牛體外受精技術(shù)的研究進(jìn)展

牛體外受精技術(shù)的研究進(jìn)展

動(dòng)物繁殖技術(shù)是生物技術(shù)的一個(gè)重要分支。繁殖技術(shù)從20世紀(jì)50年代人工授精技術(shù)到20世紀(jì)70年代胚胎移植技術(shù)的應(yīng)用，似乎才真正開始動(dòng)物繁殖技術(shù)的新紀(jì)元。牛的繁殖技術(shù)在過去的50年里取得了顯著進(jìn)展，這是一個(gè)以人工授精起始的連續(xù)過程。隨著體外受精、精子分離和核移植（克?。┑燃夹g(shù)的發(fā)展，這些連續(xù)性的繁殖技術(shù)將是目前和未來提高生產(chǎn)力的強(qiáng)有力手段。1其他方面的研究自1982年以來，家畜體外受精技術(shù)，尤其是牛體外受精(IVF)技術(shù)的發(fā)展十分迅速，僅僅10年時(shí)間，就已從理論上、方法上得到充分的完善和發(fā)展，成為動(dòng)物胚胎工程及細(xì)胞工程領(lǐng)域內(nèi)的一個(gè)基本和重要的研究分支，并從20世紀(jì)80年代末就開始進(jìn)入應(yīng)用階段。牛IVF技術(shù)的主要環(huán)節(jié)包括：(1)屠宰牛卵巢卵母細(xì)胞的采集、保存和運(yùn)輸。(2)卵巢卵母細(xì)胞的采集：利用注射器吸取或其他方法，將未成熟的卵母細(xì)胞從可見卵泡中取出，然后在顯微鏡下選擇卵丘細(xì)胞層完整的正常卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)。(3)卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)(IVM)：將處于生發(fā)泡期的未成熟卵在添加激素或血清的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)至成熟階段，進(jìn)行體外受精。(4)精子的體外獲能處理：體外條件下利用化學(xué)藥物(IA、咖啡因及肝素等)使精子達(dá)到獲能狀態(tài)。(5)受精處理：把培養(yǎng)成熟的卵子和獲能處理好的精子放在一起培養(yǎng)，使其在體外條件下完成受精過程。(6)受精卵的體外發(fā)育培養(yǎng)(IVC)：通過一系列培養(yǎng)條件的探索，使受精卵發(fā)育到桑椹胚和囊胚階段。(7)發(fā)育胚胎的冷凍保存。(8)胚胎的質(zhì)量評(píng)定。(9)胚胎移植：這是體外受精技術(shù)的最終目的。(10)受體牛的妊娠診斷和管理。由于牛IVF技術(shù)在養(yǎng)牛業(yè)上的巨大應(yīng)用潛力，世界上許多發(fā)達(dá)國(guó)家均投入大量的人力和財(cái)力進(jìn)行了牛IVF胚的開發(fā)性研究，從而促使牛IVF技術(shù)從實(shí)驗(yàn)研究開始走向商品化應(yīng)用。目前世界上在這項(xiàng)技術(shù)上投入力量最大的有日本、美國(guó)、英國(guó)，中國(guó)和丹麥也做了大量工作。在20世紀(jì)90年代中葉，美國(guó)、加拿大和歐洲（主要是德國(guó)、意大利、法國(guó)和荷蘭）就出現(xiàn)了IVF商業(yè)化應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)室。幾年后，在南美洲（如巴西和阿根廷）和大洋州（如澳大利亞和新西蘭）也建立了這樣的實(shí)驗(yàn)室。采用超聲波掃描經(jīng)陰道活體采集卵母細(xì)胞技術(shù)（OPU）的應(yīng)用加速了IVF在活體家畜上的應(yīng)用。目前，對(duì)供體牛采卵有2種方法：其一是對(duì)供體牛不做任何處理，每周采卵1次；其二是對(duì)供體牛進(jìn)行激素處理，使之有更多的中、小卵泡出現(xiàn)后再進(jìn)行采卵。經(jīng)激素處理供體牛的效果明顯優(yōu)于不處理。IVF商業(yè)化應(yīng)用的最初目的是從母畜體內(nèi)獲得成活的胚胎而不使用傳統(tǒng)技術(shù)來受孕。目前，IVF是胚胎移植（ET）程序的一部分。它主要應(yīng)用于那些發(fā)情處理較為困難、不能生產(chǎn)可移植胚胎的母畜或者是在繁殖期間出現(xiàn)異常的母畜（如卵巢粘連或輸卵管阻塞）。IVF也應(yīng)用于由于年齡、突發(fā)狀況、疾病等造成的繁殖障礙的母畜，以及在妊娠期前3個(gè)月內(nèi)的懷孕小母牛或成年母牛。IVF還應(yīng)用于正常繁殖周期的小母牛和成年母牛以及發(fā)情期前的犢牛。商業(yè)性機(jī)構(gòu)和研究機(jī)構(gòu)已將OPU-IVF技術(shù)應(yīng)用于不同類型的母畜（包括初情期前的犢牛、小母牛、成年母牛），不同年齡的母畜（包括初情期前、初情期后和適齡母牛），不同品種，不同繁殖周期（間期、妊娠期和分娩后），不同采卵頻率（1周1次、1周2次、1個(gè)月2次），不同激素處理（FSH,nBST）和不同的IVF過程（BRL細(xì)胞共培養(yǎng)，化學(xué)限定培養(yǎng)液，血清），并獲得不同程度的成功。IVF技術(shù)可提高精子使用效率。在精子細(xì)胞內(nèi)注射（ICSI）技術(shù)未廣泛應(yīng)用于牛IVF商業(yè)化生產(chǎn)之前，IVF技術(shù)就為使用相對(duì)少量精子生產(chǎn)成活胚胎提供了條件。這使精子利用率更高，并為精子性別分離提供重要條件。從1992年到2000年，使用的胚胎培養(yǎng)液從TCM-199培養(yǎng)液到與BRL細(xì)胞共培養(yǎng)的MenezoB2培養(yǎng)液，其中加入10%胎牛血清（FCS）來培養(yǎng)胚胎。從2001年開始，培養(yǎng)系統(tǒng)改為SOF的檸檬酸鹽半限制性培養(yǎng)液（添加5%FCS）從而避免或減少出現(xiàn)犢牛體型過大綜合征的危險(xiǎn)。在SOF系統(tǒng)中培養(yǎng)的第6.5d才觀察培養(yǎng)皿內(nèi)胚胎的發(fā)育狀況，培養(yǎng)箱內(nèi)的條件是5%的O2、6%的CO2、和89%的N2，并保持較高濕度。由于胚胎體外冷凍的不良效果，通常采用鮮胚進(jìn)行移植。可能是由于培養(yǎng)條件或受精程序造成胚胎對(duì)外界條件較為敏感。IVF技術(shù)的應(yīng)用效果受很多因素的影響，其中主要因素是供體的狀態(tài)，卵母細(xì)胞的質(zhì)量和將胚胎從合子培養(yǎng)到囊胚期的技術(shù)。盡管IVF技術(shù)從應(yīng)用到動(dòng)物育種上開始至今，這項(xiàng)技術(shù)已有較大發(fā)展，但仍有許多改進(jìn)之處，包括提高卵母細(xì)胞和胚胎的活性，減少培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)犢牛出生大小的影響，提高卵母細(xì)胞的質(zhì)量，成功使用性別分離后的精子，ICSI技術(shù)以及腔前卵泡的培養(yǎng)，這些方面將是最近及未來研究的主要方向。2體外法性別鑒定與性別分離肉牛生產(chǎn)者和牛產(chǎn)業(yè)中一直都對(duì)性別預(yù)測(cè)給予廣泛關(guān)注。精子性別分離處理后可以通過生產(chǎn)期望性別的個(gè)體從而增加奶牛和肉牛業(yè)的效益，并能充分滿足市場(chǎng)和商業(yè)化生產(chǎn)的需要。最典型的例子是生產(chǎn)奶牛的母犢以及肉牛生產(chǎn)中所需的公犢。對(duì)于牛育種者和精子人工授精公司，可應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)在小范圍母牛群內(nèi)選育出優(yōu)秀公牛。精子性別鑒定常采用DNA含量的方法；胚胎性別鑒定方法包括活體檢查與PCR、免疫熒光法等；對(duì)胎兒性別鑒定常采用妊娠60～90d超聲波檢查的方法。應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)時(shí)大多得到滿意的結(jié)果，準(zhǔn)確性較高。并且可根據(jù)既定目標(biāo)提前對(duì)性別進(jìn)行分離（精子性別或胚胎性別），而不必等到胎兒時(shí)期進(jìn)行性別分離。在美國(guó)，胚胎性別鑒定大規(guī)模商業(yè)性過程中使用的唯一方法是活體檢查胚胎后用PCR擴(kuò)增Y染色體上特定DNA，這種方法對(duì)90%以上的胚胎有效，準(zhǔn)確率達(dá)95%。盡管如此，應(yīng)用PCR對(duì)胚胎進(jìn)行性別鑒定時(shí)，所有的胚胎必須活體檢查后測(cè)定，并且大約50%的非期望性別的胚胎被廢棄，其效率也不高。胎兒的性別鑒定通常在妊娠期55～90d進(jìn)行，為了改變性別比例必須終止不需要的妊娠，這種改變性別比例的方法也較煩瑣和昂貴。最初的商業(yè)化胚胎性別鑒定程序是美國(guó)TransOraGenetics公司的AB技術(shù)法，這個(gè)程序需要5min進(jìn)行活體檢查，PCR過程需2h，一些胚胎需使用Y-擴(kuò)增產(chǎn)物。目前，一家公司（XY,Inc,FortCollins,Colorado,America）已擁有成功分離X、Y精子的技術(shù)，其原理是根據(jù)X和Y精子中DNA含量的不同。在牛和馬上，X精子中的DNA含量比Y精子多4%。采用高速流式細(xì)胞分離儀可在幾分鐘內(nèi)分離6百萬個(gè)X或Y精子，純度達(dá)90%。精子性別分離后可應(yīng)用于AI、ET和IVF程序。目前報(bào)道的結(jié)果表明小母牛采用冷凍的性別分離后的精子進(jìn)行AI后，在子宮體內(nèi)沉積的精子低劑量（1～1.5×106個(gè)精子）和高劑量（3×106個(gè)精子）兩組的妊娠率（大約50%）相似。阿根廷科學(xué)家也得到相似的結(jié)果。采用冷凍的性別分離的精子IVF后，胚胎發(fā)育率達(dá)18%～26%。但由于超排處理的供體肉牛和奶牛很難將AI的精子運(yùn)送到輸卵管受精部位，這阻礙了冷凍的性別分離精子在胚胎移植商業(yè)化中的廣泛應(yīng)用。美國(guó)TransOraGenetics公司目前獲得的卵巢來自荷斯坦牛，卵母細(xì)胞回收后用X精子進(jìn)行授精，得到的胚胎移植到奶牛體內(nèi)。最終可獲得較高的妊娠率，穩(wěn)定的育種性能。在結(jié)合體外受精技術(shù)的同時(shí)，性別控制技術(shù)將在養(yǎng)牛業(yè)中產(chǎn)生不可估量的影響。3克隆技術(shù)在克氏原螯蝦群體復(fù)制中的應(yīng)用前景展望克隆是用來描述體細(xì)胞核移植過程的簡(jiǎn)稱，是目前應(yīng)用的一項(xiàng)輔助繁殖技術(shù)。Spreeman(1938）定義胚胎細(xì)胞核移植技術(shù)是指將一個(gè)多細(xì)胞胚胎的卵裂球或細(xì)胞核通過顯微手術(shù)和細(xì)胞融合的方法，移植到1個(gè)去核的卵母細(xì)胞或去核的受精卵中，構(gòu)成新胚胎（克隆胚胎），然后移植給受體，獲得與核供體胚胎基因型相同的后代（克隆動(dòng)物）的生物技術(shù)。Wilut等（1997）獲得了成年綿羊乳腺上皮細(xì)胞核的克隆后代，這一突破性成果為成年哺乳動(dòng)物的完整復(fù)制打下了基礎(chǔ)。經(jīng)濟(jì)效益和遺傳改良并不是克隆的唯一目的。牛的克隆可以用來展覽，保種等，目前，對(duì)特定基因型的克隆引起很多實(shí)驗(yàn)室的關(guān)注。未來，克隆技術(shù)將在肉牛和奶牛商業(yè)化生產(chǎn)中起關(guān)鍵作用，克隆可加速由核移植帶來的遺傳改良的普及。胚胎克隆將對(duì)奶牛生產(chǎn)產(chǎn)生較大沖擊。我們使用優(yōu)秀胚胎作為核源進(jìn)行移植，而不必對(duì)母牛進(jìn)行人工授精。作為克隆的核源，其遺傳性狀要好于商業(yè)化種群的平均性狀，克隆加速了非雜交遺傳效益的廣泛開發(fā)。在商業(yè)化農(nóng)場(chǎng)中使用克隆技術(shù)生產(chǎn)克隆動(dòng)物減少了后備牛群中母牛的百分比。盡管核移植的平均效率已經(jīng)有很大提高，但其變異仍較大。影響核移植效率的變異來源不僅包括基因型，還包括核源的核型，核移植前供體細(xì)胞的處理，以及受體卵母細(xì)胞的來源。真皮中成纖維細(xì)胞是最常用的供體細(xì)胞。這些細(xì)胞可以從任何性別中獲得并可在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)液中培養(yǎng)。目前，?？寺〉纳虡I(yè)化應(yīng)用取決于社會(huì)和制度的接