川白萸中3種香豆素含量測(cè)定

川白萸中3種香豆素含量測(cè)定

白鼠尾是一門(mén)辯證的學(xué)科，具有知縣和蕭山的作用。ethook.f.或杭州慈海a.dahuric（f.a.）尚胡姆，ethook.f.var.var.m（boiss.）shan和yuan的干燥根具有解外寒、驅(qū)風(fēng)止痛、通鼻、除濕、止痛、排膿等功效。白芷作為常用中藥收載于《中國(guó)藥典》2010年版一部,定量指標(biāo)僅歐前胡素一項(xiàng)。異歐前胡素、氧化前胡素也是白芷中的主要活性成分且含量較高,應(yīng)同時(shí)作為其質(zhì)量控制的指標(biāo)才更具合理性。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC測(cè)定白芷中歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素的含量,但由于缺乏其中的對(duì)照品及分析成本過(guò)高等原因,限制了多指標(biāo)成分進(jìn)行質(zhì)量控制的外標(biāo)法的實(shí)際應(yīng)用。“一測(cè)多評(píng)”法作為一種對(duì)多指標(biāo)質(zhì)量控制的有效方法,克服了對(duì)照品短缺這一問(wèn)題,即只測(cè)定某個(gè)代表性成分(易得、廉價(jià)、有效),同時(shí)可計(jì)算出其他待測(cè)有效成分的含量,是一種適合中藥特點(diǎn)的多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)的新模式。本實(shí)驗(yàn)以歐前胡素對(duì)照品作為內(nèi)標(biāo)物,建立其與氧化前胡素、異歐前胡素的相對(duì)校正因子進(jìn)行含量計(jì)算,并考察方法耐用性及系統(tǒng)適用性,以探討“一測(cè)多評(píng)”法在川白芷多指標(biāo)質(zhì)量控制中應(yīng)用的適用性及可行性。1藥品、化學(xué)品與藥品Agilent1100高效液相色譜儀,Agilentchemstation工作站(美國(guó)安捷倫公司);ShimadzuLC-20A高效液相色譜儀,LCsolution工作站(日本島津公司);KQ-100型數(shù)控超聲機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)。對(duì)照品歐前胡素、異歐前胡素均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)分別為110826-200712,110827-201008,氧化前胡素為實(shí)驗(yàn)室自制,HPLC(面積歸一化法)測(cè)定純度>98.5%。甲醇為色譜純,水為高純水,其余試劑均為分析純。川白芷藥材均采自主產(chǎn)地四川省遂寧市、達(dá)州市的不同區(qū)域,共20批,經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)張藝研究員鑒定為傘形科植物杭白芷A.dahuricavar.formosana的干燥根。2結(jié)果與分析2.1方法研究2.1.1流動(dòng)相-水法DikmaDiamonsilC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相甲醇(A)-水(B),梯度洗脫0~5min,55%~65%A;5~12min,65%A;12~30min,65%~83%A;流速1.0mL·min-1;柱溫30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。上述色譜條件下,各組分分離度良好,見(jiàn)圖1。2.1.2混合對(duì)照品溶液精密稱取歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素適量,加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.133,0.042,0.127g·L-1的混合對(duì)照品溶液。2.1.3超聲強(qiáng)化處理取藥材粉末(過(guò)40目篩)約1g,精密稱定,置于50mL錐形瓶,精密加入甲醇25mL,稱重,超聲處理40min,放冷,用甲醇補(bǔ)重,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液經(jīng)0.45μm濾膜濾過(guò),即得。2.1.4進(jìn)樣分析精密吸取上述混合對(duì)照品溶液2,5,10,15,20μL,進(jìn)樣分析,每個(gè)濃度進(jìn)樣3次,取平均值。以進(jìn)樣量對(duì)峰面積積分值進(jìn)行回歸處理,得歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素的回歸方程,結(jié)果表明各化合物在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,見(jiàn)表1。2.1.5采用回歸因子計(jì)算以歐前胡素為內(nèi)標(biāo),按公式,計(jì)算歐前胡素對(duì)異歐前胡素、氧化前胡素的相對(duì)校正因子,結(jié)果見(jiàn)表2。2.1.6儀器精密度試驗(yàn)精密吸取同一混合對(duì)照品溶液10μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素的峰面積,其峰面積的RSD分別為1.2%,2.5%,0.94%,表明儀器精密度良好。2.1.7樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)分別于配制后的0,1,2,4,8,24h,精密吸取同一供試品溶液10μL進(jìn)樣測(cè)定峰面積,歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素穩(wěn)定性的RSD分別為1.2%,2.9%,1.1%,表明處理后的樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.1.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果取同一批藥材粉末(40目)約1g,共6份,精密稱定,按2.1.3項(xiàng)方法制備樣品,測(cè)定歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素的平均含量分別為2.644,0.7733,2.669mg·g-1,RSD分別為1.4%,1.6%,1.9%,表明該方法重復(fù)性良好。2.1.9加樣回收率試驗(yàn)取同一批已知含量的樣品粉末約0.5g,精密稱定,平行6份,分別精密加入一定量的混合對(duì)照品溶液,按2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,測(cè)定并計(jì)算各成分的加樣回收率及RSD,結(jié)果見(jiàn)表3。2.2重建因子的再現(xiàn)研究2.2.1相對(duì)校正因子的確定取2.1.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液,進(jìn)樣2,5,10,15,20μL測(cè)定,按2.1.5項(xiàng)下計(jì)算歐前胡素對(duì)異歐前胡素、氧化前胡素的相對(duì)校正因子。實(shí)驗(yàn)考察了Agilent1200,ShimadzuLC-20A2種高效液相色譜系統(tǒng),DikmaDiamonsilC18(4.6mm×250mm,5μm),DikmaPlatisilODS(4.6mm×250mm,5μm),PhenomenexLunaC18(4.6mm×250mm,5μm),PhenomenexGeminiC18(4.6mm×250mm,5μm),WatersRP18(4.6mm×250mm,5μm)5種色譜柱,相對(duì)校正因子的RSD<0.8%,說(shuō)明相對(duì)校正因子在不同色譜柱和儀器下的耐用性較好,見(jiàn)表4。采用建立的“一測(cè)多評(píng)”試驗(yàn)方法在2個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn),采用DikmaDiamonsilC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),結(jié)果見(jiàn)表5。不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的相對(duì)校正因子相差不大RSD<0.6%,說(shuō)明該方法耐用性較好。2.3組分色譜峰的定位通過(guò)保留時(shí)間差、相對(duì)保留值結(jié)合各組分的紫外吸收特征進(jìn)行待測(cè)組分色譜峰的定位,結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知,各待測(cè)成分的相對(duì)保留值RSD≤5.0%,保留時(shí)間差則差異較大,通過(guò)相對(duì)保留值結(jié)合各色譜峰的紫外吸收特征,可正確判斷出目標(biāo)峰的準(zhǔn)確峰位置。2.4外標(biāo)和外標(biāo)兩種方法所需藥材組分含量的對(duì)比精密吸取供試品溶液10μL注入高效液相色譜儀,測(cè)定。采用“一測(cè)多評(píng)”法與外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算川白芷中歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素的含量,結(jié)果均以干燥品計(jì),見(jiàn)表7。結(jié)果顯示,2種方法所得的各批次藥材的含量不存在顯著性差異。由此說(shuō)明“一測(cè)多評(píng)”法應(yīng)用于川白芷的多成分質(zhì)量評(píng)價(jià)是可行的。3檢測(cè)波長(zhǎng)的確定以甲醇為溶劑,比較超聲、回流提取2種方法,結(jié)果超聲提取效果更好?？疾炝思状?、乙醚2種溶劑對(duì)川白芷中3種香豆素的提取效率的影響,乙醚更易于揮發(fā)對(duì)提取結(jié)果影響較大,故選擇甲醇。以甲醇為溶劑,分別超聲30,40,50min,結(jié)果40,50min均較30min提取完全,40,50min差異不大,故確定以甲醇超聲提取40min,3種香豆素提取率較高,分離度較好,干擾的雜質(zhì)峰較少,且方法簡(jiǎn)單,成本較低。對(duì)歐前胡素、氧化前胡素及異歐前胡素進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,其紫外吸收峰相似,均在250nm處有最大吸收,故選擇250nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。為了驗(yàn)證所建立的3種香豆素成分的一測(cè)多評(píng)法的適用性及可行性,進(jìn)行了方法學(xué)考察,方法耐用性以及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。通過(guò)在Agilent和Shimadzu2臺(tái)液相色譜儀,5根不同品牌及型號(hào)的色譜柱以及2個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室的考察,結(jié)果表明歐前胡素與氧化前胡素、異歐前胡素之間的相對(duì)校正因子具有