脂多糖對hepg2細(xì)胞胰島素抵抗的影響

脂多糖對hepg2細(xì)胞胰島素抵抗的影響

通過大量的研究和實(shí)驗(yàn)，證實(shí)胰島素抵抗（ir）與腸內(nèi)毒素血癥（iet）和非酒精內(nèi)毒素血癥（nad）密切相關(guān)。它是nad形成和發(fā)展的重要標(biāo)志。人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞是一種表型與肝細(xì)胞極為相似的人肝胚胎瘤細(xì)胞株,保留了肝細(xì)胞的許多生物學(xué)特性。其表面表達(dá)高親和力的胰島素受體,受體數(shù)目受胰島素水平的調(diào)節(jié),當(dāng)胰島素受體數(shù)目下調(diào)至一定的程度時(shí),則該細(xì)胞對胰島素的作用產(chǎn)生抵抗,其程度與胰島素水平及刺激持續(xù)的時(shí)間呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M機(jī)體IR的發(fā)病機(jī)制和病理學(xué)特點(diǎn),用生理和超生理濃度的胰島素刺激HepG2細(xì)胞,觀察HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取和糖原等的變化,建立IR模型,并模擬體內(nèi)IETM形成的特點(diǎn),少量多次給予脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激,觀察IR與IETM對肝細(xì)胞的影響。1材料和方法1.1材料和試劑HepG2細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所,本實(shí)驗(yàn)室自行保存?zhèn)鞔鷤溆谩MEM培養(yǎng)基購自Gibco公司,胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程材料有限公司;胰蛋白酶、胰島素、二甲基亞砜(DMSO)、細(xì)胞松弛素B(cytochalasinB)均購自Sigma公司;甘氨酸、牛血清白蛋白(BSA)均購自Amresco公司;LPS(E.coliB5:055)購自Sigma公司;3H-2脫氧葡萄糖(3H-DG)購自北京原子高科核技術(shù)股份有限公司;閃爍純(POPOP)、閃爍體(PPO)購自上海試劑一廠;糖原試劑盒購自南京建成生物工程研究所第一分所。1.2葡萄糖消耗量測定HepG2細(xì)胞以基礎(chǔ)培養(yǎng)液(含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液)于37℃,5%CO2條件下無菌培養(yǎng),取對數(shù)生長期細(xì)胞移至96孔板中用于實(shí)驗(yàn),待細(xì)胞長至80%～90%融合后,更換無血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵育12h。不鋪細(xì)胞的空白孔加入無血清的DMEM培養(yǎng)液;其余各孔則加入無血清的含胰島素培養(yǎng)液及終濃度分別為5×10-5、5×10-6、5×10-7、5×10-8、5×10-9mol/L的胰島素。孵育24h后,用葡萄糖氧化酶法檢測培養(yǎng)液上清的葡萄糖含量。以空白孔為對照,計(jì)算24h葡萄糖消耗量。每組9孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每孔數(shù)值取平均值。根據(jù)所得結(jié)果,選取形成IR的最佳胰島素濃度,并觀察胰島素不同的作用時(shí)間對HepG2細(xì)胞IR的影響。1.3分組、培養(yǎng)和給藥HepG2細(xì)胞以基礎(chǔ)培養(yǎng)液于37℃,5%CO2條件下無菌培養(yǎng),取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞改用含0.5%BSA的低糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)12h后,細(xì)胞分為對照組、模型組、脂多糖組、模型加脂多糖組培養(yǎng)24h。其中對照組仍用基礎(chǔ)培養(yǎng)液,模型組換用含5×10-7mol/L胰島素的培養(yǎng)液,脂多糖組在培養(yǎng)全過程中基礎(chǔ)培養(yǎng)液內(nèi)分別于0、6、12、18h加入1mg/LLPS(共4mg/L),模型加脂多糖組換用脂多糖組的培養(yǎng)液,同時(shí)加入終濃度為5×10-7mol/L的胰島素,每組9孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每孔數(shù)值取平均值。1.4各組細(xì)胞總蛋白的含量細(xì)胞每組設(shè)平行孔9個(gè),于96孔板培養(yǎng)24h后Braford微量法檢測各組細(xì)胞總蛋白的含量。吸取培養(yǎng)24h后的各組細(xì)胞培養(yǎng)液,蒽酮法檢測細(xì)胞內(nèi)糖原含量。計(jì)算公式如下:糖原含量=[樣品光密度值/標(biāo)準(zhǔn)光密度值×標(biāo)準(zhǔn)品糖原含量(mg×10-2)]/蛋白含量(mg)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每孔數(shù)值取平均值。1.5處理及研磨法制備細(xì)胞爬片,采用PAS染色法進(jìn)行糖原染色。具體步驟為:取各組細(xì)胞爬片,95%乙醇固定10min,蒸餾水洗3次;TritonX-100作用15min,蒸餾水洗3次;1%高碘酸水溶液15min,蒸餾水洗3次;Schiff液30min,偏亞硫酸鈉水溶液洗3次,每次3min,蒸餾水洗數(shù)次;Harris氏蘇木素復(fù)染片刻,蒸餾水洗3次;鹽酸酒精1min,自來水洗返藍(lán);濃度遞增的乙醇梯度脫水,二甲苯透明,樹膠封固于載玻片上。顯微鏡下觀察,拍攝照片。1.6基礎(chǔ)特異性轉(zhuǎn)運(yùn)與胰島素刺激活性的檢測參照文獻(xiàn)方法檢測各組細(xì)胞對葡萄糖的攝取。具體方法為:分組加藥后以含0.5%BSA的低糖DMEM37℃孵育2h,制備細(xì)胞懸液按組轉(zhuǎn)入各反應(yīng)管中。每樣品制備4個(gè)反應(yīng)管,分別測定基礎(chǔ)狀態(tài)(無胰島素刺激,加/不加細(xì)胞松弛素B)和胰島素刺激下(加/不加細(xì)胞松弛素B)的細(xì)胞對葡萄糖的攝取。向試管中加入含0.1%BSA的KRHB作為胰島素的對照或200nmol/L胰島素各50μL;同時(shí)為測定細(xì)胞表面或細(xì)胞間隙中葡萄糖非特異轉(zhuǎn)運(yùn),另要立即加終濃度為5μmol/L的細(xì)胞松弛素B2μL,以防止葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)彌散,對照管加10%乙醇2μL;加入4μCi/mL的3H-DG50μL,使反應(yīng)體系總放射量為0.2μCi,總體積為152μL,37℃搖動(dòng)水浴15min后加入預(yù)冷的KRHB終止反應(yīng)。將試管用預(yù)冷的KRHB洗滌,3000r/min離心7mim吸棄上清,重復(fù)3次;加入裂解液0.1%SDS0.2mL混勻,加入12mL閃爍液,避光放置12h,用液閃譜儀計(jì)數(shù)其每分鐘衰變值(單位為cpm)。每樣品重復(fù)檢測3次,取平均值。按如下公式計(jì)算得到基礎(chǔ)特異性轉(zhuǎn)運(yùn)或胰島素刺激的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)的放射活性,再用與對照組的比例來表示。特異性轉(zhuǎn)運(yùn)=總放射活性(不加細(xì)胞松弛素B)-非特異性放射活性(加細(xì)胞松弛素B)。1.7組患者獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、多組間比較所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±sxˉ±s)表示。2組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較用單因素方差分析,P<0.05為差異有顯著性。使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果2.1不同菌株對葡萄糖的汲取實(shí)驗(yàn)與對照組比較,模型組的胰島素濃度由5×10-9mol/L增加到5×10-5mol/L時(shí),模型組對葡萄糖的攝取逐漸減少,使培養(yǎng)液中的葡萄糖消耗量逐漸降低,5×10-7mol/L時(shí)達(dá)到最小(P<0.01),結(jié)果見表1。2.2胰島素作用時(shí)間在5×10-7mol/L的胰島素不同作用時(shí)間內(nèi),隨著胰島素作用時(shí)間的延長,模型組對葡萄糖的攝取均比對照組低,胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)則從24h開始持續(xù)到48h,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異均具有顯著性(P<0.01),結(jié)果見表2。2.3組患者的基礎(chǔ)特異性轉(zhuǎn)運(yùn)情況脂多糖組與對照組相比,無論是基礎(chǔ)特異性轉(zhuǎn)運(yùn),還是胰島素刺激的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。模型加脂多糖組的基礎(chǔ)特異性轉(zhuǎn)運(yùn)比對照組明顯降低(P<0.01);胰島素刺激的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)不僅比對照組低(P<0.01),而且比模型組低(P<0.01),結(jié)果見表3。2.4比較兩組患者的統(tǒng)計(jì)學(xué)特征脂多糖組培養(yǎng)液內(nèi)的糖原含量與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);模型加脂多糖組與對照組相比明顯下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),結(jié)果見表4。2.5脂多糖對糖原顆粒的影響PAS染色觀察,各組細(xì)胞胞漿內(nèi)紅色的糖原顆粒,脂多糖組與對照組比仍然較多,而模型加脂多糖組的糖原顆粒與模型組相比更為少見,見圖1(彩圖見插頁2)。3復(fù)方中藥降脂平肝湯對大鼠肝臟作用的模擬胰島素刺激的葡萄糖攝取障礙是IR的主要特征,利用細(xì)胞對同位素標(biāo)記的葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn),可以準(zhǔn)確地評價(jià)細(xì)胞對胰島素刺激的葡萄糖攝取和利用能力,即胰島素的敏感性,從而判斷是否存在IR。本實(shí)驗(yàn)采用3H-DG轉(zhuǎn)運(yùn)的測定方法,通過加入細(xì)胞松弛素B作為對照,去除了葡萄糖非特異轉(zhuǎn)運(yùn)的因素,所得結(jié)果為葡萄糖的特異性轉(zhuǎn)運(yùn),因此,本實(shí)驗(yàn)采用的是公認(rèn)的鑒定細(xì)胞水平IR的特異性方法。本實(shí)驗(yàn)以5×10-7mol/L的胰島素作用于HepG2細(xì)胞24h成功復(fù)制胰島素抵抗模型,適用于胰島素相關(guān)機(jī)制的研究。研究表明,脂肪肝的發(fā)生發(fā)展與IETM和IR均密切相關(guān)。肝臟是體內(nèi)清除內(nèi)毒素和解毒的主要臟器,也是遭受內(nèi)毒素攻擊的首要器官。因此,抑制IETM,控制IR可能是防治脂肪肝并阻止其繼續(xù)進(jìn)展的有效措施。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M體內(nèi)IETM形成的特點(diǎn),少量多次給予LPS直接作用于肝細(xì)胞,對HepG2細(xì)胞IR的發(fā)生作用并不明顯,而當(dāng)以上刺激作用于同時(shí)給予高胰島素刺激產(chǎn)生IR的HepG2細(xì)胞時(shí),細(xì)胞發(fā)生的IR比單純高胰島素刺激更為強(qiáng)烈,提示IETM可加重HepG2細(xì)胞的IR,脂多糖是脂肪肝發(fā)病的觸發(fā)因子。脂肪肝屬中醫(yī)“痰濁”“肥胖”“積聚”“濕阻”等范疇,本病的基本病機(jī)為痰瘀互結(jié),多因過食肥甘厚味,脾失健運(yùn),致使脾虛濕阻、痰濁瘀血互結(jié),痹阻肝臟脈絡(luò)而成,故應(yīng)以健脾化痰利濕、活血化瘀、通腑降濁為治療原則。筆者前期的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)復(fù)方中藥降脂平肝湯具有防治脂肪肝的作用。本方采用