重組DNA分子轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選鑒定（基因工程課件）

轉(zhuǎn)化CONTENTS目錄0102質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法及原理轉(zhuǎn)化率及影響因素感受態(tài)細(xì)胞（competentcell）:用理化方法人工誘導(dǎo)細(xì)胞，使之處于易于吸收和容納外源DNA分子的狀態(tài)。Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化λ噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染電穿孔轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化方法及原理Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等）原理:Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，液晶結(jié)構(gòu)經(jīng)熱脈沖作用發(fā)生收縮，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備方法取OD600=0.5的菌體1mL，離心收集菌體；加1mL冰冷的10mM

CaCl2溶液懸浮菌體，離心；用0.1mL冰冷的CaCl2溶液懸浮菌體；冰浴放置12-24小時(shí)，備用。收集菌體；CaCl2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化原理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化42℃保溫90秒（熱脈沖）；取20-50微升

感受態(tài)細(xì)胞，加入50ng重組DNA；混勻,冰浴半小時(shí)；迅速置冰浴中5分鐘；加入1

ml新鮮培養(yǎng)基，于37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)；涂布固體平板，篩選。細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而通常采用原生質(zhì)體（細(xì)胞去壁后的形態(tài)）法轉(zhuǎn)化。酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞也可用原生質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)化

細(xì)菌原生質(zhì)體的制備：赤霉菌原生質(zhì)體植物生產(chǎn)上用的赤霉素主要通過(guò)水稻赤霉病菌藤倉(cāng)赤霉(GF)工業(yè)發(fā)酵而來(lái)。赤霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株不產(chǎn)生孢子,不易進(jìn)行以孢子為受體的外源基因轉(zhuǎn)化。因此，需要制備赤霉菌原生質(zhì)體取0.2-1ml的原生質(zhì)體懸浮液（108-109原生質(zhì)體）。加入10-20微升DNA重組連接液，混勻。電擊。原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化λ噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)大腸桿菌在含有麥芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.5。

電穿孔轉(zhuǎn)化法將混勻的質(zhì)粒/DNA連接液和受體菌加入樣品池施以瞬間高壓電場(chǎng)在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)粒或重組DNA分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。物理轉(zhuǎn)化法---磷酸鈣共沉淀法物理轉(zhuǎn)化法電擊轉(zhuǎn)化法物理轉(zhuǎn)化法---脂質(zhì)體介導(dǎo)法在顯微鏡下，將DNA溶液注入受精卵中變大的雄性原核。物理轉(zhuǎn)化法顯微注射法物理轉(zhuǎn)化法血影細(xì)胞介導(dǎo)法病毒轉(zhuǎn)染法以病毒DNA為載體攜帶外源基因轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)定向性好實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好導(dǎo)入效率高。轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率定義定義：最佳轉(zhuǎn)化條件下，每微克載體DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。一般情況下，每個(gè)受體細(xì)胞最多只能接受一個(gè)載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表述為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，接納DNA的受體細(xì)胞個(gè)數(shù)，即克隆數(shù)。影響轉(zhuǎn)化率的因素轉(zhuǎn)化率的影響因素受體細(xì)胞的影響受體細(xì)胞必須與載體相匹配，否則轉(zhuǎn)化率很低；轉(zhuǎn)化率的影響因素轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定CONTENTS目錄01載體的概念、種類02載體的條件、功能03質(zhì)粒質(zhì)粒載體的構(gòu)建載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)克隆DNA序列檢測(cè)外源基因產(chǎn)物檢測(cè)由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到100%，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子.轉(zhuǎn)化子:導(dǎo)入外源DNA后獲得了新的遺傳標(biāo)志的細(xì)菌細(xì)胞或其他受體細(xì)胞。

轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定方法載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)克隆DNA序列檢測(cè)外源基因產(chǎn)物檢測(cè)載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)1抗藥性篩選法原理：將外源DNA片段插在XbaI位點(diǎn)：非重組子抗性Ampr、Kanr重組子抗性Kanr載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)抗藥性篩選法基本操作：先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Kan的平板將Kan平板上的轉(zhuǎn)化子影印至含有Amp和Kan的平板上

在Kan平板上生長(zhǎng)、但在Amp和Kan平板上不長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子即為重組子載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)2營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法基本原理：

可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子一般不能區(qū)分重組子與非重組子。原理：載體分子上攜帶合成某種營(yíng)養(yǎng)組份的基因，受體細(xì)胞本身不能合成這一營(yíng)養(yǎng)組份將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在不含此營(yíng)養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出的便是轉(zhuǎn)化子

載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)3顯色篩選法顯色篩選法的基本原理：原理：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達(dá)產(chǎn)物能使細(xì)胞產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而易于篩選。如lacZ’基因（藍(lán)色反應(yīng)）鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的酪氨酸酶（melC）基因（黑色反應(yīng)），催化生成由酪氨酸氧化而來(lái)的黑色素。載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)顯色篩選法顯色篩選法的基本操作：將外源基因克隆在載體的lacZ’基因內(nèi)部，使之失活重組子呈Kanr、lacZ-，菌落白色非重組子則呈Kanr、lacZ+，菌落藍(lán)色。1限制性酶切圖譜法就是對(duì)插入的外源DNA片段進(jìn)行酶切圖譜分析，并與已知目的基因的酶切圖譜對(duì)比?？寺NA序列檢測(cè)限制性酶切圖譜法全酶解圖譜法：用BamHI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA電泳觀察酶解產(chǎn)物片段重組DNA分子：2kb;2.7kb非重組DNA分子：2.7kb限制性酶切圖譜法全酶解圖譜法：用EcoRI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA目的重組子：1.5kb;3.2kb或者：0.5kb;4.2kb2.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIBamHIBamHIEcoRIPstI2kb0.5kb0.3kb克隆DNA序列檢測(cè)探針：同位素標(biāo)記菌落原位雜交法的基本操作：2菌落原位雜交法克隆DNA序列檢測(cè)菌落原位雜交法雜交探針的標(biāo)記：熒光標(biāo)記探針A-T-G-A-G-C-C-A-T-C-C-G-A-GT-A-C-T-C-G-G-T-A-G-G-C-T-C樣本T-A-C-T-C-G-G-T-A-G-G-C-T-CA-T-G-A-G-C-C-A-T-C-C-G-A-G熒光基團(tuán)菌落原位雜交法菌落原位雜交法克隆DNA序列檢測(cè)3DNA序列分析法Sanger雙脫氧末端終止測(cè)序法

Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法

雜交測(cè)序法

Sanger雙脫氧末端終止測(cè)序法

Maxam-Gilb