生物制品生產(chǎn)技術(shù)-疫苗生產(chǎn)的基本程序

細(xì)菌毒素指致病性細(xì)菌產(chǎn)生的毒性物質(zhì)，分為外毒素和內(nèi)毒素兩類。

外毒素是細(xì)菌在生長過程中分泌到菌體外的毒性物質(zhì)，主要是由革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生。外毒素屬蛋白質(zhì)，一般容易滅活，可用甲醛脫毒而成為類毒素。細(xì)菌毒素的概念

某些細(xì)菌外毒素可用甲醛等處理后脫毒的制品，毒性雖消失，但免疫原性不變，故仍然具有刺激人體產(chǎn)生抗毒素，以起到機(jī)體從此對某疾病具有自動免疫的作用。常用的甲醛溶液的濃度是0.3~0.4%,它可使細(xì)菌外毒素的電荷發(fā)生改變，封閉其自由氨基，產(chǎn)生甲烯化合物。作用機(jī)理

某些細(xì)菌外毒素可用甲醛等處理后脫毒的制品，毒性雖消失，但免疫原性不變，故仍然具有刺激人體產(chǎn)生抗毒素，以起到機(jī)體從此對某疾病具有自動免疫的作用。它們廣泛地應(yīng)用于預(yù)防某些傳染病。如向人體注射白喉類毒素后可以預(yù)防白喉。作用機(jī)理

若在類毒素中加入適量的磷酸鋁或氫氧化鋁，即成吸附精制類毒素。此類制劑在體內(nèi)吸收較慢，能較長時間刺激機(jī)體，使機(jī)體產(chǎn)生高滴度抗體，增強(qiáng)免疫效果。類毒素也可與死疫苗混合制成聯(lián)合疫苗。如百白破三聯(lián)疫苗，就是由百日咳死菌苗、白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素混合制成的。作用機(jī)理

制備出高純度的精制破傷風(fēng)類毒素的均為一一蛋白質(zhì)。從理論上來講，各種蛋白分離純化的技術(shù)都可用于提純素素或類毒素。但是考慮到殘余物、規(guī)模生產(chǎn)等要素，目前認(rèn)為硫酸餃二段沉淀加透析或超濾的方法是最適合于大規(guī)模生產(chǎn)的簡易可行的方法。改進(jìn)精制方法

目前，鋁劑對大腦神經(jīng)組織的毒性作用日益受到重視，這種新型破類的研制具有很深遠(yuǎn)的意義。近年來，已成功研制出這種新型的破類，初步應(yīng)用于馬匹免疫取得很大成功，并且對這種新型破類的一些理化和生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。改進(jìn)類毒化的工藝改進(jìn)類毒化的工藝國外曾報道用改進(jìn)的新工藝制備——新型破傷風(fēng)類毒素獲得成功。此種類毒素的類毒化是完全的，且是不可逆的，其免疫原性并不能因磷酸鈣的吸附而增強(qiáng)。此種類毒素作為液體疫苗和傳統(tǒng)的吸附精制破傷風(fēng)類毒素有同樣的免疫原性。溫度:一般脫毒采用37～39℃。pH:在微酸性時脫毒速度慢；在堿性時脫毒速度快，但類毒素抗原性易受破壞。甲醛含量:<1%。

脫毒物理學(xué)方法：凍干、氧化鋁吸附劑化學(xué)沉淀法：酸、鹽析、有機(jī)溶劑層析法：凝膠過濾類毒素的精制

疫苗（vaccines）

根據(jù)我國農(nóng)業(yè)部文件規(guī)定：“由特定細(xì)菌、病毒、立克次氏體、螺旋體、支原體等微生物及寄生蟲制成的主動免疫制品，一律稱為疫苗”。

1.活疫苗

活疫苗是指抗原物質(zhì)可在體內(nèi)繁殖，能刺激機(jī)體產(chǎn)生系統(tǒng)的免疫應(yīng)答和局部免疫應(yīng)答的疫苗。活疫苗特點：能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫；免疫力持久；有利于清除局部病毒；產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低。

缺點：活疫苗殘毒動物群體內(nèi)持續(xù)傳代后，有毒力增強(qiáng)和反祖的危險；可以出現(xiàn)不同抗原的干擾現(xiàn)象。(1)弱毒疫苗

弱毒疫苗是由微生物自然強(qiáng)毒通過物理、化學(xué)或生物處理，并經(jīng)連續(xù)傳代和篩選培養(yǎng)而成的，喪失或減弱了對宿主動物致病力，但仍然保存良好免疫原性和遺傳特性的毒株；或從自然界篩選、具有良好免疫原性的自然弱毒株，經(jīng)培養(yǎng)后制備的活疫苗。

弱毒疫苗又可分為同源疫苗和異源疫苗。同源疫苗(homologousvaccines)：用所制備疫苗的菌株或毒株來自于預(yù)防傳染病的本動物，這種疫苗又稱為同種疫苗。

異源疫苗(heterogenousvaccine)：利用具有類屬性保護(hù)性抗原非同種微生物所制成的疫苗，稱為異源疫苗。弱毒疫苗(2)重組活疫苗

這種疫苗菌(毒)株基因變化一般不是點突變，故其毒力較為穩(wěn)定，反祖機(jī)率小，如偽狂犬病基因缺失疫苗。(3)基因工程活載體苗

此類疫苗不僅具有活疫苗和死疫苗的有點，而且對載體病毒或細(xì)菌以及插入基因相關(guān)病原體的感染均有保護(hù)力。同時，一個載體可以表達(dá)多個保護(hù)抗原基因，可獲得具有多價或多聯(lián)特性的疫苗。2.死疫苗

死疫苗特點：抗原不能在動物體內(nèi)繁殖；比較安全，不發(fā)生全身毒性作用；無毒力反祖現(xiàn)象；有利于制備多價或多聯(lián)疫苗；制品穩(wěn)定受外界環(huán)境影響少。缺點：此類疫苗免疫劑量大，生產(chǎn)成本高，需多次免疫，故常需要用佐劑或攜帶載體系統(tǒng)來增強(qiáng)免疫效果，一般只能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫效應(yīng)。(1)滅活疫苗

滅活疫苗，又稱死苗

制造滅活苗菌(毒)種通常是標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒或免疫原性優(yōu)良的弱毒株。菌(毒)株經(jīng)人工大量培養(yǎng)后，用理化方法將其殺死(滅活)后制成的疫苗，即滅活疫苗。（一般滅活苗）

自家滅活苗：此種疫苗可用以治療慢性的、反復(fù)發(fā)作而用抗生素治療無效的細(xì)菌性感染或病毒性感染，如頑固性葡萄球菌感染癥、小兒頑固性哮喘。這是一種嚴(yán)格限制的滅活苗，必須小計量反復(fù)注射，決不可施于另一同樣的患者。

滅活疫苗滅活疫苗

臟器或組織滅活苗：利用病、死動物的含病原微生物臟器制成乳劑，加甲醛等滅活脫毒所制成的疫苗。(2)類毒素

細(xì)菌外毒素，用適當(dāng)濃度(0.3%-0.4%)甲醛溶液處理，使之脫毒而制成的生物制品，稱為類毒素(toxoid)。細(xì)菌外毒素為蛋白質(zhì)，兼有毒性及抗原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的中和其本身的抗體——抗毒素。外毒素經(jīng)甲醛溶液脫毒后失去毒性，但保留較強(qiáng)的免疫原性成為類毒素，類毒素比毒素更穩(wěn)定。(3)亞單位苗依照“取其精華，去其糟粕”的原則，撇棄生物體中具有毒副作用的成分，而只吸納其中的病原部分制造而成的。亞單位苗可免除出全菌體和全病毒疫苗的一些副作用，保證了疫苗的安全性，但制造成本較高，通常免疫保護(hù)效果低于全菌體和全病毒疫苗。

(4)基因工程亞單位苗

利用基因工程技術(shù)，取出微生物中編碼保護(hù)性抗原肽段的基因，再將此基因與質(zhì)粒等載體重組，導(dǎo)入受體菌(細(xì)菌、酵母)或細(xì)胞，使之在受體菌或細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，產(chǎn)生大量保護(hù)性肽段，提取此保護(hù)性肽段，加佐劑后制成的疫苗，即基因工程亞單位苗。

轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)定性分析

E.coliIPTG誘導(dǎo)WesternblotSDS蛋白純化獲得單一蛋白奠定研究基礎(chǔ)誘導(dǎo)免疫制備抗體保護(hù)性抗原基因DH10篩選重組子提取重組Bacmid轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)染LacZKanGm表達(dá)及檢測TranscriptionTermination(TT)MCSBglⅡPichiaExpressionvectorforiHISAmprBglⅡ3′AOXBglⅡBglⅡ重組質(zhì)粒構(gòu)建線性化電轉(zhuǎn)化重組子篩選表達(dá)與檢測TTGneofinterestHIS43’AOX1Geneofinterest5’PAOX1HIS43’AOX15’AOX

AOX1ORF3’AOX1TTTT5’PAOX1Geneofinterest5’PAOX1HIS43’AOX1TTBglⅡBglⅡPichiaGenomePichiaGenome3.基因疫苗基因疫苗又稱核酸疫苗，包括DNA疫苗和RNA疫苗基因疫苗的特點：疫苗本身不能在機(jī)體增值，但可被細(xì)胞吸收，并在細(xì)胞內(nèi)指導(dǎo)合成抗原。合成的抗原不僅可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，還可以激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答，尤其是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。

細(xì)菌性滅活疫苗制造細(xì)菌性活疫苗制造病毒性動物組織疫苗制造

病毒性禽胚培養(yǎng)疫苗制造疫苗制造

細(xì)菌性滅活疫苗制造

接種培養(yǎng)基濃縮佐劑菌種種子液菌液

菌苗原液滅活菌液配苗、乳化分裝檢驗

凍干接種培養(yǎng)基

保護(hù)劑弱毒菌種種子液菌液菌苗原液配苗檢驗活疫苗

細(xì)菌性活疫苗制造

佐劑種毒健康動物感染動物毒液保護(hù)劑分裝凍干活疫苗滅活病毒液乳化分裝滅活苗病毒性動物組織疫苗制造

注意事項:

動物選擇種毒常用的接種途徑觀察與收獲制苗腦內(nèi)注射靜脈注射肌肉注射皮下注射腹腔注射離心佐劑種毒雞胚收獲尿囊液濃縮病毒配苗分裝檢驗病毒性禽胚培養(yǎng)疫苗制造

適應(yīng)于雞胚的種毒包括自然弱毒與人工培育的弱毒兩類。多為凍干毒。凍干毒種需按規(guī)定要求在雞胚繼代復(fù)壯，通常繼代3代以上，經(jīng)檢定符合標(biāo)準(zhǔn)后方可作為生產(chǎn)疫苗的毒種,包括無菌檢測、毒價和其他項目的檢定等。種毒與毒種繼代

受精卵必須來自SPF雞群,從受精卵入孵開始至培育全過程都應(yīng)保持無菌，要求一定的溫度和濕度，且需不斷翻動。

5～8日齡胚適用于卵黃囊接種：9－11日齡胚用于尿囊腔接種；10～12日齡胚適于羊膜腔接種；11～13日齡胚用于絨毛尿囊膜接種。（SPF：無特定病原菌）雞胚選擇

尿囊腔：流感病毒卵黃囊接種：乙型腦膜炎病毒絨毛尿囊膜：皰疹病毒。羊膜腔接種：流行性感冒病毒、流行性腮腺炎病毒雞胚培養(yǎng)法【目的】了解用雞胚分離、培養(yǎng)病毒的基本方法?！驹怼侩u胚培養(yǎng)法是常用的病毒培養(yǎng)法之一，操作簡便，來源容易，本身帶病毒的情況也極為少見，一般選用白色殼薄的受精卵，主要用4種途徑接種不同部位，即絨毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔及卵黃囊等。多數(shù)病毒都可以在雞胚的不同部位增殖?！静牧稀?、雞受精卵、蛋架、檢卵燈、磨蛋機(jī)、透明膠紙。2、滅菌的手術(shù)刀、鑷子、剪刀、平皿、1m1注射器及6號針頭、12號針頭。3、乙型腦炎病毒液、單純皰疹病毒懸液、流感病毒稀釋液

病毒接種途徑1、尿囊腔接種法：（1）取10—11天齡雞胚，在檢卵燈下畫出氣室界限，于胚胎附近大血管處作好標(biāo)記；消毒后，用滅菌刀尖打一小孔；用滅菌注射器吸取流感病毒懸液0.2m1，刺入0.5cm后，進(jìn)行注射；以透明膠紙封閉注射孔，蠟筆做好標(biāo)記。（2）置35℃孵箱中孵育，每日進(jìn)行檢視雞胚的死活。如果雞胚在接種后24h內(nèi)死亡者，為非特異性死亡，棄之。（3）孵育3天后取出，放入4℃冰箱過夜。（4）次日取出雞胚，消毒氣室部分卵殼，用無菌剪刀去卵殼，用小鑷子撕去卵膜。以無菌毛細(xì)吸管吸取尿囊液放于無菌試管中。2、卵黃囊接種法（1）取6～8天雞胚，檢卵燈下畫出胎位和氣室，垂直放于蛋架上，氣室端向上。碘酒消毒氣室中央，刀尖錐一小孔。（2）以1ml注射器及12號針頭吸取乙型腦炎病毒液0.5ml，自小孔穿入垂直接種于卵黃囊內(nèi)，深度為3cm左右，注入標(biāo)本0.2ml～0.5m1，退出注射器。膠紙封口，37℃孵育。每天檢卵并翻動2次。（3）取孵育24h以上瀕死的雞胚，于氣室端開口，用鑷子提起卵黃蒂，擠去卵黃液，用無菌生理鹽水洗去卵黃囊上的卵黃液后將卵黃囊置于無菌平皿內(nèi)，低溫保存?zhèn)溆谩?、絨毛尿囊膜接種法

（1）取12天齡雞胚，檢卵燈下標(biāo)記胎位，于附近無大血管處碘酒消毒。用小鋸片在其雞胚旁無大血管處的卵殼上鋸一四方形（勿傷殼膜），同時于氣室用刀尖錐一小孔。（2）打開四邊形之卵殼，勿傷及卵殼膜，滴加滅菌生理鹽水一滴于殼膜上。用橡皮乳頭從氣室小孔吸氣，可見鹽水被吸下，絨毛膜下沉，形成人工氣室。（3）用注射器吸取0.2ml～0.5ml單純皰疹病毒液滴于絨毛尿囊膜上，膠紙封口。37℃孵育4～5天后收獲。（4）收獲：剪開氣室，如接種效果成功，絨毛尿囊膜上可見明顯疹斑。用無菌剪刀剪下此膜，置于無菌平皿內(nèi)低溫保存，備用。4、羊膜腔接種法（1）取12天雞胚，經(jīng)照視后劃出