基于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的銀杏葉治療心腦血管類疾病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

基于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的銀杏葉治療心腦血管類疾病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、計(jì)算機(jī)建模和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的基礎(chǔ)上，為生物網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析而開(kāi)發(fā)和分析藥物作用機(jī)制的研究和發(fā)現(xiàn)創(chuàng)新藥物。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從藥物、靶點(diǎn)與疾病間相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā),采用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)模型表達(dá)和分析研究對(duì)象的藥理學(xué)性質(zhì),特別適宜研究中藥多成分-多靶點(diǎn)的作用關(guān)系,有利于揭示中藥成分復(fù)雜作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)概念自2007年被提出以來(lái),國(guó)內(nèi)外已有不少相關(guān)的研究報(bào)道,如范驍輝等采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究復(fù)方丹參方,網(wǎng)絡(luò)分析表明9個(gè)活性成分均作用于多個(gè)靶點(diǎn),呈現(xiàn)出方劑多成分、多靶點(diǎn)、整合調(diào)節(jié)作用特點(diǎn);喬延江等采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究活血化瘀中藥,通過(guò)網(wǎng)絡(luò)對(duì)比計(jì)算,篩選得到中藥與西藥治療冠心病138個(gè)相同作用節(jié)點(diǎn)和397個(gè)中藥獨(dú)特作用節(jié)點(diǎn),表明中藥治療冠心病確實(shí)存在有別于西藥的獨(dú)特作用機(jī)制;王毅等以中藥附子的22個(gè)化學(xué)成分預(yù)測(cè)出多個(gè)作用靶點(diǎn),所建網(wǎng)絡(luò)模型中每個(gè)化合物的平均靶點(diǎn)數(shù)為16.3,平均每個(gè)靶點(diǎn)與4.77個(gè)化合物相關(guān)聯(lián),反映出中藥“多成分、多靶點(diǎn)”的特點(diǎn)。銀杏葉為銀杏科銀杏屬植物銀杏(GinkgobilobaL.)的樹(shù)葉。銀杏葉提取物(GBE)是從銀杏葉中分離純化的提取物,具有清除氧自由基、拮抗血小板活化因子、降血脂、增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和激素水平、改善血液流變狀態(tài)等作用,因而在臨床上被廣泛用于預(yù)防和治療心腦血管類疾病。但是,其藥效成分及關(guān)鍵作用靶點(diǎn)尚待系統(tǒng)研究和揭示。本文以銀杏葉為研究對(duì)象,利用隨機(jī)森林算法建立藥物分子-靶點(diǎn)相互作用預(yù)測(cè)模型,對(duì)銀杏葉化學(xué)成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè),然后構(gòu)建銀杏葉“成分-靶點(diǎn)-心腦血管相關(guān)疾病”復(fù)雜網(wǎng)絡(luò),從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度預(yù)測(cè)銀杏葉治療心腦血管類疾病的有效成分及其潛在靶點(diǎn),為開(kāi)發(fā)更好的心腦血管類候選藥物提供參考依據(jù)。1方法1.1陽(yáng)性樣本集集從KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)下載小分子化學(xué)藥的分子結(jié)構(gòu)及其相應(yīng)靶蛋白受體,剔除缺乏實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的藥物-靶點(diǎn),最終獲得4782條藥物-靶點(diǎn)配對(duì),其中包括2711條藥物-酶蛋白受體、1365條藥物-離子通道蛋白受體、620條藥物-G蛋白受體、86條藥物-核蛋白受體。以上數(shù)據(jù)作為本研究的陽(yáng)性樣本集。陰性樣本集:將陽(yáng)性樣本集中的藥物-靶點(diǎn)配對(duì)拆開(kāi),各類分別進(jìn)行重新組合配對(duì),剔除已包含在陽(yáng)性樣本集中的配對(duì)結(jié)果,最后隨機(jī)挑選出兩倍于陽(yáng)性樣本集的配對(duì)結(jié)果,即生成陰性樣本集。訓(xùn)練集:分別合并上述4類藥靶配對(duì)陰陽(yáng)樣本,即得訓(xùn)練集數(shù)據(jù)。1.2一般概念的表達(dá)其中x0(i)是原始數(shù)據(jù);x(i)是歸一化后數(shù)據(jù),其值在-1到1之間。1.3隨機(jī)森林的構(gòu)建隨機(jī)森林(RandomForest,RF)是LeoBreiman于2001年提出的一個(gè)組合分類器算法,它是利用bootsrap重抽樣方法從原始樣本中抽取多個(gè)樣本,對(duì)每個(gè)bootsrap樣本進(jìn)行決策樹(shù)建模,然后組合多棵決策樹(shù)的預(yù)測(cè),通過(guò)投票得出最終預(yù)測(cè)結(jié)果。在樹(shù)的每個(gè)節(jié)點(diǎn)處,從M個(gè)特征中隨機(jī)挑選mtry個(gè)特征(mtry<<M),通常假設(shè)。按照節(jié)點(diǎn)不純度最小的原則,從這mtry個(gè)特征中選出一個(gè)特征進(jìn)行分支生長(zhǎng)。單棵分類樹(shù)進(jìn)行充分生長(zhǎng),使每個(gè)節(jié)點(diǎn)的不純度達(dá)到最小,不進(jìn)行通常的剪枝操作。將生成的ntree棵分類樹(shù)組成隨機(jī)森林,用隨機(jī)森林分類器對(duì)新的數(shù)據(jù)進(jìn)行判別與分類,分類結(jié)果按樹(shù)分類器的投票多少而定,即:在上述隨機(jī)森林構(gòu)建過(guò)程中,生成每棵分類樹(shù)時(shí)所應(yīng)用的自助樣本集從原始數(shù)據(jù)中隨機(jī)選取,每個(gè)節(jié)點(diǎn)處所采用的變量也是從所有變量中隨機(jī)選取。此2次隨機(jī)過(guò)程使得隨機(jī)森林具有較大的穩(wěn)定性和較優(yōu)的性能,能在較好地容忍噪聲的同時(shí)提高分類精確度。RF作為一種優(yōu)秀的數(shù)據(jù)挖掘算法,目前已被廣泛運(yùn)用于生物、醫(yī)藥、物理、化學(xué)等領(lǐng)域。2結(jié)果與討論2.1k折交叉驗(yàn)證應(yīng)用隨機(jī)森林法建立模型,需要優(yōu)化其主要參數(shù),即樹(shù)數(shù)(ntree)和每棵樹(shù)的節(jié)點(diǎn)數(shù)(mtry)。本文采用網(wǎng)格搜索法進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化,以獲得最高的K折交叉驗(yàn)證(K-foldcross-validation)正確率。所謂K折交叉驗(yàn)證,即將初始采樣分割成K個(gè)子樣本,一個(gè)單獨(dú)的子樣本被保留作為驗(yàn)證模型的數(shù)據(jù),其他K-1個(gè)樣本用來(lái)訓(xùn)練。交叉驗(yàn)證重復(fù)K次,每個(gè)子樣本驗(yàn)證一次,平均K次的結(jié)果或者使用其他結(jié)合方式,最終得到一個(gè)單一估測(cè)。本研究中K=10,正確率(accuracy)見(jiàn)公式(3)定義,優(yōu)化結(jié)果列于表1。其中NY代表分類錯(cuò)誤的樣本個(gè)數(shù),Y代表所有樣本個(gè)數(shù)。2.2中藥-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建將上述34個(gè)化合物與四種已知的靶點(diǎn)進(jìn)行組合,構(gòu)建預(yù)測(cè)集。預(yù)測(cè)集按訓(xùn)練集相應(yīng)的方法計(jì)算分子描述符、降維和歸一化等處理,然后代入RF模型進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。表2列出了與銀杏葉化學(xué)成分作用頻次較高的前15個(gè)靶點(diǎn),提示它們可能是銀杏葉治療心腦血管類疾病的關(guān)鍵靶標(biāo);進(jìn)一步地,應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建銀杏葉成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)模型,見(jiàn)圖1。網(wǎng)絡(luò)中黃色三角形節(jié)點(diǎn)表示銀杏葉化學(xué)成分;紅色圓形節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn);綠色正方形節(jié)點(diǎn)表示心腦血管相關(guān)疾病;若某一靶點(diǎn)為某化合物的潛在作用靶點(diǎn),則以邊相連。從圖1可見(jiàn),銀杏葉所含34個(gè)成分與靶點(diǎn)存在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,網(wǎng)絡(luò)模型中平均相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)目為10.517,反映出中藥多成分-多靶點(diǎn)-多疾病相關(guān)的特點(diǎn)。同時(shí)可見(jiàn)5號(hào)化合物(山奈酚)、20號(hào)化合物(白果苦內(nèi)酯A)、31號(hào)化合物(異鼠李素)、40號(hào)化合物(表兒茶素)、50號(hào)化合物(銀杏內(nèi)酯A)、52號(hào)化合物(銀杏酮)、62號(hào)化合物(白果苦內(nèi)酯B)、63號(hào)化合物(白果苦內(nèi)酯C)、64號(hào)化合物(白果苦內(nèi)酯J)、65號(hào)化合物(白果苦內(nèi)酯M)等成分在網(wǎng)絡(luò)中連接度較高(見(jiàn)表3),提示其可能是銀杏葉發(fā)揮藥效的重要成分。2.3在文獻(xiàn)中對(duì)計(jì)算得到的銀杏葉與心腦血管疾病相關(guān)的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行了文獻(xiàn)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)出的四類受體相應(yīng)靶點(diǎn)均有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。2.3.1法律及其他浸提液對(duì)cyp2c9類內(nèi)基類化合物3a4的誘導(dǎo)作用潛在作用靶點(diǎn)主要是CYP酶、PDE酶、ACE酶、COX酶等。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于GBE對(duì)細(xì)胞色素CYP酶的影響沒(méi)有得到一致的結(jié)果。一項(xiàng)以人P450微粒體為研究對(duì)象的試驗(yàn)中,熒光法測(cè)定GBE及其黃酮類成分和萜類內(nèi)酯成分對(duì)CYP450的活性影響,發(fā)現(xiàn)GBE能抑制CYP2C9,CYP1A2,CYP2E1和CYP3A4的表達(dá),黃酮類成分能抑制CYP2C9,CYP1A2,CYP2E1和CYP3A4的表達(dá),萜類內(nèi)酯成分只顯著抑制CYP2C9的表達(dá)。SugiyamaT等采用小鼠研究GBE對(duì)甲苯璜丁脲降血糖作用的影響,實(shí)驗(yàn)提示長(zhǎng)期服用GBE,誘導(dǎo)了小鼠的CYP2C9;而單獨(dú)一次服用GBE,可能抑制CYP2C9的活性。人體臨床試驗(yàn)關(guān)于GBE對(duì)CYP2C9的影響并沒(méi)有得到與上述一致的結(jié)果。YinOQ等研究提示,健康志愿者長(zhǎng)期服用GBE可能對(duì)CYP2C19活性具有誘導(dǎo)作用,并且GBE對(duì)CYP2C19的誘導(dǎo)作用具有基因型依賴性。譚萍等研究發(fā)現(xiàn),GBE可使急性腦梗死患者血小板PDE3活性進(jìn)一步下降,加強(qiáng)PDE3在腦梗死急性期的保護(hù)作用,有效抑制血小板聚集,改善血液循環(huán)及神經(jīng)功能缺損。耿秀芳等研究表明,銀杏葉單黃酮山奈酚,槲皮素對(duì)ACE的抑制率分別是74%,53%。張愛(ài)林研究表明,復(fù)方銀杏滴丸可以顯著降低模型大鼠腦皮質(zhì)COX-2mRNA表達(dá),影響腦缺血后PAF-COX-2信號(hào)通路在神經(jīng)元損傷中發(fā)揮作用。2.3.2不同低溫狀態(tài)下gbe干預(yù)的效果潛在作用靶點(diǎn)主要是GABA受體、CACN受體、KCN受體、SCN受體等。例如,王何等研究發(fā)現(xiàn),腦缺血后,單純亞低溫干預(yù)及分別在常溫或亞低溫狀態(tài)下給予GBE干預(yù),均使Glu、MDA水平顯著降低,GABA、SOD、GSH-Px水平顯著上調(diào),亞低溫狀態(tài)下GBE干預(yù)的效果更顯著。張緒國(guó)等研究推斷,GBE能明顯縮短APD,抑制心肌細(xì)胞鈣離子通道的開(kāi)放,具有明顯的濃度依賴關(guān)系,可能是其抗心律失常的分子基礎(chǔ)。孫柯等研究發(fā)現(xiàn),銀杏內(nèi)酯能夠降低海馬神經(jīng)元鉀離子通道的電流幅度,可影響鉀離子通道的激活過(guò)程。2.3.3gbe對(duì)大鼠海馬2腎上腺素受體的影響潛在作用靶點(diǎn)主要是ADR受體、5-HT受體等。已有報(bào)道,老年大鼠皮層和海馬部位腎上腺素α2受體較年輕大鼠顯著減少。長(zhǎng)期給GBE后,腎上腺素α2受體顯著增加,并使大鼠皮層區(qū)去甲腎上腺素的更新增加。Caltagirone通過(guò)對(duì)大鼠的實(shí)驗(yàn),讓大鼠持續(xù)服用GBE能夠上調(diào)鼠海馬α2腎上腺素受體,增加大腦皮質(zhì)層去甲腎上腺素受體數(shù)目,而減少β腎上腺素受體的數(shù)目。黃九龍研究結(jié)果提示,銀杏葉總黃酮抑制介導(dǎo)遲慢興奮性后電位產(chǎn)生的5-HT的釋放以及與突觸后膜上相應(yīng)的受體結(jié)合。2.3.4其他疾病的相關(guān)研究潛在作用靶點(diǎn)主要是ER受體。如OhSM等在GBE抗雌激素作用的研究中表明,GBE可作用于核蛋白受體ER。上述預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)除與心腦血管類疾病相關(guān)外,其他一些重要相關(guān)疾病也得到了相關(guān)文獻(xiàn)驗(yàn)證。如朱詩(shī)平等研究表明,銀杏葉提取物片能降低腎間質(zhì)纖維化大鼠的血清肌酐、尿素氮,減少24hMTP,具有腎功能保護(hù)作用,其機(jī)制可能與上調(diào)ACE2蛋白和mRNA表達(dá)水平而發(fā)揮抗腎間質(zhì)纖維化的作用相關(guān)。周燕紅等推測(cè)EGB可能通過(guò)下調(diào)促炎細(xì)胞因子(TNF-A,NF-κBp65,IL-6)來(lái)抑制COX