人體寄生蟲學(xué)實驗指導(dǎo)

PAGE1PAGE70人體寄生蟲學(xué)實驗指導(dǎo)中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室2002年9月目錄實驗室規(guī)則…………1光學(xué)顯微鏡的使用注意事項………2華支睪吸蟲…………4布氏姜片蟲…………7并殖吸蟲……………...8日本血吸蟲…………11帶絳蟲………………20曼氏迭宮絳蟲………21細(xì)粒棘球絳蟲………22似蚓蛔線蟲（蛔蟲）………………..25毛首鞭形線蟲（鞭蟲）……………..27鉤蟲…………………28蠕形住腸線蟲（蟯蟲）……………..30絲蟲…………………33旋毛形線蟲（旋毛蟲）……………..35腸道寄生蟲病原學(xué)檢查……………38溶組織內(nèi)阿米巴和其它阿米巴……41藍(lán)氏賈第鞭毛蟲……………………45陰道毛滴蟲…………46杜氏利什曼原蟲……………………47瘧原蟲………………50機(jī)會性致病原蟲…………………….56蚊……………………61蠅……………………66白蛉、蚤、虱和其它節(jié)肢動物……67實驗室規(guī)則進(jìn)實驗室上課時必須穿白大衣，并攜帶教材、實驗指導(dǎo)、實驗報告本及必要的文具(如鋼筆、鉛筆、彩色鉛筆、小尺等）。實驗前做好預(yù)習(xí)，明確實驗?zāi)康暮鸵?，了解每個實驗的基本原理和具體做法,通過實驗，加深和鞏固已學(xué)過的理論知識，從而達(dá)到理論和實踐相結(jié)合的目的。嚴(yán)格遵守操作程序，愛護(hù)教學(xué)標(biāo)本、儀器、試劑、動物，如有遺失或損壞應(yīng)報告老師，并按學(xué)校規(guī)定進(jìn)行適當(dāng)賠償。實驗操作時要耐心細(xì)致，自己動手，獨立思考，嚴(yán)格要求，培養(yǎng)實事求是的科學(xué)態(tài)度和認(rèn)真負(fù)責(zé)的作風(fēng)。上課要準(zhǔn)時，不得無故缺席、遲到或早退，特殊情況外出或早退應(yīng)向老師請假。遵守課堂紀(jì)律，保持實驗室的安靜，關(guān)閉手機(jī)、呼機(jī)，不得高聲談笑，隨便走動或進(jìn)行與實驗無關(guān)的活動。動物尸體、玻片、器皿、垃圾應(yīng)按要求放到指定地點，嚴(yán)禁丟入水池內(nèi)，以免堵塞排水管。8.值日生應(yīng)負(fù)責(zé)搞好實驗室的清潔衛(wèi)生，離開實驗室前應(yīng)關(guān)好水、電、門窗。

光學(xué)顯微鏡的使用注意事項1.顯微鏡的使用使用自然光源的顯微鏡時應(yīng)面向光源，撥正低倍接物鏡，調(diào)節(jié)反光鏡至最大亮度，將標(biāo)本置載物臺上，根據(jù)檢查標(biāo)本的需要，把光線調(diào)至適宜強(qiáng)度，用粗調(diào)調(diào)至能看清物像后，再用細(xì)調(diào)調(diào)至最清晰。如果要轉(zhuǎn)換高倍觀察，可將待觀察部位移至視野中央，撥轉(zhuǎn)高倍接物鏡即可。若高倍與低倍焦點不一致，則須先摸索好高倍和低倍的位置和焦距的關(guān)系，并牢記二者的關(guān)系，以后便可以自由轉(zhuǎn)換高、低倍鏡。用油鏡時，先進(jìn)行高倍觀察，將待觀察部位移至視野中央，然后用粗調(diào)提高接物鏡，在載玻片上加一滴鏡油，撥轉(zhuǎn)油鏡，眼睛從旁注視，用粗調(diào)向下旋轉(zhuǎn)使物鏡與玻片之間成最小距離，然后用細(xì)調(diào)上下旋轉(zhuǎn)至清晰，或直接用油鏡觀察。如果你使用的是帶電光光源的顯微鏡，請注意，取出顯微鏡后，先將電源插頭插入電源插座，檢查亮度調(diào)節(jié)柄確實在最低處時，方可開啟電源開關(guān)，推動亮度調(diào)節(jié)柄至合適的亮度。觀察完畢，檢查顯微鏡按規(guī)定清潔后，下降鏡臺，推動亮度調(diào)節(jié)柄至最低位置，然后關(guān)電源，拔電源插頭，將顯微鏡放回原處。2.放大倍數(shù)的計算用目鏡的放大倍數(shù)乘以物鏡的放大倍數(shù)，等于該顯微鏡的放大倍數(shù)。例如觀察肺吸蟲蟲卵，目鏡上為10×，低倍物鏡上為10×，那么肺吸蟲卵在低倍鏡下的放大倍數(shù)為10×10＝100倍。高倍鏡上刻有45×，肺吸蟲卵在高倍鏡下的放大倍數(shù)為10×45＝450倍。觀察原蟲標(biāo)本需用油鏡，油鏡上刻有100倍，油鏡下的放大倍數(shù)為10×100＝1000倍。3.觀察標(biāo)本的方法鏡檢時載物臺不可傾斜，以免液體流出影響觀察及污染顯微鏡。觀察標(biāo)本時，每一個視野都要詳細(xì)觀察。為了減少遺漏，可按一定方向推進(jìn)如↓→↑→↓→。如有可疑物像，可放大倍數(shù)觀察。不論放大倍數(shù)如何，光線的強(qiáng)度都要適宜。一般來說，高倍、油鏡和比較厚的標(biāo)本要求較強(qiáng)的光；低倍、無色標(biāo)本光線宜弱。調(diào)節(jié)光線的強(qiáng)弱可通過上下調(diào)節(jié)聚光器或光圈的擴(kuò)大和縮小或調(diào)節(jié)光源的強(qiáng)弱來控制。4.顯微鏡的維護(hù)顯微鏡是比較貴重的儀器，也是學(xué)習(xí)的重要工具之一，維護(hù)好它十分重要。提取顯微鏡時，一手持柄，一手托住底座，保持鏡身的垂直，防止反光鏡和目鏡脫落。顯微鏡的部件不得互相調(diào)換，如有損壞，立即向老師報告。檢查糞便標(biāo)本時，如要用高倍觀察，必須加上蓋玻片，防止糞水污染鏡頭，如不小心污染，應(yīng)立即擦干凈。用高倍鏡或油鏡觀察時，宜使用微調(diào)，并小心轉(zhuǎn)動，避免壓碎損壞鏡頭和標(biāo)本。每次使用顯微鏡后都要擦拭干凈，鏡臺鏡座用軟布擦去污物和灰塵。擦鏡頭必須用擦鏡紙，不能用草紙或紗布等。油鏡使用后，應(yīng)立刻用擦鏡紙擦干凈鏡頭上的油，然后用擦鏡紙沾少許二甲苯拭抹鏡頭，最后用擦鏡紙擦干殘余的二甲苯。若油已干，可沾少許二甲苯擦凈，再用擦鏡紙擦干。如鏡頭沾上較頑固的污物也用同樣的方法拭抹。收鏡時將鏡頭旋在一側(cè)，將聚光鏡旋落，避免兩鏡頭相撞。把亮度調(diào)節(jié)柄推至最低位置，把光源調(diào)至最小，關(guān)上電源。最后加上鏡罩（或置鏡箱內(nèi)）放回原處。

吸蟲(trematode)一、華支睪吸蟲（Clonorchissinensis）目的和要求以華支睪吸蟲為代表，掌握吸蟲基本形態(tài)和生活史的基本特點。了解感染途徑、感染方式、寄生部位與致病作用及防治要點。掌握蟲卵形態(tài)特征和病原學(xué)診斷方法。學(xué)習(xí)繪制蟲卵形態(tài)圖的基本技能。實驗內(nèi)容成蟲觀察液浸標(biāo)本（示教）：注意蟲體大小、外觀。觀察染色標(biāo)本（操作）：先用肉眼作一般觀察，然后在低倍鏡下觀察下列器官的位置、排列方式和形態(tài)特征：附著器官：口吸盤、腹吸盤，并比較兩者的大小。消化器官：腸支分兩支，末端是盲端。排泄器官：排泄囊和排泄孔。生殖器官：雌雄同體。雄性生殖器官：睪丸的數(shù)目、形態(tài)、位置、排列方式等。雌性生殖器官：卵巢、受精囊、卵黃腺、梅氏腺、子宮（其內(nèi)充滿蟲卵）等。（二）中間宿主和幼蟲（示教）第一中間宿主：紋沼螺、長角涵螺。觀察尾蚴染色標(biāo)本。第二中間宿主：淡水魚（鯉科魚）、淡水蝦。囊蚴形態(tài)特點：橢圓形，平均大小為0.138mm×0.115mm，囊壁兩層，內(nèi)含幼蟲，可見口、腹吸盤及含有黑色顆粒的排泄囊。蟲卵(1)蟲卵形態(tài)（固定標(biāo)本）（操作）從大小、形態(tài)、顏色、卵殼結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物等五個方面詳細(xì)觀察。蟲卵很小，平均為27~35μm×12～20μm，形似舊式燈泡或芝麻狀，黃褐色，頂端有突起的卵蓋，卵蓋和卵殼鑲嵌處稍向外突起形成肩峰，另一端有一小疣，卵內(nèi)有一毛蚴。蟲卵掃描電鏡照片（示教）。病理標(biāo)本1.成蟲在肝膽道內(nèi)的大體標(biāo)本（示教）。2.成蟲在肝膽道內(nèi)的病理組織切片（示教）。膽道內(nèi)可見華支睪吸蟲成蟲橫切面，大量蟲卵散布在子宮腔內(nèi)，膽管上皮細(xì)胞增生，呈乳頭狀突向管腔，膽管周圍纖維組織增生，壓迫肝實質(zhì)。作業(yè)繪作業(yè)：繪蟲卵形態(tài)圖。用鉛筆描繪，以點和線構(gòu)成輪廓圖，線條要平滑，不涂陰影，不涂彩色，注意用鉛筆描形態(tài)和大小的比例，繪出特征，力求真實準(zhǔn)確。2.標(biāo)注成蟲形態(tài)圖（用平行線標(biāo)注各部位的名稱）。3.用簡圖（如箭頭）描述華支睪吸蟲的生活史過程。（概述該蟲的終宿主、保蟲宿主、成蟲寄生部位及其主要損害器官，蟲卵排出途徑和病原學(xué)診斷方法，第一、第二中間宿主及其幼蟲在宿主體內(nèi)的發(fā)育過程，感染期、感染方式和途徑等。）思考：食入未煮熟的淡水魚可能會感染什么寄生蟲?。繀⒖假Y料受精過程和蟲卵形成：精子產(chǎn)生后，經(jīng)雄性生殖孔進(jìn)入雌性生殖孔內(nèi)，到達(dá)受精囊。受精通常在輸卵管內(nèi)進(jìn)行。受精卵進(jìn)入卵模，來自卵黃腺的卵黃細(xì)胞亦隨之而入，同時也有來自梅氏腺和卵黃球分泌的卵殼前體物進(jìn)入卵模。當(dāng)輸卵管末端收縮時卵模成關(guān)閉狀態(tài)，隨后卵模收縮形成卵殼的特殊形狀。卵殼形成時先從中間部分開始、末端部分跟著出現(xiàn)，最后配上卵蓋。吸蟲亦可進(jìn)行異體受精：即一方的精子經(jīng)生殖孔或勞氏管（退化的陰道）進(jìn)入另一方體內(nèi)。2.華支睪吸蟲第二中間宿主淡水魚調(diào)查在魚塘、水溝內(nèi)捕捉或市場等處購買各種淡水魚，經(jīng)種屬鑒定后，取魚肌肉等不同組織，切成小塊置玻片下壓片檢查囊蚴。3.華支睪吸蟲囊蚴分離法將華支睪吸蟲第二中間宿主——淡水魚置攪肉機(jī)內(nèi)攪碎（亦可用手工剁碎）。每10克魚肉用250毫升消化液（配方：胃蛋白酶9.8克，1N鹽酸164毫升，氯化鈉17克，加水至2000毫升）消化4～12小時，用銅篩過濾去掉粗渣，濾液經(jīng)反復(fù)多次生理鹽水換水沉淀，最后吸取沉淀物置培養(yǎng)皿內(nèi)在雙目鏡下檢查囊蚴。4.動物感染方法將分離出的形態(tài)不同的各種囊蚴按號分別置于培養(yǎng)皿內(nèi)，取實驗動物豚鼠或家兔，用吸管吸取50或200個囊蚴分別經(jīng)食道喂給豚鼠或家兔，標(biāo)記實驗動物，同等條件下飼養(yǎng)，40天后麻醉致死，剖開腹腔，取出肝膽器官，沿膽總管至膽囊剪開，尋找成蟲，然后檢查肝內(nèi)的小膽管，把組織剪成數(shù)塊，向剪開處輕輕擠壓，把成蟲擠出。見有成蟲即取出置盛有生理鹽水的器皿中進(jìn)行觀察鑒定，必要時可染色鑒別。二、布氏姜片蟲（Fasciolopsisbuski）目的和要求了解成蟲的基本形態(tài)和生活史的基本特點。從成蟲的體積和腹吸盤的大小理解其機(jī)械致病作用。掌握蟲卵特征和病原學(xué)診斷方法。熟識植物媒介，掌握防治要點。實驗內(nèi)容成蟲成蟲液浸標(biāo)本（示教）成蟲染色標(biāo)本（操作）注意蟲體大小，背腹扁平肥厚，腹吸盤較口吸盤大4～5倍，肌肉相當(dāng)發(fā)達(dá)。（二）中間宿主、幼蟲和媒介（示教）中間宿主：扁卷螺尾蚴染色標(biāo)本囊蚴染色標(biāo)本媒介：菱角、荸薺（馬蹄）等。（三）蟲卵蟲卵形態(tài)（操作）蟲卵大小約130~140μm×80~85μm，橢圓形，淡黃色，卵殼薄，卵蓋?。ú幻黠@），卵內(nèi)含一個卵細(xì)胞和數(shù)十個卵黃細(xì)胞。蟲卵掃描電鏡照片（示教）（四）作業(yè)：1.繪蟲卵形態(tài)圖。2.標(biāo)注成蟲形態(tài)圖三、并殖吸蟲(Paragonimus)目的和要求了解衛(wèi)氏并殖吸蟲的形態(tài)特征和生活史。了解并殖吸蟲寄生部位和主要致病作用。掌握衛(wèi)氏并殖吸蟲蟲卵的形態(tài)特征和病原學(xué)診斷方法。實驗內(nèi)容衛(wèi)氏并殖吸蟲（Paragonimuswestermani）1.成蟲(1)成蟲液浸標(biāo)本（示教）(2)成蟲染色標(biāo)本（操作）①外部形態(tài)②口、腹吸盤③生殖器官：兩個睪丸位于蟲體后1/3，左右并列，卵巢與子宮并列于腹吸盤之后。(3)成蟲皮棘掃描電鏡照片（示教）2.幼蟲和中間宿主(1)第一中間宿主：川卷螺（示教）(2)尾蚴染色標(biāo)本：尾部短小，呈圓球狀。（示教）(3)第二中間宿主：溪蟹、蟲刺蛄（示教）3.蟲卵(1)蟲卵形態(tài)：（操作）蟲卵呈金黃色，長橢圓形，形態(tài)常不規(guī)則，大小為80~118μm×48~60μm。卵殼厚薄不均，卵蓋大，常傾斜，卵內(nèi)含有一個未分裂的受精卵細(xì)胞和十多個卵黃細(xì)胞。(2)蟲卵掃描電鏡照片（示教）4.病理標(biāo)本(1)肺吸蟲病肺臟病理標(biāo)本：注意結(jié)節(jié)狀或半球狀突出的蟲囊（示教）。(2)肺吸蟲病肝臟病理標(biāo)本：注意肝臟表面的窟穴狀或隧道狀病變（示教）。思考：肝、肺兩器官損害的結(jié)果和損害機(jī)理有何不同？斯氏貍殖吸蟲(Pagumogonimusskrjabini)1.成蟲液浸標(biāo)本（示教）2.成蟲染色標(biāo)本（示教）3.第一中間宿主：擬釘螺（示教）作業(yè)(1)標(biāo)注衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲形態(tài)圖。(2)繪衛(wèi)氏并殖吸蟲蟲卵圖。(3)用簡圖(如箭頭)描述衛(wèi)氏并殖吸蟲的生活史過程。思考：怎樣理解一些山區(qū)森林地帶肺吸蟲病是自然疫源性疾??？肺吸蟲病的流行區(qū)有何特點？參考資料1.痰液蟲卵檢查法涂片法：取一潔凈玻片，滴一滴生理鹽水，挑取帶鐵銹色的痰液少許，在玻片上涂均勻，加蓋玻片，置鏡下檢查。蟲卵濃集法：收集病人24小時的痰液，將痰液傾入量杯內(nèi)，加入等量的10％NaOH溶液，搖勻，靜置6～8小時，自然沉淀或離心沉淀后，傾去上清液，取沉渣鏡檢。2.肺吸蟲流行病學(xué)的生物宿主調(diào)查選擇一條或數(shù)條溝渠，在溝渠內(nèi)捕捉川卷螺（或擬釘螺）和溪蟹或蟲刺蛄。（1）將川卷螺擊破后把螺內(nèi)臟置玻片上，撕碎加適量0.45%鹽水，置鏡下尋找胞蚴、雷蚴和尾蚴。（2）解剖溪蟹或蟲刺蛄，找囊蚴。3.囊蚴分離取溪蟹一只，去殼后用研缽磨碎，加入適量的0.45%鹽水，用鋼篩濾去粗渣，濾液自然沉淀，傾去上清液（換水2～3次，至上清液澄清為止），吸取沉渣于培養(yǎng)皿內(nèi)置雙目鏡下檢查囊蚴。囊蚴呈白色圓球形，囊壁兩層，內(nèi)含一條卷縮的幼蟲，兩側(cè)可見波浪狀的腸管，排泄囊含黑色顆粒。4.動物感染實驗從溪蟹分離出并殖吸蟲囊蚴，用肉類將囊蚴包裹后，喂犬。視實驗犬的大小而定，每只喂100～200個囊蚴。飼養(yǎng)2～3個月后將實驗犬麻醉致死，剖開胸腔暴露肺臟,可見肺表面有結(jié)節(jié)狀或球狀蟲囊，剪開蟲囊找出蟲體。5.脫囊試驗把活囊蚴置于盛有貓膽汁的培養(yǎng)皿內(nèi)，在37oC溫箱內(nèi)孵育1~2小時，取出鏡下觀察后尾蚴。四、日本血吸蟲(Schistosomajaponicum）目的和要求了解毛蚴、尾蚴及成蟲的形態(tài)和生活史特點。通過動物實驗了解血吸蟲的感染期、感染途徑和致病作用。掌握蟲卵形態(tài)特征和病原學(xué)診斷方法。了解免疫學(xué)診斷方法和意義。實驗內(nèi)容成蟲成蟲活體標(biāo)本（示教）成蟲雌雄合抱標(biāo)本（示教）成蟲染色標(biāo)本（操作）注意以下幾點：雌雄成蟲的大小、形態(tài)?？?、腹吸盤，腹吸盤突出。生殖器官：雌雄異體。雄性生殖器官：睪丸數(shù)目、形態(tài)、位置和排列方式。雌性生殖器官：卵巢、子宮（注意子宮內(nèi)有蟲卵）、卵黃腺。成蟲前端掃描電鏡照片（示教）幼蟲和中間宿主1.毛蚴毛蚴掃描電鏡照片（示教）2.中間宿主：釘螺（示教）3.尾蚴尾蚴染色標(biāo)本：注意尾部分叉（示教）。觀察活尾蚴（示教）。靜止時尾蚴體部懸掛在水面，活動時體部伸縮，尾干作反復(fù)弧形擺動，尾叉作旋漿式轉(zhuǎn)動，使身體向前推進(jìn)。蟲卵1.日本血吸蟲蟲卵形態(tài)：（操作）蟲卵呈寬橢圓形，大小89μm×67μm，淡黃色，卵殼薄而均勻，無卵蓋，有一小側(cè)棘。通常從糞便中排出的蟲卵，其卵殼周圍常有污物粘附。成熟蟲卵內(nèi)含有毛蚴。2.日本血吸蟲蟲卵掃描電鏡照片（示教）。3.曼氏血吸蟲(S.mansoni)蟲卵：長橢圓形，有粗大側(cè)棘。（示教）4.埃及血吸蟲(S.haematobium)蟲卵：長橢圓形，有端棘。（示教）致病作用1.病理標(biāo)本血吸蟲病肝硬化病理標(biāo)本：肝表面有許多灰白色芝麻大小散在性分布的結(jié)節(jié)，切面在靜脈周圍有灰白色樹狀纖維索。（示教）(2)血吸蟲病肝組織切片。急性蟲卵結(jié)節(jié)：蟲卵周圍有大量的嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤及以蟲卵為中心向四周發(fā)出的放射狀嗜酸性細(xì)棒狀物質(zhì)沉積。（示教）慢性蟲卵結(jié)節(jié)：蟲卵已死亡或鈣化，蟲卵周圍可見到上皮樣細(xì)胞，異物巨細(xì)胞聚集和纖維細(xì)胞增生等。（示教）(3)血吸蟲成蟲寄生在腸系膜的病理標(biāo)本2.解剖實驗動物（家兔）（小班操作）將感染血吸蟲尾蚴50天左右的家兔處死，剖開腹腔后注意觀察記錄下列內(nèi)容：①有無腹水？②肝臟有何變化？腸壁有何變化？在何處找到血吸蟲成蟲？是否有異位損害現(xiàn)象？腸組織壓片法檢查：取米粒大小的直腸粘膜組織，置玻片上，取另一玻片壓片檢查，可見蟲卵如何排列，并見到什么時期的蟲卵？實驗診斷方法1.病原學(xué)檢查糞便直接涂片法、毛蚴孵化法、透明法、直腸活組織檢查等，見教材P1432.免疫診斷法環(huán)卵沉淀試驗：(示教)實驗方法參照教材P143判斷標(biāo)準(zhǔn)：－：蟲卵周圍沉淀物的直徑小于10μm。＋：蟲卵周圍的泡狀沉淀物直徑大于10μm，累計面積小于蟲卵面積的1/2，或指狀細(xì)長卷沉淀物不超過蟲卵的長徑。＋＋：蟲卵周圍的沉淀物面積大于蟲卵面積的1/2，指狀沉淀物相當(dāng)于或超過蟲卵的長徑。＋＋＋：沉淀物的面積大于蟲卵的面積，指狀沉淀物相當(dāng)于或超過蟲卵長徑的二倍。(2)快速ELISA法（小組操作）實驗原理：酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linkedImmunologysorbentAssay,ELISA)已廣泛用于多種寄生蟲感染的檢測，F(xiàn)AST-ELISA是在ELISA的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種快速檢測方法，它是用已知日本血吸蟲可溶性抗原包被在特制的聚苯乙烯反應(yīng)板孔內(nèi)，將待測血清加到反應(yīng)孔內(nèi)，如血清中含有相應(yīng)的特異性抗體，即可形成抗原抗體復(fù)合物。此時，如在反應(yīng)孔內(nèi)加入酶標(biāo)記羊抗人IgG，再通過底物的顯色反應(yīng)即可判斷實驗結(jié)果。特點：靈敏、快速、準(zhǔn)確、簡便。試劑盒內(nèi)試劑名稱：①號液：酶結(jié)合物②號液：洗滌液③號液：底物溶液④號液：顯色劑⑤號液：血清稀釋液⑥號液：終止液檢測程序：樣本稀釋：8滴蒸餾水中加1滴待測血清及1滴血清稀釋液，混勻。對照陰、陽性血清作同樣稀釋。（此步已做）加樣：分別加稀釋的待測血清和參考陰陽性血清各1滴于反應(yīng)板孔中，室溫放置3～5分鐘。拋盡后加1滴②號液，立即用自來水沖洗3次，拋盡，在吸水紙上拍干。反應(yīng):加①號液1滴，置室溫3～5分鐘，拋盡，加②號液1滴，立即用自來水洗5次，拋盡，在吸水紙上拍干。顯色：加③號液和④號液各1滴于孔中，室溫靜置30秒～3分鐘（待陽性對照顯色而陰性對照未顯色為準(zhǔn)）后，加⑥號液1滴觀察結(jié)果。(5)結(jié)果判斷：在白色背景下觀察藍(lán)色的深淺－：淺于陰性或與陰性對照一致；＋：深于陰性對照，淺于陽性對照；＋＋：與陽性對照相近；＋＋＋～＋＋＋＋：明顯深于陽性對照。注意事項：①試劑置2～8℃保存，用前輕輕搖勻；②嚴(yán)格按檢測程序操作，所有試劑應(yīng)加入孔中，避免粘在壁上，加樣后輕輕搖勻；③自來水沖時，水流不能過猛，每次拋干后，在吸水紙上輕輕拍干；④室溫低于15℃時，顯色時間應(yīng)適當(dāng)延長，以陽性對照出現(xiàn)明顯藍(lán)色而陰性對照孔基本無色為準(zhǔn)。流行病學(xué)（示教）晚期血吸蟲病人照片。血吸蟲病流行區(qū)照片。滅螺方法照片。作業(yè)標(biāo)注成蟲基本形態(tài)圖。繪蟲卵形態(tài)圖。寫出解剖動物（兔）實驗報告。寫出快速ELISA法檢測日本血吸蟲感染實驗報告。思考：根據(jù)動物感染結(jié)果，理解日本血吸蟲對宿主可造成什么損害？(2)從生活史過程比較日本血吸蟲與其它吸蟲的感染方式和感染途徑有何不同？(3)日本血吸蟲的防治措施與其它吸蟲比較有何不同？為什么？參考資料

1.組織內(nèi)各期血吸蟲卵的性狀：由于蟲卵發(fā)育的程度和蟲卵死亡時間的不同，沉積在腸粘膜和其他組織內(nèi)的蟲卵可有不同性狀。通?？煞譃榛盥眩谧冃月押退缆?。

活卵：淡黃色，毛蚴輪廓清楚，殼薄、胚胎清楚。近期變性卵：黃色帶灰白或黃褐色，毛蚴萎縮成塊狀，殼稍厚但均勻，胚膜尚清楚。死卵：灰白色至黑色，內(nèi)容物模糊或成塊狀裂開、殼厚而不平整，甚或破裂。2.蟲卵分離方法：以1500～2000條日本血吸蟲尾蚴感染家兔。感染后42天將家兔處死，取出肝臟，沖洗。除去成蟲，把肝臟剪成小塊，除去結(jié)締組織，血管等。放入組織搗碎機(jī)內(nèi)，加l～2％鹽水，用12，000轉(zhuǎn)／分的速度搗碎，每次3分鐘，間歇5分鐘，通常搗碎3～4次即可。將搗碎的肝組織懸液加1000毫升1％鹽水調(diào)勻，用80、120目的銅篩過濾，去渣將濾液分別盛裝在尖底離心管內(nèi)，1500轉(zhuǎn)／分離心3分鐘。此時管內(nèi)分三層，上層是清液，中層為肝組織碎片，下層為金黃色的蟲卵和肝組織的混合物。吸去中、上層。將各管底層沉淀物加鹽水制成懸液，然后合并，如此反復(fù)離心沉淀，除去中上層，最后獲得較純凈的蟲卵。3.熒光顯微技術(shù)在寄生蟲學(xué)方面的應(yīng)用幾乎所有寄生蟲(包括原蟲、蠕蟲等)都可用熒光顯微技術(shù)進(jìn)行研究。例如：抗原抗體反應(yīng)在組織和細(xì)胞的定位研究，追蹤寄生蟲在人體的轉(zhuǎn)移過程，形態(tài)變化和寄生蟲病發(fā)病機(jī)理等。還可利用熒光抗體的免疫學(xué)特性研究抗體對寄生蟲蟲體作用部位及宿主抵抗寄生蟲侵襲的免疫反應(yīng)機(jī)制等。免疫熒光法可檢出特異性抗體或抗原。此法敏感性高，特異性同其他血清學(xué)方法類似?，F(xiàn)在較常用于血吸蟲病，絲蟲病和瘧疾的研究和診斷。4.死卵與活卵的染色鑒別法：吖啶橙染色法原理：用吖啶橙處理后的生物標(biāo)本，在熒光顯微鏡下含DNA的成份發(fā)出綠色熒光，含RNA的成份發(fā)出紅色熒光。因此，血吸蟲卵經(jīng)吖啶橙處理后，初產(chǎn)期蟲卵和空泡期蟲卵因含豐富的RNA，故卵內(nèi)呈現(xiàn)粗細(xì)不等的紅色熒光亮點。以后蟲胚逐漸發(fā)育DNA迅速增加，分布在蟲胚四周,形成黃綠色熒光的胚團(tuán)。蟲卵內(nèi)毛蚴發(fā)育成熟后，含豐富RNA的頭腺發(fā)出明亮的橙紅色熒光，而生殖細(xì)胞和神經(jīng)中樞發(fā)綠色熒光,整個蟲卵呈紅綠相嵌的熒光色彩。蟲卵死亡后，核酸逐漸分解，橙紅色或綠色的特異熒光也相繼消失。方法：將帶有血吸蟲卵的腸粘膜(或其它組織)碎片置康氏管內(nèi)，加入0.5～1.0毫升1：10，000吖啶橙溶液，搖蕩，置37℃溫箱內(nèi)染色2小時，用PH7.4PBS洗滌兩次。將組織碎片置載玻片上，覆以蓋玻片，在熒光顯微鏡下檢查。結(jié)果：活卵呈橙紅色或紅綠相嵌的熒光。死卵無橙紅色熒光亮點，或因吖啶橙不著色而使蟲卵呈黃色自發(fā)熒光。5.毛蚴孵化法原理：成熟蟲卵在適宜條件下，24h~48h可孵出毛蚴，且毛蚴具有向光性，向上性，多在水面表層作直線運動。方法：取新鮮受檢糞便約30g，先經(jīng)濃集法沉淀處理，將得到的沉渣倒入500ml的三角燒瓶中，加清水（自來水要去氯）至瓶口，在20~30℃條件下孵化12h~48h，用肉眼或放大鏡觀察結(jié)果。毛蚴：雙目鏡下觀察，體表披棘毛，前端突出。主要根據(jù)以下特征辨認(rèn)：⑴針尖大小，長圓形，大小一致。⑵半透明，灰白色，有折光。⑶作直線的斜向或橫向運動。⑷一般在水面下1~4cm處。6.間接免疫熒光實驗(IFA)間接免疫熒光實驗是敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡便、所需反應(yīng)物(抗原、抗體)量少的一種免疫學(xué)實驗。lFA系將已知抗原(組織切片)固定在玻片上,將待測抗體滴加到玻片上，如血清含有相應(yīng)抗體,即可在特定部位與抗原起反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物,此種復(fù)合物再與熒光色素標(biāo)記的抗體反應(yīng),形成帶熒光的抗原抗體第二抗體的第二復(fù)合物,在熒光光源激發(fā)下,特異復(fù)合物呈現(xiàn)特異熒光。如待測血清無特異抗體,則不形成特異復(fù)合物而不顯熒光；如抗體特異性不同,則形成特異復(fù)合物的位置不同,特異熒光可在組織切片不同部位顯示出來。此法可用于診斷或抗原定位。材料:抗原：感染日本血吸蟲尾蚴約50天的家兔，解剖后取出肝臟及門脈系統(tǒng)中的血吸蟲蟲體，洗凈后置Rossman’液中過夜，取出,在75％乙醇中洗去殘存Rossman’s液并在75％乙醇中貯存。按常規(guī)制成5微米切片，脫蠟后備用。②第一抗體：感染日本血吸蟲的家兔血清。

③第二抗體：異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗兔IgG。

④對比染色液：溶解10mg伊文思藍(lán)于10ml磷酸鹽緩沖液中，置冰箱待用。

⑤緩沖液：0．05MpH7.8磷酸鹽緩沖液(PBS)。⑥正常家兔血清：用作對照。反應(yīng)步驟:用油性筆在玻片上組織切片周圍劃一小圈，加10μl第一抗體于切片上，置濕盒中在37℃溫箱下反應(yīng)30分鐘。另一組織切片滴加正常家兔血清做對照。用0.05MpH7.8PBS輕輕徹底洗去第一抗體(注意切勿用力沖洗以免切片脫落)，玻片自然干燥。預(yù)先用伊文思藍(lán)液及PBS稀釋第二抗體至工作濃度，使第二抗體工作液的伊文思藍(lán)最終濃度為2／10，000。加10μl于切片上，置濕盒中37℃反應(yīng)30分鐘。④用PBS徹底洗去第二抗體，玻片自然干燥。⑤用0.lMpH7.8PBSlml加甘油9ml制成緩沖甘油液。加一滴于切片上，加蓋玻片。(注意勿使切片上殘留小氣泡，否則會影響觀察)。⑥置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。(用通過BG12十BG38濾光片產(chǎn)生的紫藍(lán)光作激發(fā)光)。結(jié)果：在紫藍(lán)光的激發(fā)下，經(jīng)熒光素標(biāo)記第二抗體所形成的特異復(fù)合物的部位顯現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，不形成特異復(fù)合物的部位因伊文思藍(lán)著色的關(guān)系，呈現(xiàn)暗紅色熒光。依特異熒光的強(qiáng)弱及出現(xiàn)部位的不同，可對抗原的特異性和定位做出估計。與陽性血清起反應(yīng)的抗原按感染進(jìn)程出現(xiàn)的先后順序依次為腸相關(guān)抗原(GAA)、膜相關(guān)抗原(MAA)、蟲卵可溶性抗原(SEA)及體抗原(SA)。GAA:屬診斷性抗原，定位于血吸蟲成蟲的腸上皮組織，有時在腸內(nèi)容物中亦可見到。呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。在感染過程中最早出現(xiàn)(尾蚴感染后約4～5周)，最遲消退。MAA：主要為保護(hù)性抗原，定位于成蟲表膜，在感染尾蚴后約5～6周出現(xiàn)，熒光較弱，反應(yīng)不夠穩(wěn)定。MAA在誘發(fā)血吸蟲保護(hù)性免疫中具有重要作用。SEA：屬診斷性抗原，定位于成熟蟲卵的毛蚴、卵黃膜、卵內(nèi)分泌物及蟲卵結(jié)節(jié)環(huán)繞蟲卵的部位，有時亦可見于宿主肝竇的星狀細(xì)胞中，于尾蚴感染后的第6周出現(xiàn)，在卵內(nèi)毛蚴(特別是頭腺)及毛蚴周圍出現(xiàn)明亮熒光。在急性蟲卵結(jié)節(jié)內(nèi)蟲卵的周圍呈現(xiàn)霧狀光點，反應(yīng)穩(wěn)定。SA：定位于成蟲的間質(zhì)組織，在尾蚴感染后約第7周出現(xiàn)，呈大小不等亮度中等的點狀熒光，顯示蟲體組織代謝物，是蟲體抗原的重要來源。7.血吸蟲病診斷方法(1)以鏡檢為基礎(chǔ)的血吸蟲蟲卵檢測。(2)免疫學(xué)診斷概況：①純化抗原、重組抗原、合成抗原等新一代診斷抗原的應(yīng)用使循環(huán)抗體（CAb）檢測的診斷效能大為改觀；②單克隆抗體（McAb）在檢測循環(huán)抗原（CAg）中的應(yīng)用已較為普遍；③循環(huán)免疫復(fù)合物（CIC）檢測已取得一定進(jìn)展，可望成為血吸蟲病尤其是晚期血吸蟲病患者有效和可取的診斷方法。日本血吸蟲感染，早期（10wk內(nèi)）CAg檢測顯示優(yōu)勢；中期（10-20wk）循環(huán)抗體（CAb）檢測顯示優(yōu)勢；晚期（14-28wk）CIC檢測顯示優(yōu)勢。由于查病對象主要是急、慢性病人和晚期病人，用CAg和CAb聯(lián)合檢測，可起診斷互補(bǔ)作用。檢測CAg較檢測CAb更具優(yōu)點，CAg是現(xiàn)癥感染的依據(jù)，能反映感染蟲荷，可用于考核療效并可檢測疫苗效果。從尿中檢測血吸蟲CAg可避免采血所致的肝炎、愛滋病傳播的潛在危險。它的無創(chuàng)傷性、簡單、方便的特點易于被病人接受，更適合現(xiàn)場應(yīng)用。CAg主要有三大類：(1)膜相關(guān)抗原（MAA），(2)腸相關(guān)抗原（GAA），包括CAA和CCA；(3)可溶性蟲卵抗原（SEA）。血吸蟲CAg的檢測：檢測CAg所用的抗體特性：MCAb能識別血吸蟲特有抗原，識別位點為血吸蟲重復(fù)性表位，具有較高的親和力。目前常用的血吸蟲CAg的檢測方法：反向間接血凝、直接斑點ELISA、雙抗體夾心ELISA及改良一步法等。常為血清和尿液聯(lián)合檢測，或單獨尿液檢測。直接斑點ELISA具有操作簡單、檢測結(jié)果迅速、可肉眼觀察、能長期保存、敏感性高等特點，具有誘人的現(xiàn)場應(yīng)用前景。但由于直接用肉眼觀察，對結(jié)果的判斷有一定主觀性。雙抗體夾心ELISA具有較高敏感性和高度特異性，重現(xiàn)性好，使用酶標(biāo)儀判讀結(jié)果較為客觀，但對實驗條件的要求較高、操作反應(yīng)過程長，不適合于現(xiàn)場應(yīng)用。(3)影響血吸蟲CAg檢測的因素：①患者體內(nèi)CAg的存在狀態(tài)直接影響CAg的檢測效果。②各類CAg在宿主體內(nèi)代謝消長規(guī)律的不同影響檢測結(jié)果。③血吸蟲感染程度不同影響CAg檢出率。④感染后期患者體內(nèi)抗獨特型抗體的出現(xiàn)可造成體內(nèi)CAg存在的假象。

絳蟲(tapeworm)目的和要求了解帶絳蟲和其他絳蟲的基本形態(tài)和生活史特點。掌握豬帶絳蟲、牛帶絳蟲的鑒別要點。了解帶絳蟲病、囊尾蚴病、棘球蚴病、裂頭蚴病對人體的危害。實驗內(nèi)容帶絳蟲成蟲鏈狀帶絳蟲（豬帶絳蟲）（Taeniasolium）液浸標(biāo)本（示教）肥胖帶絳蟲（牛帶絳蟲）（Taeniasaginata）液浸標(biāo)本（示教）注意蟲體外形、長度、頭節(jié)和鏈體。豬帶絳蟲頭節(jié)染色標(biāo)本：呈圓球狀，具四個吸盤，頂端具頂突，頂突上有二圈小鉤。（操作）牛帶絳蟲頭節(jié)染色標(biāo)本：近似方形，具四個吸盤，無頂突和小鉤。（示教）豬帶絳蟲成節(jié)染色標(biāo)本（示教）牛帶絳蟲成節(jié)染色標(biāo)本（示教）兩種絳蟲成節(jié)結(jié)構(gòu)大體相同。每個節(jié)片都有雌雄生殖器官，子宮呈管狀，無子宮孔，卵巢分兩葉，豬帶絳蟲卵巢另有一中央小葉，缺消化器官。豬帶絳蟲孕節(jié)墨汁染色標(biāo)本（示教）牛帶絳蟲孕節(jié)墨汁染色標(biāo)本（示教）子宮兩側(cè)的分支數(shù)是鑒別兩種絳蟲的重要依據(jù)，通常豬帶絳蟲孕節(jié)每側(cè)分支為7~13支，牛帶絳蟲為15~30支，枝端再分支。豬帶絳蟲體壁微毛掃描電鏡照片（示教）幼蟲豬帶囊尾蚴染色標(biāo)本（示教）牛帶囊尾蚴染色標(biāo)本（示教）兩種囊尾蚴頭節(jié)與成蟲頭節(jié)構(gòu)造相似，注意兩種囊尾蚴的鏡下鑒別。豬囊尾蚴在豬心肌內(nèi)（示教）豬囊尾蚴在豬腦組織及其他肌肉組織內(nèi)（示教）（三）蟲卵（操作）：蟲卵呈球形或近球形，直徑31~43μm，卵殼甚薄，內(nèi)為胚膜。蟲卵自孕節(jié)散出后，卵殼多已脫落，成為不完整蟲卵。通常鏡檢所見的卵無卵殼，外有很厚胚膜，棕黃色，具放射狀條紋，內(nèi)含有六鉤蚴，新鮮卵的六鉤蚴可見6條關(guān)刀樣的小鉤。兩種帶絳蟲卵形態(tài)相似，鏡下不能區(qū)分。曼氏迭宮絳蟲(spirometramansoni)成蟲成蟲液浸標(biāo)本（示教）成蟲頭節(jié)染色標(biāo)本：呈指狀，其背腹面各有一條縱行的吸槽。（示教）成節(jié)染色標(biāo)本：成節(jié)子宮呈螺旋狀盤曲，緊密重疊，似金字塔狀。（示教）頭節(jié)掃描電鏡圖（示教）中間宿主及幼蟲（示教）中間宿主－劍水蚤裂頭蚴在第二中間宿主——蛙肌肉內(nèi)。裂頭蚴長帶形，乳白色，約300mm×0.7mm，頭部膨大，末端鈍圓，體前端無吸槽，中央有一明顯凹陷，是與成蟲相似的頭節(jié)。體不分節(jié)但具橫皺褶。（三）蟲卵（示教）蟲卵近橢圓形，兩端稍尖，大小為52~76μm×31~44μm，呈灰褐色，有卵蓋，殼較薄，內(nèi)有一個受精卵細(xì)胞和若干卵黃細(xì)胞。（四）解剖青蛙找裂頭蚴（小組操作）用小錐從枕骨大孔刺入，處死青蛙。使蛙腹朝上，四肢伸展，固定在解剖板上，剪開腹部皮膚，剝?nèi)ネ馄ぃ诩∪馐g尋找裂頭蚴，觀察幼蟲的形態(tài)、顏色和活力。細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)成蟲染色標(biāo)本（示教）棘球蚴在肝臟內(nèi)的液浸標(biāo)本（示教）原頭蚴染色標(biāo)本：呈橢圓形，具吸盤和細(xì)鉤。（操作）棘球蚴切片標(biāo)本（示教）外層是宿主組織的反應(yīng)物為假囊壁，真囊壁分為內(nèi)外兩層，外層為角皮層，無細(xì)胞結(jié)構(gòu)，內(nèi)層為生發(fā)層（胚層），具細(xì)胞核和微粒物質(zhì)，胚層長出原頭蚴。作業(yè)繪帶絳蟲蟲卵形態(tài)圖。標(biāo)注豬帶絳蟲頭節(jié)形態(tài)圖。繪原頭蚴形態(tài)圖。寫出解剖青蛙找裂頭蚴實驗報告。思考：從形態(tài)、生活史、致病作用、流行（流行因素與分布）方面比較豬帶、牛帶絳蟲。你認(rèn)為治愈帶絳蟲病的依據(jù)是什么？參考資料

1.帶絳蟲頭節(jié)標(biāo)本制作方法

把牛肉或豬肉內(nèi)的囊尾蚴用刀順肌肉纖維剝下，用生理鹽水洗滌干凈，投入盛有稀膽汁的器皿中(膽汁一份、生理鹽水一份)置37℃溫箱內(nèi)，頭節(jié)很快伸出。經(jīng)生理鹽水洗滌干凈后，用5％福爾馬林直接固定，并保存在70％酒精中。2.貓泡帶絳蟲為家畜帶絳蟲之一，成蟲寄生于貓、狗及其他動物的腸腔內(nèi)，蟲卵隨糞便排出體外，污染周圍環(huán)境。嚙齒類動物如食入蟲卵，幾周后便可在肝臟發(fā)育成幼蟲。幼蟲似豬、牛帶囊尾蚴，為囊狀、乳白色。由于家畜帶絳蟲形態(tài)與豬、牛帶大同小異，因此對教學(xué)和科研都有一定用處。在免疫學(xué)研究方面，本蟲占有很重要的地位。3.實驗感染劍水蚤從犬、貓腸內(nèi)檢獲曼氏迭宮絳蟲成蟲，撕開成熟節(jié)片的子宮，取出蟲卵，置盛有清水的培養(yǎng)皿內(nèi)，25～28℃培養(yǎng)，約經(jīng)1～2周孵出鉤毛蚴。

將劍水蚤放入盛有鉤毛蚴的培養(yǎng)皿內(nèi)，最好加入藻類及原生動物借以養(yǎng)育劍水蚤。置29℃溫箱約7～10天，在劍水蚤的血腔內(nèi)可找到成熟的原尾蚴。4.孕節(jié)墨汁染色標(biāo)本制作方法用0.1～0.2ml注射器吸取少許墨汁，從孕節(jié)生殖孔插入后緩慢注入，使全部子宮分支完全充滿墨汁而顯示出來。

線蟲(nematode)

一、似蚓蛔線蟲（蛔蟲）(Ascarislumbricoides)目的和要求以蛔蟲為例了解線蟲形態(tài)和生活史基本特點。掌握蛔蟲卵形態(tài)特征。了解蛔蟲對人體的危害。實驗內(nèi)容成蟲雌雄成蟲液浸標(biāo)本（示教）成蟲為長圓柱體狀，中間稍膨大，兩端逐漸變細(xì)，新鮮蟲體呈淡紅色，固定后呈灰白色。體表有橫紋和兩條側(cè)線，雄蟲后端向腹部卷曲。雌雄成蟲解剖標(biāo)本（示教）腸管為一直管。生殖器官：細(xì)長如線，迂回盤曲。雌性生殖器官為雙管型：由卵巢、輸卵管、子宮、陰道和陰門等組成。近端為子宮，兩側(cè)子宮會合為陰道，遠(yuǎn)端為卵巢游離在原體腔內(nèi)。雄性生殖器官為單管型：由睪丸、儲精囊、輸精管、射精管和交合刺等組成。游離端為睪丸?；紫x橫切面染色標(biāo)本（示教）注意下列結(jié)構(gòu)：體壁：表皮為角皮層，其下為皮下層和縱肌層，皮下層伸入原體腔內(nèi)并增厚，背腹及兩側(cè)分別形成四條縱索。腸管：腸壁由單層柱狀上皮細(xì)胞組成。原體腔：即體壁和消化道之間的腔隙，腔內(nèi)充滿液體，內(nèi)部器官，如生殖、消化器官浸浴其中。蟲卵受精蛔蟲卵（操作）蟲卵呈短橢圓形，大小為45~75μm×35~50μm，卵殼很厚，通常表面有一層波浪式的蛋白質(zhì)膜，從糞便排出的蟲卵常被膽汁染成黃色或棕褐色，內(nèi)含有一個未分裂的受精卵細(xì)胞，與卵殼之間形成半月形間隙。未受精蛔蟲卵（操作）蟲卵呈長橢圓形或不規(guī)則形，大小為88~94μm×39~44μm，卵殼較薄，淡黃色，內(nèi)含有許多大小不一的屈光顆粒。感染期蟲卵（示教）卵內(nèi)含有一條卷曲的幼蟲。受精卵和未受精卵的掃描電鏡圖。（示教）（三）病理標(biāo)本（示教）蛔蟲性機(jī)械性腸梗阻病理標(biāo)本。蛔蟲成蟲在膽道內(nèi)的病理標(biāo)本。（四）作業(yè)繪受精和未受精蟲卵形態(tài)圖。二、毛首鞭形線蟲（鞭蟲）(Trichuristrichiura)目的和要求掌握鞭蟲卵的形態(tài)特征。實驗內(nèi)容鞭蟲成蟲液浸標(biāo)本（示教）蟲體后部粗大，前端細(xì)長狀似馬鞭。蟲卵（操作）蟲卵較小，50~54μm×22~23μm，紡錘形，黃褐色，卵殼較厚，卵殼兩端各有一個透明的塞狀突起—蓋塞，從糞便排出的新鮮蟲卵內(nèi)含有一個受精卵細(xì)胞。鞭蟲成蟲咬附在腸壁上的病理標(biāo)本。（示教）作業(yè)：繪鞭蟲卵形態(tài)圖。三、鉤蟲十二指腸鉤口線蟲（十二指腸鉤蟲）(Ancylostomaduodenale)美洲板口線蟲（美洲鉤蟲）(Necatoramericanus)目的和要求了解兩種鉤蟲形態(tài)的鑒別要點。掌握蟲卵的形態(tài)特征。掌握與致病作用有關(guān)的形態(tài)結(jié)構(gòu)。了解鉤蟲病流行與自然因素和作物種植的關(guān)系。實驗內(nèi)容成蟲成蟲液浸標(biāo)本（示教）蟲體呈乳白色或米黃色，前端向背側(cè)仰屈，雄蟲末端膨大形成交合傘。雌雄成蟲交配標(biāo)本（示教）十二指腸鉤蟲口囊染色標(biāo)本（示教）注意口囊腹側(cè)有兩對鉤齒。美洲鉤蟲的口囊染色標(biāo)本（示教）注意口囊腹側(cè)有一對板齒。蟲卵蟲卵（操作）蟲卵橢圓形，兩端較圓，大小為36～40μm×56～76μm，殼很薄，無色透明，內(nèi)含2~8個卵細(xì)胞或多細(xì)胞期，若患者便秘或糞便放置過久，蟲卵細(xì)胞可繼續(xù)分裂為多細(xì)胞期，有時可見桑椹期甚至含蚴卵。卵殼與細(xì)胞間有明顯的空隙。十二指腸鉤蟲卵與美洲鉤蟲卵極為相似，不易區(qū)分。2.發(fā)育期蟲卵（示教）卵內(nèi)含有2、4、8個細(xì)胞或桑椹期、含蚴蟲卵。3.蟲卵掃描電鏡照片（示教）病理標(biāo)本成蟲咬附在腸壁上（示教）注意腸粘膜表面的小潰瘍和出血點。成蟲口囊咬附腸粘膜的組織切片（示教）作業(yè)繪鉤蟲蟲卵圖。標(biāo)注鉤蟲口囊形態(tài)圖。思考：鉤蟲是如何感染宿主的？對宿主有哪些危害？鉤蟲病流行與自然環(huán)境的關(guān)系。比較皮膚幼蟲移行癥與鉤蚴性皮炎。四、蠕形住腸線蟲（蟯蟲）(Enterobiusvermicularis)目的和要求掌握蟯蟲卵的基本形態(tài)和實驗室診斷方法。實驗內(nèi)容雌雄成蟲液浸標(biāo)本（示教）蟲體細(xì)小，乳白色，雌蟲尾端長而尖細(xì)，雄蟲尾部彎曲。蟲卵（操作）蟲卵大小為50~60μm×20~30μm，無色透明，兩側(cè)不對稱，一側(cè)偏平，一側(cè)稍凸，卵殼厚，內(nèi)含幼蟲。生理鹽水棉簽拭子法（示教）用生理鹽水濕潤棉簽輕拭肛門周圍或皺褶，把棉簽放入盛有飽和鹽水的西林瓶內(nèi)蕩洗，然后用浮聚法或沉淀法檢查蟲卵。作業(yè)繪蟯蟲卵圖。思考：為何蟯蟲感染多見于群居的兒童？參考資料蛔蟲生活史過程驗證實驗取雌蟲一條置蠟盤內(nèi)，兩端拉直，用大頭針固定(有生殖孔的一面貼向蠟盤)。自蟲體前1／3起至末端將體壁剪開，用大頭針固定切口兩邊。傾入少量清水并用解剖針輕輕將生殖器官松開。剪下連接陰道1.5厘米的子宮下段，置載玻片上撕碎，取少許碎組織加適量生理鹽水做成涂片，鏡檢確定含有受精卵后取用。將充分撕碎的子宮組織放入青霉素瓶內(nèi)，滴加2％福爾馬林液約2毫升，置室溫或27℃左右溫箱內(nèi)培養(yǎng)3周，每周取少許培養(yǎng)物檢查蟲卵的發(fā)育情況。待蟲卵發(fā)育成熟后，用吸管吸去福爾馬林液，滴加適量生理鹽水做成蟲卵混懸液。用吸管吸取0.５毫升，經(jīng)食道灌喂小白鼠。感染蛔蟲卵1周后，解剖小白鼠，取出肺臟置培養(yǎng)皿內(nèi)，加入少量生理鹽水洗去血跡，觀察臟器表面有無出血點。然后將組織撕碎做成壓片，用雙目鏡或低倍鏡檢查蛔蟲幼蟲。巴門氏鉤蚴分離法原理：鉤蚴有向溫性，在兩個不同的溫度中，向溫度較高的方向爬動。

方法：將被檢泥土置于墊有三層紗布的銅篩內(nèi)，把銅篩放在漏斗中。漏斗下方連接膠管，擰緊止水夾。加溫水(約40℃)至漏斗內(nèi)，使水平面接觸銅篩底層泥土。20分鐘后開放止水夾，將漏斗底層液體收集在離心管，離心l～2分鐘，或靜置10～20分鐘，傾去上清液，吸取沉渣滴在玻片上，置雙目解剖鏡下檢查鉤蚴。3.紗布墊鉤蚴分離法用溫水(約40℃)濕透紗布墊(6～7層紗布)蓋在被檢泥土上面，再蓋上培養(yǎng)皿。20分鐘后取出紗布墊，在清水中蕩洗，洗液靜置后，吸取沉渣查鉤蚴。4.鉤蚴培養(yǎng)法(詳見教材308頁)取干凈的中試管一支，加入少許冷開水，剪一“T”字型濾紙，其寬度比試管的直徑略小，長度相當(dāng)于從試管口至水面接觸的距離。取糞便0.2～0.4克，均勻地涂在濾紙的中段，置25～30℃培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，每天要補(bǔ)充試管內(nèi)蒸發(fā)去的水份。三天后用放大鏡檢查管底水中有無幼蟲，如果陰性繼續(xù)培養(yǎng)至第五天。觀察時注意：幼蟲蟲體透明，在水中可作蛇形運動，檢查時需仔細(xì)觀察。5.線蟲成蟲的固定和保存蟲體用生理鹽水洗滌后放入固定液內(nèi)，通常鉤蟲、鞭蟲等用5％甘油酒精(70％酒精95毫升，甘油5毫升)固定，甘油酒精加溫后才投入蟲體，可令其體態(tài)伸直,效果更好，蛔蟲蟲體較大，用5％福爾馬林液固定。(2)上述固定液又可作保存液。此外，亦可保存在70％酒精中。6.蟲卵玻片標(biāo)本的制作(1)蟲卵的固定：將收集的蟲卵洗滌干凈后，根據(jù)蟲卵的種類選擇固定液和固定方法。含有幼蟲的蟲卵可直接傾入固定液內(nèi)浸泡，24小時后更換固定液，即可保存。含細(xì)胞的蟲卵則先將固定液煮沸、然后傾入蟲卵，浸泡24小時后更換固定液保存。常用固定液：5％福爾馬林、5％甘油酒精。蟲卵玻片標(biāo)本制作：吸取一滴已經(jīng)固定的蟲卵混懸液，置大蓋玻片中央，四周放上數(shù)粒碎玻璃，蓋上小蓋玻片，輕壓無液體溢出，然后在載玻片上滴加拿大樹膠2～3滴，把蓋玻片封于其上。平放自然干燥。此法制出的標(biāo)本可保存較長時間。7.司徒爾氏稀釋蟲卵計算法本法用作調(diào)查感染度。取刻有56和60毫升刻度的三角燒瓶一個，加入0.1NNaOH溶液至56毫升刻度處，加被檢糞便于燒瓶內(nèi)，使瓶內(nèi)液面上升至60毫升刻度處(相當(dāng)于4克糞便)投入10多個小玻璃球于瓶內(nèi)，塞緊瓶口，用力搖蕩。二個小時后，充分搖勻，吸取0.15毫升糞便懸液致載玻片上，蓋上大的蓋玻片，在低倍鏡下計算出全玻片蟲卵數(shù),最好連數(shù)兩張，求得平均蟲卵數(shù)。每克糞便中的蟲卵數(shù)＝0.15毫升糞便懸液中檢出的蟲卵數(shù)×100由于糞便中的蟲卵數(shù)受糞便性狀的影響，對稀糞中所求得的蟲卵數(shù)應(yīng)以糾正：半成形糞便×1.5軟便×2稀便×2水樣便×4

五、絲蟲(filaria)馬來布魯線蟲（馬來絲蟲）(Brugiamalayi)班氏吳策線蟲（班氏絲蟲）(Wuchereriabancrofti)目的和要求了解絲蟲生活史和流行病學(xué)特點。掌握微絲蚴的基本形態(tài)。了解病原學(xué)診斷方法。實驗內(nèi)容成蟲馬來絲蟲成蟲液浸標(biāo)本（示教）班氏絲蟲成蟲液浸標(biāo)本（示教）羅阿絲蟲(Loaloa)成蟲液浸標(biāo)本（示教）犬惡絲蟲(Dirofilariaimmitis)成蟲液浸標(biāo)本（示教）微絲蚴馬來絲蟲微絲蚴染色標(biāo)本（操作，示教）班氏絲蟲微絲蚴染色標(biāo)本（操作，示教）注意蟲體外形、姿態(tài)、鞘膜、頭間隙的長寬比例、體核等，在示教標(biāo)本中注意馬來絲蟲微絲蚴有尾核2個。微絲蚴未染色標(biāo)本（示教）微絲蚴細(xì)長彎曲或卷曲，反光性強(qiáng)，頭端鈍圓，尾端尖細(xì)，觀察時光線不要太強(qiáng)。班氏絲蟲臘腸期幼蟲在蚊的胸肌內(nèi)（示教）班氏絲蟲感染期幼蟲在蚊喙內(nèi)（示教）絲蟲中間宿主致倦庫蚊（示教）中華按蚊（示教）（四）絲蟲病病人照片（示教）下肢象皮腫。睪丸鞘膜積液和陰囊象皮腫。作業(yè)標(biāo)注微絲蚴形態(tài)圖。思考：1.班氏絲蟲病的流行有何特征？為什么？2.兩種絲蟲的致病特點。六、旋毛形線蟲（旋毛蟲）(Trichinellaspiralis)目的和要求掌握幼蟲囊包的形態(tài)特點和病原學(xué)診斷方法。通過動物實驗了解生活史和致病作用。實驗內(nèi)容幼蟲囊包染色標(biāo)本（示教）幼蟲囊包活體標(biāo)本（示教）動物感染和解剖實驗（小組操作）感染方法：(1)取感染6周的陽性小白鼠，處死取一小塊肌肉壓片檢查，并計算囊包數(shù)。(2)將含有約30個囊包的肌肉喂給小白鼠。(3)正常飼養(yǎng)。解剖觀察：(1)將已感染旋毛蟲幼蟲囊包6周的小白鼠處死解剖。(2)取小白鼠小腸，剪開并用清水洗滌、輕刮，在洗滌液的沉渣中找成蟲。(3)取膈肌、頰肌、腿部肌肉等，壓片找幼蟲囊包。作業(yè)繪旋毛蟲幼蟲囊包形態(tài)圖。寫出動物感染和解剖實驗報告。思考：1.有哪些家畜可作為人體寄生蟲的保蟲宿主？2.生物源性線蟲和土源性線蟲的流行分布有何不同？為什么？參考資料厚血膜檢查法用75％酒精消毒采血針和受檢者耳垂，以左手拇指和食指捏著耳垂上方、右手持針，迅速刺人耳垂約3毫米，輕輕擠壓取出血液三大滴（相當(dāng)于60mm3），置載玻片兩側(cè)中、外1／3處，用另一載玻片的一角將血液從內(nèi)向外作螺旋狀推開，做成兩個二分錢硬幣大小的血膜，將玻片平放，待自然干透后，用鉛筆在兩個血膜的邊緣寫上編號，收藏在玻片盒內(nèi)，檢查時將玻片放入清水中片刻，脫去血紅蛋白，待血膜呈乳白色時取出鏡檢。新鮮血滴檢查法取末梢血二大滴（最好加入1/100，000肝素一滴）置載玻片中央，加上蓋玻片后，在低倍鏡下檢查。微絲蚴在血液中扭動，推擠周圍紅細(xì)胞。實驗材料取自病人或動物。血液微絲蚴濃集法取靜脈血1ml，置于盛有0.1ml3.8％枸櫞酸鈉溶液的離心管內(nèi)，搖勻，加入蒸餾水9ml，使之溶血，以3000轉(zhuǎn)／分鐘的速度離心2分鐘，傾去上清液取沉渣鏡檢。馬來絲蟲幼蟲在中間宿主體內(nèi)發(fā)育過程的實驗觀察(1)從實驗室建立的保蟲宿主—長爪沙鼠的腹腔內(nèi)穿刺吸出含有微絲蚴的腹腔液。(2)取抗凝血（人或動物血）5～10ml，離心后去血漿，用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞2～3次。(3)將含有微絲蚴的腹腔液加入5～10ml紅細(xì)胞生理鹽水混液中，用玻棒輕輕攪勻。(4)用完整的胎盤膜一塊做成囊袋，吸取紅細(xì)胞與微絲蚴混合液置胎盤膜囊袋中，牢固結(jié)扎袋口。(5)將囊袋置于飼有雌性中華按蚊的蚊籠內(nèi)，在25～30℃條件下，讓雌蚊吸食。(6)大多數(shù)雌蚊吸飽后，取出囊袋，改用10％葡萄糖濕棉球，繼續(xù)飼養(yǎng)。(7)4～6小時后，取部分飽食后的雌蚊麻醉致死，解剖，取出蚊胃并挑破胃壁擠出血液，加一滴生理鹽水稀釋，找微絲蚴，觀察微絲蚴的脫鞘情況。(8)于第3天，取部分蚊解剖胸肌，查找粗短的形似臘腸的幼蟲。(9)2～3周后取出余下的蚊解剖，在喙和體腔內(nèi)找蟲體細(xì)長、運動活潑的感染期幼蟲。旋毛蟲幼蟲囊包濃集法將被檢肌肉剁成小塊，用研缽磨成勻漿，倒入燒杯內(nèi)，加適量胃蛋白酶消化液，37℃溫箱內(nèi)消化16～20小時，傾去上清液，加入生理鹽水，過濾除去粗渣，沉淀后收集幼蟲。6.廣州管圓線蟲廣州管圓線蟲[Angiostrongyluscantonensis（Chen,1935）Dougherty,1946]寄生于鼠類肺部血管。偶可寄生人體引起嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦膜腦炎或腦膜炎。中間宿主為螺類及蛞蝓。成蟲線狀，體表具微細(xì)環(huán)狀橫紋。頭端鈍圓，頭頂中央有一小圓口，缺口囊。雄蟲長11~26mm,寬0.21~0.53mm，交合傘對稱。雌蟲長17~45mm，寬0.3~0.66mm,尾端呈斜錐形，子宮雙管形、白色，與充滿血液的腸管纏繞成紅、白相見的螺旋紋，十分明顯，陰門開口于肛孔之前。七、腸道寄生蟲病原學(xué)檢查目的和要求掌握常用糞便檢查方法。自檢糞便、驅(qū)蟲。實驗內(nèi)容（一）糞便直接涂片法（示教）在玻片上滴生理鹽水一滴，用竹簽挑取米粒大小糞便均勻涂片，蓋上蓋玻片，置低倍鏡下檢查。注意：(l)糞便量要適中。糞便過多，則涂片太厚不利于觀察；糞便太少，則涂片薄影響檢出率。制好的涂片以透過水膜能隱約看到課本的字體為適宜。(2)糞便中含有各種植物細(xì)胞，酵母菌、花粉、植物纖維和未完全消化的食物殘渣等，容易與蟲卵混淆，必須注意鑒別。(3)制好的涂片不能干燥，否則不易辨認(rèn)蟲卵。（二）飽和鹽水浮聚法(示教)取糞便約黃豆大小置小玻璃瓶內(nèi)，先加入少許飽和鹽水，將糞便攪成糊狀,再加飽和鹽水至滿，蓋上載玻片使液面與玻片接觸，如有糞渣或氣泡必須除去。靜置20分鐘后，小心翻轉(zhuǎn)取下玻片，擦干玻片下面的水份。置鏡下檢查。（三）清水沉淀法(示教)(1)取糞便約5～10克置小燒杯內(nèi)，加水少許，用玻璃棒攪成糊狀，并加水稀釋。(2)倒入銅篩(或塑料紗網(wǎng))內(nèi)過濾，濾去糞渣，并把濾液傾入大試管內(nèi)，加水至將滿。(3)靜置10～15分鐘。(4)傾去上層液4／5，留糞渣，加水，靜置5～10分鐘，如此換水?dāng)?shù)次，直到上清液澄清為止，最后傾去上層液體，吸取沉渣鏡下檢查。參考資料厚涂片透明法(改良加藤法)：

一、所需工具

1．定量板及刮棒；

2．100目尼龍或金屬篩網(wǎng)片(大小約4×4cm)；

3．親水玻璃紙條(約5.2×2.6cm)，浸泡于甘油孔雀綠液(3％孔雀綠1ml，甘油50m1，水49ml)中過夜后用；4．壓板(厚玻璃或有機(jī)玻璃制品，大小為5×3cm，可連續(xù)使用)；5．載玻片及顯微鏡。二、操作步驟1.濾取糞便：將篩網(wǎng)覆蓋在送檢標(biāo)本上，自篩網(wǎng)上用刮棒刮取擠溢到網(wǎng)面上的糞便。2.模板取樣：將定量板放在載玻片上，使小邊突緊貼玻片的一邊，用一手的兩指壓住定量板的一端，將刮棒上取得的糞便填滿?？?，刮去多余部分，然后自一端掀起定量板，再松開壓住的兩指把板取去，玻片上即留下二個長條形糞樣。3.蓋紙壓片：在糞條上覆蓋含孔雀綠甘油液的玻璃紙條，展平后用壓板加壓，糞樣即在玻璃紙與載玻片間鋪開成長橢圓形，小心取下壓板(一指固定壓板外的玻璃紙的一端，另一手平拖移去壓板，以免玻璃紙與壓板同時揭起)。4.透明讀片：約1～2小時糞膜透明后即可讀片。鉤蟲卵不宜透明過久。

醫(yī)學(xué)原蟲(medicalprotozoan)溶組織內(nèi)阿米巴和其它阿米巴目的和要求掌握溶組織內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體和包囊的形態(tài)特點。掌握溶組織內(nèi)阿米巴常用診斷方法。理解溶組織內(nèi)阿米巴的致病作用。掌握溶組織內(nèi)阿米巴與結(jié)腸阿米巴形態(tài)鑒別要點。實驗內(nèi)容溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoebahistolytica)滋養(yǎng)體(trophozoite)(l)鐵蘇木素染色標(biāo)本(操作和示教)

先用高倍鏡找到蟲體，然后用油鏡觀察，或直接用油鏡尋找。蟲體外質(zhì)透明，可見舌狀或指狀偽足，內(nèi)質(zhì)呈顆粒狀，顆粒細(xì)小而均勻，內(nèi)有一個核，圓形，核膜內(nèi)緣的染色質(zhì)粒大小較一致，排列整齊，核仁小而圓，位于中央。部份滋養(yǎng)體內(nèi)質(zhì)含有紅細(xì)胞，紅細(xì)胞的形態(tài)隨消化程度不同而異。有些滋養(yǎng)體內(nèi)質(zhì)還含有空泡。(2)活滋養(yǎng)體觀察(操作)方法：取一潔凈玻片，中央滴一滴生理鹽水，挑取有膿血粘液的糞便少許，在生理鹽水中混勻，涂開，蓋上蓋玻片。高倍鏡下檢查。活滋養(yǎng)體的外質(zhì)透明，伸出指狀或舌狀偽足作定向運動，使蟲體形態(tài)不斷發(fā)生變化。內(nèi)質(zhì)可見細(xì)胞核和內(nèi)含物。如果標(biāo)本取自培養(yǎng)液，蟲體內(nèi)可含有許多淀粉顆粒。注意：如果天氣寒冷，取得的標(biāo)本要立即檢查或保溫處理，否則原蟲的活動力減弱。檢材應(yīng)挑取有膿血部份，可提高檢出率。2.包囊(cyst)鐵蘇木素染色標(biāo)本（操作和示教）包囊呈圓球形，染成藍(lán)黑色。囊壁厚，不著色。核通常1～4個，成熟包囊具4個核，核結(jié)構(gòu)與滋養(yǎng)體相同，糖原泡在染色時被溶解，成為空泡，擬染色體深藍(lán)色，棒狀，兩端較鈍圓。成熟包囊常缺擬染色體。(2)碘液染色標(biāo)本(操作和示教)

挑取少許糞便制成涂片，加上蓋玻片，在蓋玻片旁邊滴一滴碘液(碘液不宜過多)，使碘液慢慢摻到糞液中，置高倍鏡下觀察。

染色后包囊呈棕黃色，圓球形，囊壁不著色，發(fā)亮。核呈小圓圈狀、糖原泡著色較深，邊界不明顯。擬染色體呈亮捧狀。3.病理標(biāo)本(l)腸阿米巴病理標(biāo)本(示教)腸壁潰瘍呈散在性分布，大小不一，病變中央組織缺損，周圍組織水腫而隆起，形成火山口樣。多個潰瘍?nèi)诤虾?，使少塊腸粘膜組織壞死、脫落，形成淺表潰瘍。潰瘍口小底大，潰瘍之間仍可見到正常組織。(2)腸阿米巴病理組織切片(示教)在潰瘍周圍組織可見到滋養(yǎng)體、大量白細(xì)胞浸潤。經(jīng)HE染色，滋養(yǎng)體染成桃紅色，胞核和吞噬的紅細(xì)胞染成深桃紅色。(3)阿米巴肝膿腫病理標(biāo)本(示教)膿腫多發(fā)生在肝右葉，常為單個，膿腔周圍組織壞死，使腔壁不整齊，呈棉絮狀。4.滋養(yǎng)體和包囊掃描電鏡照片(示教)結(jié)腸內(nèi)阿米巴(Entamoebacoli)1．滋養(yǎng)體鐵蘇木素染色標(biāo)本(示教)較溶組織內(nèi)阿米巴的滋養(yǎng)體略大，內(nèi)質(zhì)、外質(zhì)分界不甚明顯，食物泡內(nèi)含有細(xì)菌和淀粉顆粒等，但不含紅細(xì)胞。核仁常常偏于一邊。核膜內(nèi)緣的染色質(zhì)粒粗而不均勻，排列不整齊。2.包囊鐵蘇木素染色標(biāo)本(示教)較溶組織內(nèi)阿米巴的包囊大，圓球形，胞核1～8個，核構(gòu)造和滋養(yǎng)體相似。擬染色體的兩端不整齊似碎片狀或草束狀。（三）腔道內(nèi)其他非致病性的阿米巴(示教)1.齒齦內(nèi)阿米巴(E.gingivalis)滋養(yǎng)體蟲體小，僅有滋養(yǎng)體時期，內(nèi)質(zhì)和外質(zhì)的界限分明，食物泡內(nèi)含有細(xì)菌、白細(xì)胞等物，偶有紅細(xì)胞，核仁居中，有核周染色粒。2.微小內(nèi)蜒阿米巴(E.ndolimaxnana)滋養(yǎng)體：新鮮標(biāo)本直接涂片中蟲體細(xì)小。運動緩慢，可有多個偽足。胞核一個，內(nèi)外質(zhì)不分明，內(nèi)質(zhì)粗糙，含有細(xì)菌。有一粗大明顯核仁,無核周染色質(zhì)粒。包囊：較溶組織阿米巴細(xì)小，類圓形或橢圓形，核1～4個，核仁粗大而不規(guī)則，核膜薄，無核周染色質(zhì)粒，缺擬染色體。3.布氏嗜碘阿米巴(Iodamoebabuetschlii)滋養(yǎng)體：蟲體細(xì)小，新鮮標(biāo)本生理鹽水涂片中偽足寬大，運動緩慢。食物泡內(nèi)含有細(xì)菌，染色標(biāo)本中核仁大而且居中央，核膜內(nèi)緣的染色質(zhì)粒不明顯。(四)作業(yè)繪溶組織內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體和包囊形態(tài)圖。繪結(jié)腸內(nèi)阿米巴包囊形態(tài)圖。思考：痢疾阿米巴病是怎樣傳播的？如何作腸阿米巴病和腸外阿米巴病（肝）的病原學(xué)診斷？參考資料阿米巴培養(yǎng)方法：取液體培養(yǎng)基一管，加入滅活血清0.5毫升和少許消毒米粉以及6滴青霉素液，在無菌操作條件下，用吸管吸取0.1毫升含有滋養(yǎng)體的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)種入培養(yǎng)基內(nèi)，置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48～72小時。

二、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(Giardialamblia)目的和要求掌握滋養(yǎng)體和包囊的形態(tài)特征。了解病原學(xué)診斷方法。實驗內(nèi)容滋養(yǎng)體鐵蘇木素染色標(biāo)本（操作）正面觀似半個縱切的倒置梨形，側(cè)面觀呈瓢狀。兩側(cè)對稱，背面隆起，腹面前半部向內(nèi)凹陷形成左右兩葉吸盤，每葉吸盤的背側(cè)備有一個圓形的泡狀細(xì)胞核。一對軸柱縱貫蟲體，中部有2個半月狀中體。鞭毛4對，按伸出蟲體的部位分前側(cè)鞭毛、后側(cè)鞭毛、腹鞭毛和尾鞭毛各一對。2.包囊鐵蘇木素染色標(biāo)本(操作)包囊呈卵圓形，囊壁很厚，不著色。兩對核偏于一端，核仁清晰，并可見到鞭毛、軸柱及絲狀物。藍(lán)氏賈第鞭毛蟲吸附在腸粘膜表面的掃描電鏡圖（示教）4.作業(yè)繪藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體、包囊形態(tài)圖。思考：藍(lán)氏賈第鞭毛蟲為何可致宿主腹瀉？三、陰道毛滴蟲(trichomonasvaginalis)目的和要求掌握陰道毛滴蟲的形態(tài)。實驗內(nèi)容1.陰道毛滴蟲滋養(yǎng)體染色標(biāo)本（操作）蟲體呈梨形或橢圓形，軸柱貫穿蟲體并從末端伸出，蟲體前1/3處可見一個橢圓形胞核，從蟲體前緣發(fā)出4根前鞭毛和1根后鞭毛。體外側(cè)前1/2處有一波動膜，其外緣與向后延伸的后鞭毛相連。胞質(zhì)內(nèi)可見深染、顆粒狀的氫化酶體。陰道毛滴蟲活滋養(yǎng)體（示教）活滋養(yǎng)體呈無色透明狀，有折光性，體態(tài)多變，活動力強(qiáng)。3.作業(yè)：繪陰道毛滴蟲滋養(yǎng)體圖。參考資料1.陰道毛滴蟲的培養(yǎng)常用肝-胨-糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)配方。

(1)培養(yǎng)基的配制：15％肝浸液100ml；蛋白胨2g；葡萄糖0.5g。將以上成分混合，加熱使溶，經(jīng)濾紙過濾，調(diào)節(jié)pH至5.5～6.0。每管分裝5m1,8磅20分鐘高壓滅菌，冷卻后，置37℃恒溫箱中24小時，證明無菌后，貯存于冰箱備用。接種前每管加滅活無菌馬血清1ml,即可用。15%肝浸液的制備：取?；蛲酶?5g,洗凈，剪碎如小米粒大小，浸入100ml蒸餾水中，置冰箱過夜，次日煮沸半小時，用四層紗布過濾除去渣滓，補(bǔ)充蒸餾水至100ml,即成15%肝浸液。培養(yǎng)方法①以無菌棉拭從陰道后穹隆處取分泌物，無菌接種入上述的培養(yǎng)基中；②初次接種和第1、2次轉(zhuǎn)種時，應(yīng)加青霉素5～10萬單位／2ml培基；③培養(yǎng)溫度以37℃為宜；④PH在5.4～6.8之間。

2.直接涂片法檢查陰道毛滴蟲用消毒棉簽在患者陰道后穹窿及陰道壁上取分泌物，涂在滴加生理鹽水的載玻片上，加蓋玻片，鏡檢，可見活滋養(yǎng)體。杜氏利什曼原蟲(Leishmaniadonovani)目的和要求掌握無鞭毛體的形態(tài)特征。了解病原學(xué)診斷方法。從寄生部位理解致病作用。實驗內(nèi)容無鞭毛體染色標(biāo)本（操作）骨髓涂片染色，在巨噬細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外有許多分散或成堆集在一起的蟲體，選擇細(xì)胞外的散在蟲體仔細(xì)觀察。蟲體細(xì)小，圓形或橢圓形，姬氏染色標(biāo)本中，胞質(zhì)呈天藍(lán)色，胞核一個，團(tuán)塊狀，呈紅色，動基體呈小桿狀，基體和鞭毛根不易見到。前鞭毛體染色標(biāo)本（示教）蟲體窄而細(xì)長，前端稍寬，后部窄細(xì)，成熟蟲體呈梭形，前端有一游離鞭毛，與蟲體等長，體核靠近中部，基體在動基體之前，并由此處發(fā)出一根鞭毛。媒介－白蛉（示教）作業(yè)繪無鞭毛體形態(tài)圖。思考：如何診斷（用病原學(xué)方法）疑為內(nèi)臟利什曼病的患者？參考資料1.利什曼原蟲培養(yǎng)檢材取自病人或?qū)嶒瀯游锏墓撬?、淋巴結(jié)、肝、脾(固體組織要磨碎成勻漿)。用0.2毫升洛克氏液混和后接種到NNN培養(yǎng)基，置22～25℃溫箱培養(yǎng)10～12天。陽性結(jié)果見到運動活潑的前鞭毛體。2.活前鞭毛體的觀察從培養(yǎng)基內(nèi)吸一滴培養(yǎng)液置載玻片上，加蓋玻片后，用高倍顯微鏡觀察，可見蟲體活潑運動，鞭毛快速揮動，多個蟲體常集在一起呈菊花狀。3.骨髓穿刺法患者側(cè)臥，顯露髂骨部位，常規(guī)消毒鋪巾，局部麻醉，依據(jù)年齡選擇17～20號帶有針芯的消毒穿刺針，在髂骨前上棘后約1厘米處進(jìn)針，觸及骨面后，慢慢鉆入骨內(nèi)約0.5～1.0厘米，撥出針芯，接上2ml注射器，抽取骨髓液少許作涂片或培養(yǎng)。4.淋巴結(jié)穿刺法該法診斷利什曼原蟲的檢出率不及骨髓液檢查高，但簡便易行，常用部位為腹股溝淋巴結(jié)?；颊咂脚P，顯露腹股溝部，常規(guī)消毒鋪巾，局麻后，用拇指和食指壓緊腫大的淋巴結(jié)，取6號消毒針刺入淋巴結(jié)內(nèi)，稍待片刻撥出針頭，取抽出液作涂片或培養(yǎng)檢查。5.路氏錐蟲（TrypanosomalewisiKent,1880）路氏錐蟲寄生在鼠類血液內(nèi)，中間宿主為歐洲鼠蚤(Ceratephyllusfasciatus)。由于取材容易，多用之作研究對象。本蟲分布廣泛，我國各地均有報告。在鼠血液中的蟲體梭形纖細(xì)，長約25μm。有細(xì)胞核和動基體各一個，細(xì)胞核居中，動基體位于蟲體后部近末端。有鞭毛一條附著于波動膜外緣，由前端伸出體外，在血液中鞭毛甚為活潑。

五、瘧原蟲(malariaparasite)目的和要求學(xué)習(xí)瘧原蟲生活史，理解瘧原蟲的致病機(jī)理。掌握瘧原蟲病原學(xué)診斷方法及三種瘧原蟲的鑒別要點。初步了解瘧原蟲的媒介—按蚊。認(rèn)識瘧疾的防治要點。學(xué)習(xí)研究瘧原蟲的基本方法。實驗內(nèi)容紅細(xì)胞內(nèi)期瘧原蟲1.間日瘧原蟲(Plasmodiumvivas)（操作和示教）(1)環(huán)狀體:纖細(xì)環(huán)狀，直徑約占紅細(xì)胞的l／3。染色后胞質(zhì)藍(lán)色，有一深紅色的核,中間為空泡，形似紅寶石戒指。(2)滋養(yǎng)體：核略增大，形態(tài)視發(fā)育時間和活動情況而多變，可見偽足，胞質(zhì)內(nèi)有黃棕色煙絲狀瘧色素，被寄生的紅細(xì)胞略脹大，染色變淡，并出現(xiàn)淡紅色的薛氏點。(3)裂殖體：早期裂殖體只見核分裂而無胞質(zhì)分裂。成熟裂殖體含12～24個橢圓形裂殖子，排列不規(guī)則，瘧色素集中在中央。蟲體占滿脹大的紅細(xì)胞。(4)配子體雄配子體：圓形，略大于正常紅細(xì)胞，胞質(zhì)色藍(lán)略帶紅，核疏松，淡紅色，位于中央，瘧色素分散。雌配子體：圓形，占滿脹大的紅細(xì)胞，胞質(zhì)藍(lán)色，核結(jié)實，較小，深紅色，偏于一側(cè)，瘧色素分散。2.惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)（操作和示教）(1)環(huán)狀體：(需與間日瘧原蟲比較)

蟲體小，直徑約為紅細(xì)胞的1／5，常見多個蟲體寄生在一個紅細(xì)胞內(nèi)，且有蟲體寄生在紅細(xì)胞的邊緣，一個蟲體有2個核較常見。(2)配子體雄配子體：臘腸形，兩端鈍圓，胞質(zhì)色藍(lán)略帶紅，核位于中央，疏松、淡紅色,瘧色素黃棕色，小桿狀，在核周圍較多。雌配子體:新月狀，兩端較尖。胞質(zhì)藍(lán)色。核位于中央，結(jié)實，較小，深紅色。瘧色素深褐色，多在核周圍。3.三日瘧原蟲(Plasmodiummalariae)（示教）環(huán)狀體：環(huán)較粗大，約為紅細(xì)胞直徑的1／3。滋養(yǎng)體：胞質(zhì)橫貫紅細(xì)胞呈帶狀或卵圓形，胞質(zhì)內(nèi)少有空泡，幾乎看不見偽足,胞質(zhì)分布不均勻，瘧色素出現(xiàn)較早，深褐色，呈顆粒狀，且沿蟲體邊緣分布。被寄生的紅細(xì)胞大小無改變。裂殖體：成熟裂殖體含有6～12個裂殖子，排列規(guī)則，呈花瓣狀，瘧色素集中在中央。顆粒粗大，呈深棕色。配子體：與間日瘧原蟲配子體相似。但蟲體的外形較規(guī)則，多呈圓形。瘧色素多而粗大。紅細(xì)胞大小無改變。（二）紅細(xì)胞外期瘧原蟲（示教）1.蚊體內(nèi)發(fā)育的瘧原蟲。2.卵囊：圓球形或橢圓形，內(nèi)含有許多子孢子。3.子孢子：梭形，兩端尖細(xì)，大小約為1×8μm，姬氏染色核紅色，胞質(zhì)天藍(lán)色。（三）血涂片制作及染色（操作）1.在同一張玻片上制作厚血膜和薄血膜

血液取自人工感染伯氏瘧原蟲的小鼠。剪去其尾尖，擠出2小滴血，分兩處置于載玻片同一端，相隔約1厘米。然后以左拇指和食指握持玻片的兩端，右手持推片(邊緣要光滑)，以推片一個角將外側(cè)的一滴血均勻涂成直徑0.5cm大小的血膜,此為厚血膜。再將推片的短邊接觸另一滴血，并使推片與載片成30～450角，待血液沿推片下緣散開后，勻速快捷向前推進(jìn)，即成薄血膜。理想的薄血膜應(yīng)是血量和寬度適中,平滑不起波浪，末端成掃帚狀。厚血膜晾干后進(jìn)行溶血處理。2.染色：用姬氏染色法(1)原理:染液為含有亞甲藍(lán)(帶陽電荷)和曙紅(帶陰電荷)的中性染料，與細(xì)胞蛋白質(zhì)陽電基、陰電基相遇時，兩物質(zhì)中的陽電荷、陰電荷分別互相吸引而結(jié)合，形成堿性和酸性的染色。堿性呈藍(lán)色，酸性呈紅色。(2)方法:滴一滴甲醇液于血膜上，推開覆蓋所有薄血膜和厚血膜。晾干后，滴加20％姬氏染液(用中性水配制)于薄血膜和厚血膜上，使全部血膜均被覆蓋，染色30～60分鐘，用自來水緩慢地沖洗、晾干，油鏡下檢查。（四）鼠瘧原蟲（伯氏瘧原蟲Plasmodiumberghei）接種實驗（小組操作）取已感染鼠瘧原蟲的小白鼠一只，從眼眶、尾巴或心臟取血0.2ml，用生理鹽水稀釋到1ml，搖勻。用結(jié)核菌素注射器吸取0.1ml稀釋的含原蟲血液，在無菌操作的條件下，給健康小白鼠作腹腔內(nèi)注射。感染后，作標(biāo)記并置飼養(yǎng)籠內(nèi)喂養(yǎng)，留待下周實驗使用。（五）瘧疾媒介－按蚊（示教）中華按蚊、微小按蚊、大劣按蚊。裂殖子掃描電鏡圖（示教）(七)作業(yè)繪制間日瘧原蟲各期和惡性瘧原蟲環(huán)狀體、配子體期形態(tài)圖。寫出鼠瘧原蟲感染實驗報告。思考：何為瘧疾的臨床發(fā)作、再燃和復(fù)發(fā)。2.瘧疾的流行特征。參考資料間接熒光抗體試驗抗體—兔抗人IgG熒光抗體。使用時用pH8.0,0.01MPBS稀釋至工作濃度(約1：8或1：16)抗原標(biāo)本：新發(fā)作的同種瘧原蟲病人的血涂片，干后置0.1NHC1液中脫血5分鐘。流水沖洗后置上述PBS內(nèi)浸泡5分鐘，取出風(fēng)干。被檢血清：用上述PBS將被檢血清稀釋為1：20。染色。吸取被檢血清一滴，滴于已脫血的干燥抗原血膜上，鋪開，置保濕盒內(nèi)，于37℃溫箱中孵育30分鐘。②用上述PBS沖洗一分鐘后，重復(fù)兩次，每次5分鐘。取出并風(fēng)干。③滴加兔抗人IgG熒光抗體（稀釋為1：8或1：16，含1／萬伊文思藍(lán)）于已作抗原抗體反應(yīng)的血膜上。置濕盒內(nèi)，于37℃溫箱內(nèi)孵育30分鐘。④同第②步洗去多余的熒光抗體。⑤染好并干燥的血片標(biāo)本，用pH8.5或8.0的碳酸鹽(或磷酸鹽)緩沖甘油封片。也可在血標(biāo)本上加一小滴PBS(pH8.0)覆以蓋玻片后作熒光鏡檢查。(5)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)裂殖體和滋養(yǎng)體的熒光強(qiáng)度分級。+++～++++：原蟲胞漿熒光明亮。形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚。++：原蟲胞漿熒光一般明亮，形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚。+：原蟲胞漿清楚可見，形態(tài)結(jié)構(gòu)不太清楚?！溃涸x胞漿不顯熒光。在血清稀釋度為1：20時，+以上的熒光強(qiáng)度為陽性反應(yīng)。2.瘧原蟲在蚊體內(nèi)的發(fā)育實驗觀察本實驗是觀察雞瘧原蟲在白紋伊蚊體內(nèi)的發(fā)育過程。將雌性白紋伊蚊一批置蚊籠內(nèi)饑餓l天(僅用清水飼養(yǎng))，次日用人工膜喂血法使蚊媒吸飽帶有配子體的雞血(取自保種雞)。喂食后2小時把蚊媒吸出，分別置1、2、3號蚊籠內(nèi)，在25～28℃和75～90％相對濕度下，用10％葡萄糖水喂養(yǎng)。吸血后3～4小時，將l號蚊籠內(nèi)的蚊媒吸出麻醉致死，解剖，將蚊胃移到干凈處，撕破胃壁，擠出血液，把血液做成涂片、染色、鏡檢、可見雄配子體的出絲現(xiàn)象。吸血后的第4～5天，解剖2號蚊籠內(nèi)的蚊媒，將胃移至干凈玻片上，加一滴生理鹽水，加上蓋玻片，置鏡下檢查卵囊。(先在低倍鏡下用解剖針輕輕推動蓋玻片，使胃壁翻轉(zhuǎn)一周，檢查到卵囊時再用高倍鏡觀察。)(5)輕輕按住卵囊使之破裂，子孢子逸出，染色，油鏡觀察。(6)吸血后約10天，解剖3號蚊籠的蚊媒，分離唾液腺，移至干凈玻片上，用解剖針將之挑破，并輕輕擠壓，在高倍鏡下觀察。子孢子呈鐮刀狀，兩端尖細(xì)，有折光性，微弱運動。觀察活體之后再用姬氏液染色。3.瘧疾診斷方法以鏡檢為基礎(chǔ)，通過濃集血樣中的原蟲以及采用熒光染色的方法。傳統(tǒng)的鏡檢方法普及性和穩(wěn)定性較高，在目前條件下尚難以其他方法全部代替之。免疫學(xué)方法。主要利用單克隆抗體技術(shù)，使瘧疾的檢測更趨簡單、快速，如Dipstick及膠體金等方法。單克隆抗體-ELISA方法雖在大樣本的檢測中花費最少，但其穩(wěn)定性較差；Dipstick(ParaSight-F)方法即以單克隆抗體檢出HRP-Ⅱ作為惡性瘧原蟲診斷依據(jù)，檢測單個病例速度快、穩(wěn)定性也較好，可能是今后大規(guī)模瘧疾防治工作或在瘧疾防治力量薄弱地區(qū)應(yīng)用的方向。以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)，通過制備特異性的探針與瘧原蟲的基因組DNA進(jìn)行雜交即探針技術(shù)。通過基因擴(kuò)增，檢測瘧原蟲某特異片段的DNA序列，從而大大提高檢測的敏感性和特異性，如PCR-ELISA等。PCR技術(shù)適用于瘧原蟲不同地理株的鑒別及抗藥性的判定，但由于對實驗室要求較高，目前尚難普及。限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）也已成為一種常用