hplc-elsd法測定奧美拉唑鈉中鈉離子含量

hplc-elsd法測定奧美拉唑鈉中鈉離子含量

為了改善藥物的溶解、理化穩(wěn)定性、生產(chǎn)工藝特點和生物藥劑學(xué)特性，許多藥物都是以鹽的形式生產(chǎn)的。因我國仿制藥生產(chǎn)企業(yè)較多,不同企業(yè)生產(chǎn)的原料藥可能有不同的成鹽形式存在,以奧美拉唑(omeprazole,OME)為例,目前國內(nèi)市售的奧美拉唑以及S-奧美拉唑(esomeprazole,通用名:埃索美拉唑)原料有奧美拉唑、鈉鹽(圖1)、鎂鹽(圖2)以及鋅鹽供應(yīng),以用于不同制劑的開發(fā)。目前有研究采用滴定法測定奧美拉唑鎂鹽中鎂離子的含量,尚未見測定鈉離子含量的報道。目前,借助于鍵合有兩性離子交換基團的色譜固定相(zwitterionicstationaryphase)和通用性檢測器,如電噴霧檢測器(chargedaerosoldetection,CAD)或蒸發(fā)光散射檢測器(evaporatinglightscatteringdetector,ELSD),可以在常規(guī)液相色譜系統(tǒng)中對藥物的常見陰、陽成鹽離子實現(xiàn)快速分析;但部分藥物分子例如頭孢曲松、博寧霉素等會強保留于色譜柱中,很難洗脫甚至造成不洗脫。在對頭孢曲松鈉的鈉離子測定中,方法準(zhǔn)確度好,但方法精密度較低(RSD在2%~6%之間)。本研究在以往研究基礎(chǔ)上,(1)利用鍵合兩性離子交換基團的色譜固定相,建立測定奧美拉唑鈉中鈉離子含量的方法;(2)選擇奧美拉唑鈉、頭孢曲松鈉和鹽酸博寧霉素分別代表藥物分子在色譜過程中不保留、強保留和不洗脫3種狀態(tài),通過統(tǒng)計分析(t-檢驗、ANOVA等),考察藥物分子洗脫狀態(tài)對化學(xué)藥物成鹽離子含量測定方法準(zhǔn)確性的影響,以更好地闡述新型混合模式色譜柱的應(yīng)用范圍。1儀器和試劑盒1.1自動進樣器和紫外過濾器HPLC-UV-ELSD儀(簡稱儀器A)主要用于方法開發(fā)以及大部分方法學(xué)驗證實驗:島津20A液相色譜系統(tǒng)(包括LC-10AT型雙輸液泵;DGU-12A型在線脫氣機;SIL-10A型自動進樣器;CTO-10A型柱溫箱;SPD-10A型二極管陣列檢測器,檢測波長254nm;Alltech蒸發(fā)光散射檢測器;數(shù)據(jù)處理軟件為CLASS-VP),美國Alltech公司。HPLC-UV-ELSD儀(簡稱儀器B)用于方法學(xué)驗證的中間精密度以及粗放性研究:Ultimate3000型液相色譜系統(tǒng)(包括雙三元輸液泵系統(tǒng);紫外檢測器,檢測波長254nm;Alltech蒸發(fā)光散射檢測器;帶溫控的自動進樣器,進樣器溫度為4℃;數(shù)據(jù)處理軟件為ChromLeon),美國Dionex公司。Milli-Q超純水系統(tǒng),法國Millipore公司。1.2其他化學(xué)成分待測樣品為奧美拉唑鈉待標(biāo)定化學(xué)對照品1批(批號100760-201202),由中國食品藥品檢定研究院提供。氯化鈉工作基準(zhǔn)品(氯化鈉,工作基準(zhǔn)品級別,含量99.95%~100.05%,以100.0%計,批號20000318,由北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司提供);醋酸銨(CH3COONH4,AR級別,含量≥99.5%,批號20080126,由國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供);氯化鉀(KCl,AR級別,含量≥99.5%,批號F20100713,由國家集團化學(xué)試劑有限公司提供);硫酸鋰(Li2SO4·H2O,AR級別,含量≥99.0%,批號20060405,由天津市祿晨化學(xué)試劑廠提供);無水氯化鈣(CaCl2,AR級別,含量≥96.05%,批號F20070731,國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供);冰醋酸(CH3COOH,AR級別,含量≥99.5%,批號20091020,由北京化工廠提供);乙腈(CH3CN,色譜純,含量≥99.9%,批號100606,由FisherScientific提供)。2實驗方法2.1離子峰位的確定精密稱定氯化鉀11.75mg、氯化鈉基準(zhǔn)品17.60mg、硫酸鋰12.05mg、碳酸氫鈉10.50mg、無水氯化鈣29.02mg、醋酸銅15.03mg、硫酸鎂17.3mg、奧美拉唑鈉對照品12.51mg,分別置10mL量瓶中,用60%乙腈水溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得用于確定各離子峰位的溶液;精密量取上述各溶液1mL,于同一10mL量瓶中,用60%乙腈水溶液稀釋至刻度,搖勻,即得。2.2對照品儲備液的制備取氯化鈉工作基準(zhǔn)品(含量以100.0%計)適量,105℃干燥至恒重后,精密稱定49.24mg,置50mL量瓶中,用50%乙腈水溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對照品儲備液(以鈉離子計,濃度為387.4μg·mL-1);另精密量取對照品儲備液1.0mL,分別置200、100、50、25、10和5mL量瓶中,用50%乙腈水溶液依次稀釋至刻度,搖勻,分別制成從低濃度到高濃度的系列對照品溶液(以鈉離子計濃度分別為1.94、3.87、7.75、15.50、38.74、77.48μg·mL-1)。2.3供試品溶液的制備取樣品細(xì)粉約12.5mg,精密稱定,置25mL量瓶中,用50%乙腈水溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,過濾,取續(xù)濾液作為供試品溶液(濃度為0.5mg·mL-1)。2.4otno.063-331系統(tǒng)的適用性試驗色譜條件:Ⅰ號和Ⅱ號色譜柱均為混合模式色譜柱AcclaimTrinityP1(3.0mm×100mm,5μm,購自美國Dionex公司),但批號不同,Ⅰ號色譜柱主要用于方法開發(fā)以及大部分方法學(xué)驗證實驗,批號為LotNo.006-04-062,Ⅱ號色譜柱用于中間精密度、耐用性研究以及樣品測定,批號為LotNo.006-04-031;以30mmol·L-1醋酸銨緩沖液(取醋酸銨4.59g,加水1900mL使溶解,用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5.21,加入乙腈100mL)-乙腈(50∶50,v/v)為流動相,流速為0.3mL·min-1;柱溫25℃;以Alltech蒸發(fā)光散射檢測器檢測,漂移管溫度90℃,氮氣作為載氣,流速為2.6L·min-1。系統(tǒng)適用性試驗:取氯化鈉對照品溶液,注入液相色譜儀,調(diào)節(jié)流動相中有機相比例,使鈉離子主峰的保留時間約5~8min,鈉離子峰與奧美拉唑峰的分離度應(yīng)大于3.0,鈉離子峰與氯離子峰的分離度應(yīng)大于10。測定法:精密量取“2.2”項下氯化鈉對照品溶液20μL,分別注入液相色譜儀,以對照品溶液濃度(X,μg·mL-1)與相應(yīng)峰面積(Y)進行二階多項式回歸(Y=aX2+bX+c),回歸方程的相關(guān)系數(shù)(r)應(yīng)不小于0.99;再精密量取“2.3”項下供試品溶液進樣20μL,以鈉離子峰面積用二階多項式回歸方程按下述公式(1)計算出鈉離子含量(μg·mL-1)。3結(jié)果與討論3.1hplc-elsd法測定奧隆鈉鈉的鈉離子含量3.1.1專業(yè)3.1.1.色譜柱的選擇將“2.1”項制備的混合溶液進樣20μL,記錄色譜圖至鈉離子峰保留時間的6倍以上,各峰按順序依次洗脫:奧美拉唑、Li+、Na+、K+、Mg2+、Cl-、Ca2+(圖3);而其他離子Zn2+、SO42-、HCO3-等在此色譜條件下不洗脫,需要選擇其他類型色譜柱;雖奧美拉唑峰與相鄰鋰離子峰分離度為1.1,但不影響鈉離子峰定量。3.1.1.奧美拉唑峰與鈉離子的色譜質(zhì)譜條件分別取“2.2”、“2.3”項下制備的氯化鈉對照品溶液、供試品溶液進樣20μL,結(jié)果見圖4,鈉離子峰與氯離子峰之間的分離度為18.53,在此色譜條件下,奧美拉唑峰與鈉離子完全分離,不干擾鈉離子測定。3.1.2鈉離子進樣濃度對測定鈉離子的影響分別精密吸取“2.2”項下的氯化鈉對照品溶液(即含相當(dāng)于鈉離子1.94、3.87、7.75、15.50、38.74、77.48μg·mL-1)從低濃度到高濃度依次進樣20μL,記錄色譜峰面積,以鈉離子濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),進行二階多項式回歸得出回歸方程:結(jié)果表明,鈉離子進樣濃度在1.94~77.48μg·mL-1(0.38%~15.5%)范圍內(nèi)呈二項式相關(guān)關(guān)系。3.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測限精密量取對照品溶液(濃度為1.94μg·mL-1)0.5mL,置100mL量瓶中,加50%乙腈水溶液稀釋至刻度,搖勻,用0.45μm濾膜濾過,取續(xù)濾液按上述色譜條件進樣20μL,以S/N=3計,檢測限為0.65μg·mL-1(0.13%);以S/N=10計,定量限為1.97μg·mL-1(0.39%)。3.1.4精密度3.1.4.鈉離子含量測定取奧美拉唑鈉樣品細(xì)粉約12.5mg,精密稱定,在2個實驗室,用2臺儀器,由2名實驗人分別按“2.2”項和“2.3”項方法制備氯化鈉對照品溶液以及供試品溶液,按“2.4”項下色譜條件及測定方法進行測定,計算鈉離子平均含量(n=6)為6.23%,RSD為2.0%。3.1.4.鈉離子含量取奧美拉唑鈉樣品細(xì)粉約12.5mg,精密稱定,由同一實驗人按“2.3”項下方法制備供試品溶液6份,按“2.4”項下色譜條件及測定方法進行測定,計算鈉離子含量的平均值(n=6)為6.22%,RSD為4.0%。3.1.5鈉離子檢測取奧美拉唑鈉樣品細(xì)粉約12.5mg,精密稱定,分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液,室溫靜置,在上述條件下分別于0、4、8、12、16、24h依法進樣20μL,記錄鈉離子峰面積的RSD(n=6)為5.0%,結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定,奧美拉唑可能出現(xiàn)的降解雜質(zhì)峰并未干擾鈉離子測定。3.1.6加樣回收率試驗采用加樣回收率試驗進行準(zhǔn)確度測定。取已測知含量的樣品細(xì)粉約12.5mg,精密稱定,置25mL量瓶中,加50%乙腈水溶液5mL使溶解,分別精密加入鈉離子濃度為412.3μg·mL-1的氯化鈉對照品溶液0.5、1.0、2.5mL,分別相當(dāng)于加入鈉離子0.009、0.018、0.041mmol·L-1,用50%乙腈水溶液稀釋至刻度,搖勻,每個濃度制備3份溶液,按“2.4”項下色譜條件及測定方法進行測定,計算加樣回收率,結(jié)果低、中、高三濃度水平的平均加樣回收率(n=3)分別為104.5%、101.7%、102.6%,RSD分別為1.3%、3.7%、2.2%。3.1.7色譜圖的生成在HPLC方法開發(fā)過程中,分別調(diào)節(jié)流動相中緩沖液pH、有機相比例等色譜參數(shù),均得到了類似的HPLC色譜圖;在方法學(xué)驗證中,由2名實驗人在不同天分別用儀器A、儀器B以及Ⅰ號和Ⅱ號色譜柱進行實驗,也得到了類似的HPLC色譜圖,鈉離子峰和氯離子峰分離良好,峰形正常,顯示方法具有比較充分的色譜耐用性。3.1.8鈉離子含量測定在完成HPLC方法開發(fā)以及方法學(xué)驗證后,由2名實驗員分別取奧美拉唑鈉樣品細(xì)粉約12.5mg,精密稱定,分別按“2.2”項及“2.3”項下方法制備氯化鈉對照品溶液以及供試品溶液,按“2.4”項下色譜條件及測定方法進行測定,計算供試品溶液中含鈉離子的量,經(jīng)SPSS19.0AVONA判定兩人結(jié)果之間無顯著差異(α=0.05),將兩人結(jié)果平均,鈉離子含量平均值(n=8)為6.23%,RSD為4.2%。3.2統(tǒng)計學(xué)方法分析方法通常以準(zhǔn)確度以及精密度來衡量。按各國藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證原則規(guī)定,對新建分析方法,需要進行充分方法驗證以評價方法的適用性。然而,這些指導(dǎo)原則中并未具體規(guī)定方法學(xué)驗證數(shù)據(jù)的可接受標(biāo)準(zhǔn)。隨著化學(xué)計量學(xué)的發(fā)展,更多的數(shù)學(xué)統(tǒng)計模型用于分析方法驗證結(jié)果的可靠性(reliability)研究,例如用多項式回歸分析縮小測定范圍以獲得最小誤差,用Bayesian概率研究評價不同濃度范圍內(nèi)分析結(jié)果的可靠性,用AVONA等統(tǒng)計學(xué)分析對方法學(xué)驗證結(jié)果進行評價等等。這些統(tǒng)計方法能客觀地評價分析方法數(shù)據(jù)的可靠性,保障了復(fù)雜生物樣本以及生物分析的準(zhǔn)確測定。根據(jù)文獻報道,化學(xué)藥物成鹽時,51.4%以鈉鹽存在,38.6%以鹽酸鹽存在,因此,研究用HPLC-ELSD法測定化學(xué)藥物成鹽離子含量的準(zhǔn)確性影響因素時,主要集中于對鈉離子、氯離子含量的影響。在以往頭孢曲松鈉的鈉離子含量測定研究中,方法精密度較低(RSD在2%~6%之間),推測可能與所用ELSD狀態(tài)有關(guān),還有可能是與受頭孢曲松峰很難洗脫導(dǎo)致色譜柱選擇性出現(xiàn)變化有關(guān)。因此,在實驗方法設(shè)計時,選擇奧美拉唑鈉、頭孢曲松鈉、鹽酸博寧霉素分別代表藥物分子未保留、強保留和不洗脫3種洗脫狀態(tài),依次進行加樣回收率、精密度試驗,以數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件SPSS19.0進行統(tǒng)計分析(t-檢驗、ANOVA等),以考察藥物分子洗脫狀態(tài)對成鹽離子含量測定準(zhǔn)確性的影響。3.2.1洗脫狀態(tài)對準(zhǔn)確度的影響方法準(zhǔn)確度通常以加樣回收率來表述,也可以與理論值比較。奧美拉唑鈉理論上以一分子奧美拉唑與一分子鈉成鹽形式存在,其鈉離子理論含量為6.24%,經(jīng)分析,實測平均含量(n=8)為6.23%,RSD為4.2%,經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件SPSS19.0進行t-檢驗,無顯著性差異(α=0.05),說明藥物分子洗脫狀態(tài)對準(zhǔn)確度無影響。影響色譜方法精密度的常規(guī)因素包括分析儀器、色譜柱、人員操作、樣品均勻性等幾個方面,文中不再討論,重點討論以下因素。3.2.2elsd檢測所導(dǎo)致的精密度ELSD檢測器實際檢測的是醋酸銨鹽等可揮發(fā)性顆粒物質(zhì),顆粒的形成過程、大小、形狀等均可能導(dǎo)致響應(yīng)值的差異,在實驗設(shè)計時,將HPLC-UV與ELSD串聯(lián),同一供試品溶液連續(xù)進樣6次(進樣重復(fù)性),分別計算UV色譜圖中主成分峰以及ELSD色譜圖中鈉離子峰的峰面積RSD,以此值衡量ELSD檢測器所導(dǎo)致的精密度影響。經(jīng)測定,奧美拉唑鈉中UV色譜圖中奧美拉唑峰面積的RSD(n=6)為0.86%,而ELSD色譜圖中鈉離子峰面積的RSD(n=6)為2.8%,經(jīng)ANOVA分析,ELSD檢測器的進樣重復(fù)性明顯低于UV檢測器(α=0.05)。3.2.3洗脫狀態(tài)的影響為考察藥物分子洗脫狀態(tài)對成鹽離子測定精密度的影響,在實驗設(shè)計時,在同一段時間內(nèi)、同一儀器、同一色譜柱、同一分析員進行測定盡量排除儀器、人員操作的影響;將樣品研勻,縮短取樣時間,盡量排除樣品取樣均勻性的影響;由此,根據(jù)誤差分析思路,3個組(奧美拉唑鈉、頭孢曲松鈉、鹽酸博寧霉素)所得到的精密度(包括中間精密度、重復(fù)性)數(shù)據(jù),能粗略地代表藥物分子在色譜過程中未保留、強保留和不洗脫這3種洗脫狀態(tài)下對鈉離子、氯離子測定的影響。將奧美拉唑鈉中鈉離子測定的中間精密度結(jié)果(RSD為2.0%,n=6)與頭孢曲松鈉中的鈉離子測定的中間精密度結(jié)果(RSD為4.3%,n=6)比較,經(jīng)ANOVA分析,有顯著差異(α=0.05);將奧美拉唑鈉中鈉離子