利用褐藻膠降解寡糖制備抑菌菌

利用褐藻膠降解寡糖制備抑菌菌

目前，抗菌素的廣泛應用對環(huán)境造成了嚴重的污染。由于突變，細菌的耐藥性產(chǎn)生了抗藥性，耐藥性水平逐漸提高。大多數(shù)細菌都獲得了抗藥性基因。解決這一日趨嚴重問題的主要對策,就是開發(fā)研制對耐藥菌株有效的新藥和新制劑以逐步代替抗菌素的大量使用。褐藻膠寡糖是由褐藻膠經(jīng)過一定方法降解而成了的聚合度在3~10之間的寡糖分子,其具有溶解性強、穩(wěn)定性好、易被機體吸收等優(yōu)點。近年來,褐藻膠寡糖的生理活性不斷被揭示,尤其在促生長作用、增強機體免疫功能、抗腫瘤和對神經(jīng)元損傷的保護作用等方面的研究很多,但是有關褐藻膠寡糖對真菌和細菌進行抑菌活性的研究報道較少。因此,優(yōu)選褐藻膠寡糖的最佳降解條件,同時對褐藻膠寡糖對真菌和細菌進行抑菌活性的研究,將能為褐藻膠寡糖在抗菌藥物上的應用研究奠定基礎,并提供一定的實驗及理論參考依據(jù)。1材料和方法1.1試劑及培養(yǎng)基供試菌種金黃色葡萄球菌1.72、大腸桿菌1.543購于中國普通菌種保藏中心,藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、青霉曲霉、啤酒酵母由上海水產(chǎn)大學食品學院微生物研究室提供。供試試劑有海藻酸鈉(化學純,國藥集團產(chǎn)品)、30%過氧化氫(分析純)、NaCl(分析純)、無水乙醇(分析純)、普通營養(yǎng)瓊脂,PDA培養(yǎng)基等。試驗使用的儀器有85-2型磁力攪拌器、烏氏粘度計(毛細管內(nèi)徑0.5~0.6mm)、電子秒表、恒溫水浴(自制,帶有攪拌裝置,恒溫±0.05℃)、HHS-2型恒溫水浴鍋、S-3C型pH計、SHZ-3循環(huán)水真空泵、布氏漏斗、CS101-24電熱鼓風干燥箱、無菌操作臺、滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、游標卡尺、牛津杯(內(nèi)徑6mm)、微孔濾膜(孔徑0.22μm)、過濾器等。1.2測試方法1.2.1降解反應條件的確定取一定量的褐藻膠干粉,加適量蒸餾水于磁力攪拌器緩慢攪拌下均勻溶解,使褐藻膠溶液終濃度為每100mL溶液中含褐藻膠1.25g。設反應溫度分別為40℃、60℃、80℃,過氧化氫體積百分比濃度分別為3%、5%。反應中不斷緩慢攪拌,在反應過程的0、0.5、1.0、1、5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5h分別取出部分反應液,冷卻至室溫后加入無水乙醇進行醇析,真空抽濾后將所得沉淀鋪于培養(yǎng)皿中,置于50~60℃鼓風干燥箱內(nèi)烘干。當褐藻膠分子量降到足夠低,乙醇難以醇析出時,將反應液置于50℃~60℃鼓風干燥箱內(nèi)烘干,研磨成粉末備用。每種降解反應條件2個重復,取平均值。采用粘度法測定不同降解條件下寡糖的特性粘度,根據(jù)Donnan經(jīng)驗公式即聚合物的平均聚合度(DP)和特性粘度(η)的關系為:DP=58×(η),計算出平均聚合度,繪出降解曲線圖,以平均聚合度低于10的寡糖為目標產(chǎn)物,優(yōu)選出最佳降解條件。1.2.2抑菌圈測定(1)培養(yǎng)基配置:培養(yǎng)基按常規(guī)方法配置,其中普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細菌的培養(yǎng),PDA培養(yǎng)基用于真菌的培養(yǎng)。(2)菌種活化及培養(yǎng):細菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24h。真菌接種于PDA培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)72h。每種菌傳代2次后進行活化。(3)樣品溶液制備:取褐藻膠干粉及最佳降解條件下獲得的寡糖干粉適量,無菌蒸餾水充分溶解,用無菌微孔濾膜過濾不溶物后備用(褐藻膠不需過濾)。(4)菌懸液的制備:挑取1環(huán)已活化好的菌種,放入9mL無菌生理鹽水中,震蕩均勻,制得系列菌懸液。菌濃度107~108cfu/mL,備用。(5)樣品液抑菌效果測定:采用管碟法,通過觀察抑菌圈大小來考察寡糖抑菌效果。預實驗確定糖液濃度,確保抑菌圈大小適中。在超凈工作臺中,以無菌吸管移取1mL菌懸液于無菌培養(yǎng)皿中,再移入20mL溫度為45℃的培養(yǎng)基,充分混勻,冷卻凝固后,用記號筆在皿底以圓心為中心劃“十”字,分別在1/4區(qū)域依次標注生理鹽水、寡糖、苯甲酸鈉、寡糖等記號。然后,在各1/4區(qū)域的正中央烙上無菌牛津杯,按皿底標注分別注入相同濃度的寡糖溶液、苯甲酸鈉溶液和無菌生理鹽水,直至加滿為止。每組重復3次。將培養(yǎng)皿正置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h,觀察抑菌圈大小,并用游標卡尺測量抑菌圈直徑(精確到0.02mm)。(6)最低抑菌濃度(MIC)測定:對能產(chǎn)生明顯抑菌圈的菌種進一步進行最低抑菌濃度的測定。利用2倍逐級稀釋法,將樣品溶液稀釋為10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.3125%。分別向平皿中移入上述濃度的樣品溶液1mL,并移入濃度為108cfu/mL的枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母5種菌懸液各0.2mL,加20mL溫度為45℃的培養(yǎng)基,混合均勻,冷卻凝固后倒置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h,觀察生長情況。2結果與分析2.1褐藻膠的降解曲線經(jīng)粘度法測定褐藻膠的平均聚合度為474。在不同溫度(40℃、60℃、80℃)、不同過氧化氫體積百分比濃度(3%、5%)下,經(jīng)不同時間的降解,得到降解程度不同的寡糖混合物。采用粘度法測這些寡糖的特性粘度(η),由Donnan經(jīng)驗公式進一步算出寡糖的平均聚合度DP。根據(jù)各樣品的平均聚合度繪制出褐藻膠在不同降解條件下的降解曲線,結果見圖1和圖2。從圖1和圖2可以看出,在降解反應開始的0.5h內(nèi),由于過氧化氫濃度大,在本試驗設定的條件下反應速度很快,聚合度下降迅速;隨著降解反應時間推進和過氧化氫消耗,1h后降解速度趨于平緩,2h后聚合度基本保持不變,當過氧化氫耗盡時,反應基本完成。從圖1和圖2還可以看出,在高溫條件下,由于過氧化氫分解快,降解作用維持的時間短。在溫度為40℃和60℃、過氧化氫濃度為3%和5%條件下,褐藻膠經(jīng)過3.5h的降解仍得不到平均聚合度10以內(nèi)的寡糖,在溫度80℃、過氧化氫濃度為3%和5%條件下,褐藻膠經(jīng)過1.5h的降解后均可獲得平均聚合度10以下的寡糖。為了節(jié)約時間,降低成本,盡量減少過氧化氫的殘留,本研究選擇溫度80℃、過氧化氫濃度3%條件下降解1.5~2h為獲得平均聚合度10以下寡糖的最佳降解條件。2.2褐藻膠寡糖抑菌圈的測定經(jīng)48h培養(yǎng)后,樣品液對不同菌的抑制效果見圖3。用游標卡尺測量抑菌圈大小,結果褐藻膠寡糖對細菌的抑菌圈大小見表1,褐藻膠寡糖對真菌的抑菌圈大小見表2。從圖3、表1和表2可以看出:(1)褐藻膠寡糖對細菌均產(chǎn)生明顯的抑菌圈,真菌中僅對啤酒酵母產(chǎn)生較小的抑菌圈,且對照組的生理鹽水和相同濃度的苯甲酸鈉均不產(chǎn)生抑菌圈。說明在相同濃度情況下,褐藻膠寡糖對以上7種菌的抑菌效果強于苯甲酸鈉。(2)比較抑菌圈直徑大小發(fā)現(xiàn),在2.5%寡糖濃度下,藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈最大,枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌圈次之,而在5%的較大寡糖濃度下,啤酒酵母產(chǎn)生的抑菌圈卻更小,青霉和黑曲霉均不產(chǎn)生抑菌圈。說明褐藻膠寡糖對藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌的生長抑制作用最強,對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的生長抑制作用次之,對真菌的抑制作用不理想。2.3褐藻膠寡糖對酵母菌生長的影響最低抑菌濃度(MIC)是指抑制細菌生長所需的最低濃度。經(jīng)48h的培養(yǎng)后,觀察在不同濃度褐藻膠寡糖下細菌和真菌的生長情況,結果見表3。從表3可以看出,較低濃度的褐藻膠寡糖即可抑制細菌生長。據(jù)測定,褐藻膠寡糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌的最低抑菌濃度僅需0.625%,對枯草芽孢桿菌最低抑菌濃度需2.5%,對啤酒酵母的最低抑菌濃度則高達10%。最低抑菌濃度與抑菌圈結果基本一致。對照組中的褐藻膠由于溶解度小,粘度太大,不能有效擴散進入培養(yǎng)基中,可能影響其抑菌效果,限制了其在抑菌方面的應用。3褐藻膠寡糖降解過氧化氫的最佳條件確定過氧化氫在酸性環(huán)境中氧化能力較強且反應速度較慢,本研究利用褐藻膠自身的微酸環(huán)境來進行過氧化氫的氧化降解。過氧化氫具有強大的漂白作用,可以使各種色素消失,制得外觀潔白的產(chǎn)品;此外,過氧化氫極易分解、揮發(fā),尤其在高溫下分解更快,可以有效避免過氧化氫在產(chǎn)品中的殘留,在反應過程中不生成諸如鹽分等其他雜質(zhì),簡化了后續(xù)步驟,降解速度快,效率較高,三廢污染低,比酸降解更為優(yōu)越。本研究結果表明,過氧化氫體積百分比濃度3%、溫度80