利用褐藻膠降解寡糖制備抑菌菌

利用褐藻膠降解寡糖制備抑菌菌

目前，抗菌素的廣泛應(yīng)用對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染。由于突變，細(xì)菌的耐藥性產(chǎn)生了抗藥性，耐藥性水平逐漸提高。大多數(shù)細(xì)菌都獲得了抗藥性基因。解決這一日趨嚴(yán)重問題的主要對(duì)策,就是開發(fā)研制對(duì)耐藥菌株有效的新藥和新制劑以逐步代替抗菌素的大量使用。褐藻膠寡糖是由褐藻膠經(jīng)過一定方法降解而成了的聚合度在3~10之間的寡糖分子,其具有溶解性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、易被機(jī)體吸收等優(yōu)點(diǎn)。近年來,褐藻膠寡糖的生理活性不斷被揭示,尤其在促生長作用、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤和對(duì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用等方面的研究很多,但是有關(guān)褐藻膠寡糖對(duì)真菌和細(xì)菌進(jìn)行抑菌活性的研究報(bào)道較少。因此,優(yōu)選褐藻膠寡糖的最佳降解條件,同時(shí)對(duì)褐藻膠寡糖對(duì)真菌和細(xì)菌進(jìn)行抑菌活性的研究,將能為褐藻膠寡糖在抗菌藥物上的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ),并提供一定的實(shí)驗(yàn)及理論參考依據(jù)。1材料和方法1.1試劑及培養(yǎng)基供試菌種金黃色葡萄球菌1.72、大腸桿菌1.543購于中國普通菌種保藏中心,藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、青霉曲霉、啤酒酵母由上海水產(chǎn)大學(xué)食品學(xué)院微生物研究室提供。供試試劑有海藻酸鈉(化學(xué)純,國藥集團(tuán)產(chǎn)品)、30%過氧化氫(分析純)、NaCl(分析純)、無水乙醇(分析純)、普通營養(yǎng)瓊脂,PDA培養(yǎng)基等。試驗(yàn)使用的儀器有85-2型磁力攪拌器、烏氏粘度計(jì)(毛細(xì)管內(nèi)徑0.5~0.6mm)、電子秒表、恒溫水浴(自制,帶有攪拌裝置,恒溫±0.05℃)、HHS-2型恒溫水浴鍋、S-3C型pH計(jì)、SHZ-3循環(huán)水真空泵、布氏漏斗、CS101-24電熱鼓風(fēng)干燥箱、無菌操作臺(tái)、滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、游標(biāo)卡尺、牛津杯(內(nèi)徑6mm)、微孔濾膜(孔徑0.22μm)、過濾器等。1.2測試方法1.2.1降解反應(yīng)條件的確定取一定量的褐藻膠干粉,加適量蒸餾水于磁力攪拌器緩慢攪拌下均勻溶解,使褐藻膠溶液終濃度為每100mL溶液中含褐藻膠1.25g。設(shè)反應(yīng)溫度分別為40℃、60℃、80℃,過氧化氫體積百分比濃度分別為3%、5%。反應(yīng)中不斷緩慢攪拌,在反應(yīng)過程的0、0.5、1.0、1、5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5h分別取出部分反應(yīng)液,冷卻至室溫后加入無水乙醇進(jìn)行醇析,真空抽濾后將所得沉淀鋪于培養(yǎng)皿中,置于50~60℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干。當(dāng)褐藻膠分子量降到足夠低,乙醇難以醇析出時(shí),將反應(yīng)液置于50℃~60℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干,研磨成粉末備用。每種降解反應(yīng)條件2個(gè)重復(fù),取平均值。采用粘度法測定不同降解條件下寡糖的特性粘度,根據(jù)Donnan經(jīng)驗(yàn)公式即聚合物的平均聚合度(DP)和特性粘度(η)的關(guān)系為:DP=58×(η),計(jì)算出平均聚合度,繪出降解曲線圖,以平均聚合度低于10的寡糖為目標(biāo)產(chǎn)物,優(yōu)選出最佳降解條件。1.2.2抑菌圈測定(1)培養(yǎng)基配置:培養(yǎng)基按常規(guī)方法配置,其中普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌的培養(yǎng),PDA培養(yǎng)基用于真菌的培養(yǎng)。(2)菌種活化及培養(yǎng):細(xì)菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24h。真菌接種于PDA培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)72h。每種菌傳代2次后進(jìn)行活化。(3)樣品溶液制備:取褐藻膠干粉及最佳降解條件下獲得的寡糖干粉適量,無菌蒸餾水充分溶解,用無菌微孔濾膜過濾不溶物后備用(褐藻膠不需過濾)。(4)菌懸液的制備:挑取1環(huán)已活化好的菌種,放入9mL無菌生理鹽水中,震蕩均勻,制得系列菌懸液。菌濃度107~108cfu/mL,備用。(5)樣品液抑菌效果測定:采用管碟法,通過觀察抑菌圈大小來考察寡糖抑菌效果。預(yù)實(shí)驗(yàn)確定糖液濃度,確保抑菌圈大小適中。在超凈工作臺(tái)中,以無菌吸管移取1mL菌懸液于無菌培養(yǎng)皿中,再移入20mL溫度為45℃的培養(yǎng)基,充分混勻,冷卻凝固后,用記號(hào)筆在皿底以圓心為中心劃“十”字,分別在1/4區(qū)域依次標(biāo)注生理鹽水、寡糖、苯甲酸鈉、寡糖等記號(hào)。然后,在各1/4區(qū)域的正中央烙上無菌牛津杯,按皿底標(biāo)注分別注入相同濃度的寡糖溶液、苯甲酸鈉溶液和無菌生理鹽水,直至加滿為止。每組重復(fù)3次。將培養(yǎng)皿正置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h,觀察抑菌圈大小,并用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑(精確到0.02mm)。(6)最低抑菌濃度(MIC)測定:對(duì)能產(chǎn)生明顯抑菌圈的菌種進(jìn)一步進(jìn)行最低抑菌濃度的測定。利用2倍逐級(jí)稀釋法,將樣品溶液稀釋為10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.3125%。分別向平皿中移入上述濃度的樣品溶液1mL,并移入濃度為108cfu/mL的枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母5種菌懸液各0.2mL,加20mL溫度為45℃的培養(yǎng)基,混合均勻,冷卻凝固后倒置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h,觀察生長情況。2結(jié)果與分析2.1褐藻膠的降解曲線經(jīng)粘度法測定褐藻膠的平均聚合度為474。在不同溫度(40℃、60℃、80℃)、不同過氧化氫體積百分比濃度(3%、5%)下,經(jīng)不同時(shí)間的降解,得到降解程度不同的寡糖混合物。采用粘度法測這些寡糖的特性粘度(η),由Donnan經(jīng)驗(yàn)公式進(jìn)一步算出寡糖的平均聚合度DP。根據(jù)各樣品的平均聚合度繪制出褐藻膠在不同降解條件下的降解曲線,結(jié)果見圖1和圖2。從圖1和圖2可以看出,在降解反應(yīng)開始的0.5h內(nèi),由于過氧化氫濃度大,在本試驗(yàn)設(shè)定的條件下反應(yīng)速度很快,聚合度下降迅速;隨著降解反應(yīng)時(shí)間推進(jìn)和過氧化氫消耗,1h后降解速度趨于平緩,2h后聚合度基本保持不變,當(dāng)過氧化氫耗盡時(shí),反應(yīng)基本完成。從圖1和圖2還可以看出,在高溫條件下,由于過氧化氫分解快,降解作用維持的時(shí)間短。在溫度為40℃和60℃、過氧化氫濃度為3%和5%條件下,褐藻膠經(jīng)過3.5h的降解仍得不到平均聚合度10以內(nèi)的寡糖,在溫度80℃、過氧化氫濃度為3%和5%條件下,褐藻膠經(jīng)過1.5h的降解后均可獲得平均聚合度10以下的寡糖。為了節(jié)約時(shí)間,降低成本,盡量減少過氧化氫的殘留,本研究選擇溫度80℃、過氧化氫濃度3%條件下降解1.5~2h為獲得平均聚合度10以下寡糖的最佳降解條件。2.2褐藻膠寡糖抑菌圈的測定經(jīng)48h培養(yǎng)后,樣品液對(duì)不同菌的抑制效果見圖3。用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈大小,結(jié)果褐藻膠寡糖對(duì)細(xì)菌的抑菌圈大小見表1,褐藻膠寡糖對(duì)真菌的抑菌圈大小見表2。從圖3、表1和表2可以看出:(1)褐藻膠寡糖對(duì)細(xì)菌均產(chǎn)生明顯的抑菌圈,真菌中僅對(duì)啤酒酵母產(chǎn)生較小的抑菌圈,且對(duì)照組的生理鹽水和相同濃度的苯甲酸鈉均不產(chǎn)生抑菌圈。說明在相同濃度情況下,褐藻膠寡糖對(duì)以上7種菌的抑菌效果強(qiáng)于苯甲酸鈉。(2)比較抑菌圈直徑大小發(fā)現(xiàn),在2.5%寡糖濃度下,藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈最大,枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌圈次之,而在5%的較大寡糖濃度下,啤酒酵母產(chǎn)生的抑菌圈卻更小,青霉和黑曲霉均不產(chǎn)生抑菌圈。說明褐藻膠寡糖對(duì)藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌的生長抑制作用最強(qiáng),對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的生長抑制作用次之,對(duì)真菌的抑制作用不理想。2.3褐藻膠寡糖對(duì)酵母菌生長的影響最低抑菌濃度(MIC)是指抑制細(xì)菌生長所需的最低濃度。經(jīng)48h的培養(yǎng)后,觀察在不同濃度褐藻膠寡糖下細(xì)菌和真菌的生長情況,結(jié)果見表3。從表3可以看出,較低濃度的褐藻膠寡糖即可抑制細(xì)菌生長。據(jù)測定,褐藻膠寡糖對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌的最低抑菌濃度僅需0.625%,對(duì)枯草芽孢桿菌最低抑菌濃度需2.5%,對(duì)啤酒酵母的最低抑菌濃度則高達(dá)10%。最低抑菌濃度與抑菌圈結(jié)果基本一致。對(duì)照組中的褐藻膠由于溶解度小,粘度太大,不能有效擴(kuò)散進(jìn)入培養(yǎng)基中,可能影響其抑菌效果,限制了其在抑菌方面的應(yīng)用。3褐藻膠寡糖降解過氧化氫的最佳條件確定過氧化氫在酸性環(huán)境中氧化能力較強(qiáng)且反應(yīng)速度較慢,本研究利用褐藻膠自身的微酸環(huán)境來進(jìn)行過氧化氫的氧化降解。過氧化氫具有強(qiáng)大的漂白作用,可以使各種色素消失,制得外觀潔白的產(chǎn)品;此外,過氧化氫極易分解、揮發(fā),尤其在高溫下分解更快,可以有效避免過氧化氫在產(chǎn)品中的殘留,在反應(yīng)過程中不生成諸如鹽分等其他雜質(zhì),簡化了后續(xù)步驟,降解速度快,效率較高,三廢污染低,比酸降解更為優(yōu)越。本研究結(jié)果表明,過氧化氫體積百分比濃度3%、溫度80