖。5） 部分貼壁生長細(xì)胞不經(jīng)消化處理直接吹打也可使細(xì)胞從壁上脫落下來，而進(jìn)行傳代。但這種方法僅限于部分貼壁不牢的細(xì)胞（如HeLa細(xì)胞等）。（2）懸浮細(xì)胞傳代因懸浮生長細(xì)胞不貼壁，傳代時不必采用酶消化方法，而可直接傳代或離心收集細(xì)胞后傳代。（4）培養(yǎng)細(xì)胞的遺傳學(xué)特征.染色質(zhì)與染色體改變原代培養(yǎng)細(xì)胞多呈二倍體，經(jīng)傳代成細(xì)胞系后，細(xì)胞可保持二倍體狀態(tài)。但長期傳代的細(xì)胞可能發(fā)生偏離二倍體現(xiàn)象，即染色體數(shù)多于或少于正常數(shù)目。.細(xì)胞性別間期時女性有一個X染色體呈現(xiàn)明顯的固縮狀態(tài)，緊貼在核膜內(nèi)面，稱Barr小體。男性Y染色體在間期時形成顆粒狀Y小體，位于胞核近中央位處。（5）體內(nèi)外細(xì)胞的差異及培養(yǎng)細(xì)胞的分化體內(nèi)細(xì)胞通過不斷的生長繁殖，不僅數(shù)量增加，而且形態(tài)與功能會發(fā)生分化，最后導(dǎo)致各種組織的形成與器官的發(fā)生。當(dāng)將體外培養(yǎng)的細(xì)胞，由于失去了神經(jīng)、激素等體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間相互影響，分化逐漸減弱或不顯，出現(xiàn)類似返祖現(xiàn)象。表現(xiàn)為：【1】細(xì)胞形態(tài)與功能趨于單一化；【2】傳一定代數(shù)后衰老死亡，或發(fā)生轉(zhuǎn)化，成為能無限傳代的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系。細(xì)胞培養(yǎng)液細(xì)胞培養(yǎng)液:培養(yǎng)液是模擬細(xì)胞在體內(nèi)生存的生理環(huán)境，是維護(hù)組織細(xì)胞生存、生長及進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)各項(xiàng)操作過程中所需的基本溶液。維持細(xì)胞在體外生長的液體。平衡鹽溶液：平衡鹽溶（BSS）是從Ringer生理鹽水發(fā)展起來的，是組織細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基本液體。可以維持滲透壓、調(diào)節(jié)pH以及供給細(xì)胞生存所需的能量和無機(jī)離子成分，主要作為合成培養(yǎng)基（液）的基礎(chǔ)液及用于洗滌組織、細(xì)胞等。一般含少量的酚紅，易于觀察到培養(yǎng)液pH的變化。消化液：進(jìn)行原代培養(yǎng)時組織的取材，傳代培養(yǎng)中貼壁細(xì)胞的分離，都要使用消化液。實(shí)質(zhì)為混合酶液。消化酶抑制液:在含血清培養(yǎng)時，血清中的某些成分可中止消化酶對細(xì)胞的作用，所以當(dāng)用消化酶消化后直接加入培養(yǎng)液即可終止消化酶的消化作用。pH調(diào)整液常用的有NaHCO3溶液和HEPES溶液。HEPES是一種弱酸，它對細(xì)胞無毒性作用，是一種氫離子緩沖劑，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動。谷氨酰胺補(bǔ)充液:谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加。但由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，故需現(xiàn)用現(xiàn)配。一般配制為100倍濃縮液.培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基主要指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。優(yōu)點(diǎn)：含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)及各種細(xì)胞生長因子、激素類物質(zhì)，滲透壓、pH等也與體內(nèi)環(huán)境相似缺點(diǎn)：成分復(fù)雜、來源受限、制作過程復(fù)雜、批次間差異大。合成培養(yǎng)基：通過順序加入準(zhǔn)確稱量的高純度化學(xué)試劑與蒸餾水配制而成的，其所含的成分（包括微量元素在內(nèi)）以及他們的量都是確切可知的。合成培養(yǎng)基一般用于實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的營養(yǎng)、代謝、遺傳、鑒定和生物測定等定量要求較高的研究。優(yōu)點(diǎn)：它給細(xì)胞提供了一個近似體內(nèi)生存環(huán)境，又便于控制和標(biāo)準(zhǔn)化的體外生存環(huán)境。合成培養(yǎng)基尚未成為十分完全的培養(yǎng)基。它只能維持細(xì)胞不死，不能促進(jìn)細(xì)胞增殖生長。血清：血清可來自多種動物，目前用于細(xì)胞培養(yǎng)的血清主要牛血清（胎牛血清、新生牛血清、小牛血清）、馬血清、雞血清、兔血清、羊血清以及人血清等。血清的成分：血清對維持體外細(xì)胞的生長具有極為重要的作用。它能提供細(xì)胞生存、生長和增生所必需的激素和生長調(diào)節(jié)因子等物質(zhì)。血清也中含有不少有害于細(xì)胞生長和繁殖的物質(zhì)，例如補(bǔ)體、免疫球蛋白和一些生長抑制因子等。大部分血清在使用之前必須以過滅活處理滅活的目的是去除血清中的補(bǔ)體成分，避免補(bǔ)體對細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。滅活后的血清可在4°C冰箱內(nèi)貯存較長時間，長期保存應(yīng)在-20C以下。（分裝，短時用完）血清的使用濃度一般為5%?20%,最常用的是10%。實(shí)際工作中往往將天然培養(yǎng)基與人工合成培養(yǎng)基結(jié)合使用。常用培養(yǎng)技術(shù)懸滴培養(yǎng)：將培養(yǎng)液滴于蓋玻片上并鋪展開，將待培養(yǎng)的組織或器官植塊放于鋪展開的培養(yǎng)液中央部位，然后將蓋玻片翻轉(zhuǎn)放于凹載玻片上，密封后進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)是活體觀察時可直接使用油浸物鏡，缺點(diǎn)是容易破碎、容易造成污染。培養(yǎng)瓶培養(yǎng)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)就是將擬培養(yǎng)對象直接接種在培養(yǎng)瓶內(nèi)再入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)的方法。旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)*將所培養(yǎng)的組織細(xì)胞接種在稱為旋轉(zhuǎn)管內(nèi)，再將旋轉(zhuǎn)管固定在一可旋轉(zhuǎn)的裝置上，邊旋轉(zhuǎn)進(jìn)培養(yǎng)的一種培養(yǎng)方法。在培養(yǎng)過程中，組織塊或細(xì)胞是交替地與培養(yǎng)液和空氣直接接觸，有利于物質(zhì)交換和細(xì)胞生長?？寺∨囵B(yǎng)法克隆培養(yǎng)法又稱作單細(xì)胞分離培養(yǎng)法，就是將從細(xì)胞懸液中獲得的單個細(xì)胞用于培養(yǎng)，使之重新繁衍成一個新的細(xì)胞群體的培養(yǎng)技術(shù)。飼養(yǎng)層細(xì)胞：是一層經(jīng)過射線照射或絲裂霉素C作用后失去分裂能力，供其他細(xì)胞附著的細(xì)胞層。

第五章細(xì)胞融合與單克隆抗體單克隆抗體：由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體，稱為單克隆抗體。細(xì)胞融合：又稱體細(xì)胞雜交或細(xì)胞雜交，是指在離體條件下用人工方法將不同種生物或同種生物不同類型的單細(xì)胞通過無性方式融合成一個雜合細(xì)胞的技術(shù)。單克隆抗體技術(shù)的原理：B淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生抗體，但在體外不能進(jìn)行無限分裂;而瘤細(xì)胞雖然可以在體外進(jìn)行無限傳代，但不能產(chǎn)生抗體。將這兩種細(xì)胞融合后得到的雜交瘤細(xì)胞具有兩種親本細(xì)胞的特性。HAT選擇原理：HAT培養(yǎng)基根據(jù)細(xì)胞由次黃嘌吟核昔酸(H)和嘧啶核昔酸(T)合成DNA途徑而設(shè)計的。正常細(xì)胞合成DNA有主要途徑和補(bǔ)救途徑。當(dāng)主要途徑被氨基喋吟阻斷時，這兩株細(xì)胞不能增殖。如將這兩株細(xì)胞融合，則只有異核體雜交瘤細(xì)胞能在HAT培養(yǎng)基上存活，因?yàn)閮煞N細(xì)胞相互補(bǔ)充了另一種細(xì)胞缺失的酶；而未融合的細(xì)胞或自身融合的同核體細(xì)胞仍然是而TK-或HGPRT-被淘汰。主要途徑主要途徑是由氨基酸和其他小分子化合物合成核昔酸，進(jìn)而合成DNA的過程。在主要途徑中，葉酸(folicacid)及其衍生物是必不可少的酶。氨基喋吟(aminopterin,A)抑制葉酸。補(bǔ)救途徑利用次黃喋吟和胸腺嘧啶脫氧核昔酸。這些細(xì)胞內(nèi)具有次黃喋吟一一鳥喋吟磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核昔酸激酶(TK)，如缺乏其中一種，補(bǔ)救途徑就不能發(fā)揮作用。DNA合成途彳圣從頭合成逢橋阻斷)阻斷)和TK隨,從頭合成逢橋阻斷)阻斷)和TK隨,DNA人源性單克隆抗體制備1、 人-鼠雜交瘤單克隆抗體（方法同下面實(shí)驗(yàn)）2、 EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)3、 人-人雜交瘤單克隆抗體4、 EBV轉(zhuǎn)化-融合技術(shù)5、 嚴(yán)重免疫缺陷小鼠制備人單克隆抗體如何制備單克隆抗體，實(shí)驗(yàn)過程1、骨髓瘤細(xì)胞選擇（1） 不產(chǎn)生抗體（2） HGPRT-或TK-（篩選HGPRT-細(xì)胞比篩選TK-細(xì)胞要容易）可用8-雜氮鳥嘌吟或6-巰基嘌吟來篩選HGPRT-突變體。2、動物選擇（1）免疫動物的選擇。品系與所采用的骨髓瘤細(xì)胞差異越遠(yuǎn)，產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性越差，在實(shí)際單克隆抗體制備過程中一般采用與骨髓瘤細(xì)胞供體來源同一品系的動物進(jìn)行免疫。（2）抗原與載體抗原分為可溶性抗原和顆粒性抗原?？扇苄钥乖旱鞍踪|(zhì)、核酸、多肽、多糖等。而可溶性抗原免疫時添加適量的佐劑可提高免疫效果?？扇苄钥乖蓪⑵涔潭ㄔ谳d體上而使之成為顆粒性抗原。顆粒性抗原：病毒、細(xì)菌、真菌、細(xì)胞等。一般顆粒性抗原都有較強(qiáng)的抗原性，免疫時可不加佐劑(3)免疫途徑除抗原性狀和動物反應(yīng)外，適當(dāng)?shù)拿庖咄緩綄γ庖咝Ч暮脡耐瑯泳哂兄匾饬x。不同的抗原可經(jīng)不同途徑進(jìn)行免疫，較為常用的途徑有腹腔、皮下淋巴樣器官或靜脈等，但其中最為常用的途徑是腹腔注射。.親本細(xì)胞的準(zhǔn)備脾細(xì)胞分離斷頸處死小鼠，依次用2.5%碘酊和75%酒精進(jìn)行皮膚消毒，打開腹腔，小心取出脾臟，注入0.5ml無血清培養(yǎng)基使脾臟輕度腫脹，用小號針頭多點(diǎn)刺破脾臟被膜，輕輕擠壓使淋巴細(xì)胞逸出。小鼠骨髓瘤細(xì)胞一些品系的小鼠經(jīng)腹腔注射礦物油可誘生出骨髓瘤。4、細(xì)胞融合細(xì)胞融合實(shí)際上包含多個過程：首先是兩個親本細(xì)胞并列，細(xì)胞膜接觸，以后膜組織局部破壞，最終形成包圍融合細(xì)胞的連續(xù)胞膜。融合細(xì)胞表面的特征性變化，有膜成分和胞質(zhì)成分交流以及細(xì)胞內(nèi)電導(dǎo)率的連續(xù)性。(1)細(xì)胞融合劑和融合手段病毒融合劑可用作融合劑的病毒有10幾種，包括DNA病毒中的皰疹病毒、痘病毒、兔痘病毒以及RNA病毒中副黏病毒科的仙臺病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、新城雞瘟病毒、致瘤病毒、日冕病毒等有膜病毒仙臺病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合1、 先將親本細(xì)胞分別制成懸液、混合離心2、 將沉積細(xì)胞懸于1ml滅活的仙臺病毒懸液，置冰浴間歇搖動20分鐘，細(xì)胞凝集3、 溫度升至37°C，間歇搖動30分鐘，使其進(jìn)行融合4、 洗去病毒，即可將融合物懸浮于選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)?；瘜W(xué)融合劑3）電融合技術(shù)將細(xì)胞置于電融合室電介質(zhì)溶液中，對融合室施加交流電場，細(xì)胞在電場力作用下極化產(chǎn)生偶極離子，在電場中沿電力線緊密排列呈串珠狀5.融合細(xì)胞的篩選與克?。?） 融合細(xì)胞的篩選篩選雜交瘤的方法大致有第二抗體法、抗原結(jié)合法和功能篩選法三類。第二抗體法1、 將抗原固定于微量滴定板孔中。2、 再加入含抗體的雜交瘤培養(yǎng)上清。洗去沒有和抗原結(jié)合的抗體。3、 加二抗。結(jié)合于抗原的抗體和被標(biāo)記的第二抗體特異結(jié)合。第二抗體可用熒光素或酶（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等）或同位素標(biāo)記。4、 加反應(yīng)底物。（2） 融合細(xì)胞的克隆常用的細(xì)胞克隆方法主要包括有限稀釋法和軟瓊脂法兩種。1） 有限稀釋法。是指從有陽性抗體分泌孔中收集雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)逐步稀釋使每孔只有一個細(xì)胞。因單細(xì)胞克隆培養(yǎng)時細(xì)胞處于不利于生長的環(huán)境，在培養(yǎng)孔可加入飼養(yǎng)層細(xì)胞以提高克隆效率。2） 軟瓊脂法。則是用含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基配制的含0.5%瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d左右在解剖顯微鏡下觀察和采集克隆，然后轉(zhuǎn)移到已加有飼養(yǎng)層細(xì)胞的胞的96或24孔板中再進(jìn)行培養(yǎng)，并檢測抗體分泌情況。（3）雜交瘤細(xì)胞及其單抗的鑒定1） 染色體鑒定能穩(wěn)定高產(chǎn)分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目較多且較集中。2） 特性鑒定3） 類別鑒定4）單克隆抗體純度鑒定第六早胚胎工程精子的結(jié)構(gòu)精子由頭部、頸部、尾部組成。尾部由中段、主段和末段組成。頭部由細(xì)胞核組成，前端2/3被頂體覆蓋頸部很短，起自近端中心粒，止于遠(yuǎn)端中心粒。尾部軸絲組成，分中段、主段和末段組成。軸絲有9+2型纖維組成。中段是軸絲外面包裹有線粒體鞘，線粒體外面有質(zhì)膜。主段最長，外面由致密的纖維鞘包圍，粗纖維由9條變?yōu)?條，進(jìn)入尾段，7條粗纖維也消失，只有軸絲外面包有質(zhì)膜。細(xì)胞膜_Cellmembranerfv'.sneeith7線粒體鞘細(xì)胞膜_Cellmembranerfv'.sneeith7線粒體鞘中央:做線Centralrrycrotubule頭HeadI頸Neck體BobyOvum卵細(xì)胞城ODlernm?!核Ovum卵細(xì)胞城ODlernm?!核Nui^leUi￡Oopla&m卵子的結(jié)構(gòu)卵母細(xì)胞由細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核組成。細(xì)胞膜外有透明帶包圍，兩者之間的間隙為卵周間隙。透明帶的周圍有卵丘細(xì)胞組成的放射冠。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有卵黃、脂肪滴、線粒體、高爾基復(fù)合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。此外，還有皮質(zhì)顆粒，在受精過程中起重要的作用。透明帶上有ZP1、ZP2、ZP3蛋白，在功能上ZP3是精子的第一受體，ZP2是精子的第二受體，而ZP1只起連接ZP2、ZP3的作用。fA射也Coronanacliiial^選明帶21onapellwcida輸卵管的結(jié)構(gòu)包在系膜內(nèi)，有許多彎曲，長15-30cm，前1/3較粗，稱為壺腹部，是受精的地方，其余部分較細(xì)，是峽部。輸卵管靠近卵巢端擴(kuò)大呈漏斗狀，叫漏斗部，漏斗的邊緣形成許多褶皺，稱為輸卵管傘。受精：精子與卵子融合形成受精卵，這個過程就是受精（fertilization）。受精的基本過程1、精子穿越放射冠當(dāng)精子和卵子接觸時，頂體內(nèi)的透明質(zhì)酸酶溶解卵子放射冠里的透明質(zhì)酸，從而使精子進(jìn)入放射冠。2、 精子穿越透明帶（1） 透明帶上有精子結(jié)合的受體ZP1、ZP2、ZP3。（2） 頂體反應(yīng)的誘導(dǎo)精子的頭部上的受體和卵子細(xì)胞膜上的ZP3結(jié)合后，可觸發(fā)鈣離子進(jìn)入到精子頭部，引起頂體以外排的方式釋放內(nèi)容物，引發(fā)頂體反應(yīng)，釋放各種酶，如頂體酶，溶解透明帶。（3） 精子和透明帶的次極結(jié)合及精子穿越透明帶發(fā)生頂體反應(yīng)后的精子頂體上的ZP3受體丟失，這時，頂體后膜上的ZP2受體和ZP2結(jié)合。從而使精子固定在透明帶上。當(dāng)透明帶被頂體素溶解后，就穿越透明帶到卵周間隙。3、 精子進(jìn)入卵黃囊精子進(jìn)入卵周間隙后，發(fā)生頂體反應(yīng)后的精子立即識別并結(jié)合卵母細(xì)胞膜上的結(jié)合位點(diǎn)，這時卵子別精子激活，隨后啟動精-卵質(zhì)膜融合系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)受精。多精入卵的阻止（1） 大多數(shù)哺乳動物的卵母細(xì)胞質(zhì)里多有圓形、外包介膜的細(xì)胞器-皮質(zhì)顆粒，當(dāng)卵母細(xì)胞成熟后，皮質(zhì)顆粒單層排列在細(xì)胞膜下方，一旦精子和卵子融合后，顆粒內(nèi)的酶釋放到卵周間隙，引起透明帶糖蛋白的變化，透明帶硬化，從而阻止其他精子進(jìn)入。（2） 卵黃膜的變化卵子受精后，卵黃質(zhì)膜也發(fā)生變化，阻止精子進(jìn)入。（3） 皮質(zhì)顆粒膜的形成受精后，皮質(zhì)顆粒內(nèi)容物吐放到卵周間隙中，在受精卵質(zhì)膜的表面形成一層結(jié)構(gòu)，稱為皮質(zhì)顆粒膜。早期胚胎發(fā)育階段劃分：卵裂早期胚胎的有絲分裂，是胚胎向子宮角移行的過程中形成的。在透明帶里進(jìn)行.1、 桑椹胚：此時合子在透明帶內(nèi)進(jìn)行卵裂，呈幾何級數(shù)增加。卵裂球大約增到16?32細(xì)胞期后，細(xì)胞從球形變?yōu)樾ㄐ?，形似桑根狀，稱為桑根胚。這時期的桑根胚及進(jìn)一步發(fā)育的蠢胚一直呈游離狀態(tài)，與母體沒有建立固定的關(guān)系，所以，可以利用這個特點(diǎn)進(jìn)行胚胎移植工作。2、 囊胚：桑根胚繼續(xù)發(fā)育，細(xì)胞開始分化。胚胎的一端，細(xì)胞個體較大，密集成團(tuán)稱為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，將發(fā)育為胚體;另一端，細(xì)胞個體較小，只延透明帶的內(nèi)壁排列擴(kuò)展，這一層細(xì)胞稱為滋養(yǎng)層，將發(fā)育為胎膜和胎盤（工分）。在滋養(yǎng)層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)之間出現(xiàn)靠胚腔，這一發(fā)育階段的胚胎稱囊胚。囊胚初期，細(xì)胞束縛于透明帶內(nèi)，隨后囊胚進(jìn)一步擴(kuò)大，逐漸從透明帶中伸展出來，這一過程叫做”孵化”。此時細(xì)胞特點(diǎn)：滋養(yǎng)層細(xì)胞將來發(fā)育為胎盤和絨毛膜，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞將來分化為內(nèi)胚層，中胚層和外胚層，最終形成胎兒。3、 原腸胚：胚泡進(jìn)一步發(fā)育，滋養(yǎng)層細(xì)胞退化，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)裸露出來成為胚盤。在胚盤的下方｛行生出內(nèi)胚層，它沿著滋養(yǎng)層的內(nèi)壁延伸、擴(kuò)展，襯附在滋養(yǎng)層的內(nèi)壁上，這時的胚胎稱為原腸胚。在內(nèi)胚層的發(fā)生中，除綿羊是由內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離出來外，其它家畜均由滋養(yǎng)層發(fā)育而來。原腸胚進(jìn)一步發(fā)育，原來的滋養(yǎng)層變成外胚層，在外胚層和內(nèi)胚層之間出現(xiàn)中胚層；中胚層進(jìn)一步分化為體壁中胚層和臟壁中胚層，兩個中胚層之間的腔隙，構(gòu)成以后的體腔。三個胚層的建立和形成，為胎膜和胎體各類器官的分化奠定了基礎(chǔ)。高等動物的胚胎發(fā)育包括受精、卵裂、囊胚、原腸胚、中胚層及體腔形成、胚層分化等主要階段。精子的獲能：精子必須在生殖道中停留一段時間后才具備受精能力，這一現(xiàn)象稱為精子的獲能。胚胎基因的激活：哺乳動物發(fā)育到一定階段，胚胎基因組才開始轉(zhuǎn)錄，在胚胎發(fā)育的早期階段是靠卵母細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、RNA或其它物質(zhì)。妊娠識別：.在妊娠初期，孕體發(fā)出信號(類固醇激素或蛋白質(zhì))傳遞給母體作用于母體，母體隨即產(chǎn)生反應(yīng)，以識別孕體的存在。卵泡的劃分：原始卵泡：由一個初級卵母細(xì)胞和一層扁平的卵泡細(xì)胞構(gòu)成，位于卵巢皮質(zhì)的淺層.初級卵泡:初級卵母細(xì)胞已經(jīng)增大，由單層或多層卵泡細(xì)胞構(gòu)成。次級卵泡:卵泡細(xì)胞數(shù)量和層數(shù)增加，卵泡體積增大，在卵泡細(xì)胞間出現(xiàn)卵泡腔。成熟卵泡排卵：隨著卵泡的增大，卵泡逐漸向卵巢表面突出，在膠原酶和透明質(zhì)酸酶的作用下，卵泡破裂，卵細(xì)胞、透明帶和放射冠等隨卵泡液一起由卵巢排出，經(jīng)腹膜腔進(jìn)入輸卵管.(卵子在輸卵管里的運(yùn)行主要靠管壁纖毛擺動和蠕動和液體流動)卵子的激活：哺乳動物和海星受精時，卵內(nèi)自由鈣離子突然釋放，產(chǎn)生鈣離子波。鈣離子波首先在精子入卵處形成，然后以每秒5?10〃m的速度向整個