酵母甘露寡糖對肉仔雞腸道微生物、短鏈脂肪酸及免疫機能的影響

酵母甘露寡糖對肉仔雞腸道微生物、短鏈脂肪酸及免疫機能的影響

甘草糖是指甘草糖或甘草糖與葡萄糖通過i-1、2、i-1、3、i-1、6或iii-1、3和iv-1的四糖苷組的苦聚糖，通常是從爺爺?shù)拇址?、甜味橡膠和微生物培養(yǎng)基中提取的。甘露寡糖進入消化道后不能被消化酶所降解,到達后段腸道后發(fā)酵產生短鏈脂肪酸,降低pH值,抑制有害菌生長,還可以吸附致病菌改善腸道健康,通過提高免疫球蛋白水平,改善巨噬細胞活性等提高機體免疫力,增強抗病性。日糧中添加0.3%(質量分數(shù)w,下同。)的MOS可以降低仔豬盲腸內大腸桿菌數(shù)量,促進雙歧桿菌和乳酸桿菌生長,提高仔豬日增重和飼料報酬?？诜蚱は伦⑸銶OS可以提高雛雞免疫器官重量,飼料中添加MOS可增強蛋雞白細胞吞噬能力、PHA淋巴細胞轉化率和T淋巴細胞比例,顯著提高肉雞體內抗體反應等。魔芋作為甘露寡糖的主要來源,目前已開發(fā)出純度較高的保健品魔芋甘露寡糖,而目前市場上為數(shù)不多的寡糖類產品寡糖純度只在35%～55%,而且因含單糖和淀粉類物質而難于保存,同時我國也是啤酒酵母生產大國,廢棄的啤酒酵母細胞壁中同樣含有豐富的甘露寡糖,因此從啤酒酵母中提取高純度的甘露寡糖及其實際應用效果已經成為近幾年的研究熱點。本實驗室通過酶法和酸法結合有機溶劑的方法制備出高純度的甘露寡糖,但其在肉雞上的應用效果還有待驗證。因此,本試驗旨在探討實驗室自行提取的啤酒酵母甘露寡糖在肉仔雞日糧中的實際應用效果。1材料和方法1.1分子質量及純化啤酒酵母甘露寡糖:本實驗室從啤酒酵母細胞壁中提取,可溶于水,分子質量約為3kD,鍵型主要以α-1,6為主鏈連接形式,以α-1,2或α-1,3為支鏈連接形式,純化率達90%。魔芋甘露寡糖:由成都協(xié)力植物加工園購得,純化率達95%。1.2基礎日糧添加量對產品穩(wěn)定性的影響選用1日齡AA商品肉仔雞公雛300只,隨機分為5個處理,分別為基礎日糧組(對照組)(表1),基礎日糧添加0.05%、0.1%和0.15%甘露寡糖組和添加0.1%魔芋甘露寡糖組,各處理組通過減少沸石粉的用量保證配方有效成分含量的一致性。每處理4個重復,每個重復15只雞。1.3飼養(yǎng)管理方法試驗采用稻殼作為墊料進行地面平養(yǎng),人工喂料,乳頭飲水器供水,肉雞飼養(yǎng)管理按常規(guī)飼養(yǎng)方法進行。于7、21日齡進行新城疫一免和二免,14日齡進行法氏囊免疫。1.4脂肪酸和氨基酸指標1)腸道微生物測定。試驗于21和28日齡每個處理取8只雞,在無菌條件下取全部盲腸,分別用于乳酸菌和雙歧桿菌,大腸桿菌和沙門氏菌測定。2)盲腸短鏈脂肪酸(SCFA)的測定。試驗于21日齡每個處理取8只雞,取盲腸內容物,用蒸餾水稀釋后,離心取上清液,利用酸化法進行去蛋白處理后用氣相色譜法測定盲腸食糜中短鏈脂肪酸含量。3)血清新城疫HI抗體效價的測定。于14、21、28、35和42日齡每個處理8只雞進行翅下靜脈采血,分離血清,采用紅細胞凝集抑制試驗測定血清中新城疫HI抗體效價。4)外周血T、B淋巴細胞轉化率及巨噬細胞吞噬指數(shù)的測定。于21和42日齡每個處理隨機取8只雞,翅靜脈無菌采集抗凝血5mL(肝素鋰無菌真空采血管),采用淋巴細胞體外培養(yǎng)和MTT(四甲基偶氮唑鹽)法測定T、B淋巴細胞轉化率。結果以刺激指數(shù)(SI)表示:SI=ConA(或LPS)刺激的D570nm/對照管的D570nm。采用淋巴細胞體外培養(yǎng)和中性紅法測定巨噬細胞吞噬指數(shù)(D540nm)。5)盲腸食糜sIgA含量的測定。于28日齡,每個處理8只雞,在無菌條件收集盲腸食糜,用生理鹽水稀釋后,離心取上清液,采用試劑盒法測定sIgA的含量(所用試劑盒購自美國Bethyl公司)。1.5數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件中One-wayANOVA進行方差分析,差異顯著性進行Duncan氏多重比較。2結果2.1啤酒酵母模擬添加1d盲腸內雙歧桿菌數(shù)量添加啤酒酵母甘露寡糖對試驗肉雞21日齡盲腸內乳酸菌數(shù)量作用不明顯(表2),魔芋甘露寡糖顯著增加了乳酸菌數(shù)(P<0.05)。啤酒酵母甘露寡糖可以增加21d盲腸內雙歧桿菌的數(shù)量,其中0.05%和0.10%啤酒酵母甘露寡糖組與空白對照組和魔芋甘露寡糖組相比差異極顯著(P<0.01)。與空白對照組相比添加3個不同劑量的啤酒酵母甘露寡糖極顯著減少了28d盲腸內大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量(P<0.01),并且以0.15%高劑量組的效果最好。魔芋甘露寡糖也可以減少大腸桿菌(P<0.05)和沙門氏菌(P<0.01)的數(shù)量,但與魔芋甘露寡糖相比,啤酒酵母甘露寡糖對大腸桿菌有更好的抑制效果(P<0.05)。2.2啤酒酵母甘露寡糖對小鼠體內脂肪酸含量的影響由表3可知,添加啤酒酵母甘露寡糖后盲腸內的異丁酸、丁酸和戊酸含量均低于對照組,其中0.05%和0.10%啤酒酵母甘露寡糖組異丁酸含量與對照組相比差異顯著(P<0.05),0.05%組的戊酸含量顯著低于對照組(P<0.05),與對照組和魔芋甘露寡糖組相比,添加啤酒酵母甘露寡糖可提高乙酸、丙酸和總短鏈脂肪酸的含量(P>0.05)。2.3魔芋甘露寡糖組p>0.05添加0.05%酵母甘露寡糖的抗體效價顯著的高于一免后14d對照組和魔芋甘露寡糖組(P<0.05)。添加0.10%和0.15%的酵母甘露寡糖與對照組相比顯著提高了二免后14d的抗體效價(P<0.05),且以高劑量組的效果最好(表4)。2.4提高細胞對cha的反應性不同處理對試驗第42天的淋巴細胞LPS刺激指數(shù)無顯著差異。與對照組和魔芋甘露寡糖組相比,添加0.10%啤酒酵母甘露寡糖顯著提高了淋巴細胞對ConA的反應性(P<0.05)。添加0.05%(P<0.01)和0.10%(P<0.05)啤酒酵母甘露寡糖的巨噬細胞吞噬指數(shù)顯著高于對照組,同時0.05%組的巨噬細胞吞噬指數(shù)也高于魔芋甘露寡糖組(P<0.01)(表5)。2.5對啤酒酵母的siga含量影響試驗第28天的盲腸內sIgA含量以魔芋甘露寡糖組最高,3個不同劑量的啤酒酵母甘露寡糖組sIgA含量依次呈下降趨勢,與對照組或魔芋甘露寡糖組相比無顯著差異(表5)。3討論3.1以酵母為原料的回復突變試驗動物腸道內的微生物區(qū)系很容易被日糧成分所影響,尤其是受日糧中糖類物質的影響。早在20年前就已證實非可消化性多糖如,果寡糖、甘露寡糖和半乳甘露寡糖等對人體腸道菌群可產生有益影響。動物試驗表明,添加低劑量的果寡糖(0.1%)可以減少肉雞腸道中沙門氏菌數(shù)量,同時果寡糖還可以作為某些腸道有益菌的發(fā)酵底物促進其生長等。也有研究表明,甘露寡糖具有這種功能。本試驗中,啤酒酵母甘露寡糖對雙歧桿菌有促生長作用,其中0.05%和0.10%啤酒酵母甘露寡糖組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。有研究指出添加1g/kg的甘露寡糖可以顯著提高嶺南黃雞盲腸中的雙歧桿菌數(shù)量,與本試驗結果一致。這說明甘露寡糖可以作為雙歧桿菌的促生長因子,而也有研究指出,寡糖類物質可以被雙歧桿菌利用代謝產乳酸和乙酸,除此以外,雙歧桿菌的增殖還可以分泌更多殺菌或抑菌類物質從而抑制沙門氏菌屬、彎曲菌屬、志賀菌屬等。乳酸菌也是有益菌的代表之一,本試驗中酵母甘露寡糖組的乳酸菌數(shù)量要高于對照組,但差異不顯著。小劑量的甘露寡糖在仔豬日糧中添加可以顯著提高其盲腸內的乳酸桿菌含量。而0.1%、0.4%、1.0%不同劑量的甘露寡糖在火雞前期日糧中添加對盲腸乳酸桿菌的數(shù)量并無顯著影響,同時在國內肉雞試驗中也有相似結論。因此,甘露寡糖對乳酸菌是否有增殖效果,其能否被乳酸菌利用還有待進一步研究。腸道致病菌可導致疾病傳播、影響生產性能。在本試驗中0.05%、0.10%和0.15%劑量的啤酒酵母甘露寡糖極顯著的減少了盲腸內大腸桿菌和沙門氏菌的數(shù)量(P<0.01)。除了甘露寡糖可促進某些有益菌增殖對有害菌產生抑制作用以外,也可能由于甘露寡糖可以替代腸上皮的甘露糖型受體蛋白與含有Ⅰ型菌毛的致病菌相結合,并將其清除腸道。同時許多體外試驗也表明甘露寡糖可以吸附多種擁有Ⅰ型菌毛的病原菌,包括,大腸埃希氏菌和沙門氏菌等。本次試驗所用的酵母甘露寡糖主要以α-1,6為主鏈連接形式,以α-1,2或α-1,3為支鏈連接形式,有研究指出α-1,3到α-1,6分支的結構與致病菌上甘露糖型的外源凝集素具有高度的親和力,從而對某些致病菌的抑制效果更好。本試驗中3個劑量啤酒酵母甘露寡糖組的乙酸、丙酸以及總揮發(fā)性脂肪酸含量均高于對照組(P>0.05),而腸道內短鏈脂肪酸具有降低氧化還原電位,影響有害菌生長和代謝所必需輔酶的氧化還原作用,從而抑制致病菌,這可能也是導致腸道內大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量減少的原因之一。3.2啤酒酵母回復突變對大鼠腸道免疫的影響甘露糖可以和腸相關淋巴組織上的某些防御細胞上的受體相結合從而激活免疫防御機制如,促進淋巴細胞增殖、增強吞噬作用等。有報道指出甘露寡糖對仔豬的細胞免疫和體液免疫有刺激作用,蛋雞日糧中添加2g/kg的甘露寡糖可以極顯著提高白細胞吞噬率和PHA淋巴細胞轉化率。此次試驗中,0.1%的啤酒酵母甘露寡糖組顯著提高了ConA對T細胞的刺激指數(shù),說明一定劑量的啤酒酵母甘露寡糖可以激活由T細胞介導的細胞免疫防御機制。有研究指出添加0.1%的甘露寡糖可以極顯著的提高血液中T淋巴細胞的百分率,這與本試驗結果相似。而高水平的巨噬細胞吞噬指數(shù)表明吞噬細胞處于較高活化狀態(tài)以及抗原遞呈作用的增強,從而增強機體的非特異性防御機能。本試驗中,添加0.05%和0.10%啤酒酵母甘露寡糖與對照組相比均提高了巨噬細胞的吞噬指數(shù)。這可能是由于一小部分的甘露寡糖通過腸黏膜上皮M細胞被轉運到腸集合淋巴節(jié)(payer’spatches,PP)等腸相關淋巴組織從而激活巨噬細胞發(fā)揮免疫功效。本試驗,在新城疫一免后14d和二免后14d啤酒酵母甘露寡糖有提高新城疫抗體效價的作用,證明甘露寡糖可以提高針對新城疫病毒的特異性抗體水平,這與Cotter在肉雞上的研究結果基本一致。但也有研究指出,肉雞日糧中添加甘露寡糖對提高法氏囊和新城疫的抗體效價沒有明顯的作用。sIgA可以防止細菌黏附到黏膜細胞,防止內毒素或微生物與微絨毛結合,是構成腸黏膜免疫屏障的重要組成部分。國外曾有研究指出甘露寡糖可以提高火雞腸黏膜sIgA水平以及血液中的IgG含量,這可能也是甘露寡糖與腸黏膜淋巴細胞特異性受體結合刺激了B淋巴細胞分泌免疫球蛋白。在對鼠的腸道免疫中也發(fā)現(xiàn),葡甘露聚糖,水溶性魔芋甘露聚糖可調節(jié)腸道內sIgA