丹參中酚酸類成分的測定及其方法學(xué)考察

丹參中酚酸類成分的測定及其方法學(xué)考察

丹參最早出現(xiàn)在《神農(nóng)本草經(jīng)》中，并列為優(yōu)秀。這是嘴唇科植物的丹參saltioragilnigaidale。干燥的根和根莖可以消除淤血、疼痛、活血、凈化和擺脫悲傷。其有效成分分為脂溶性、水溶性兩部分,前者主要含有二萜類化合物,后者則為酚酸類化合物。研究發(fā)現(xiàn),丹參中的水溶性酚酸類成分主要有丹參素(danshensu)、原兒茶醛(protocatechuicaldehyde)、丹酚酸A(salvianolicacidA)、丹酚酸B(salvianolicacidB)、迷迭香酸(rosmarinicacid)、紫草酸(lithospermicacid)、丹酚酸D(salvianolicacidD)和丹酚酸E(salvianolicacidE)等?，F(xiàn)代藥理研究亦證明,丹參酚酸類成分具有改善微循環(huán)、抑制血小板聚集、抗氧化、增加冠脈流量及心肌供氧量等作用,是丹參祛瘀、活血的主要活性成分。2010年版《中國藥典》僅以丹酚酸B為其水溶性成分的檢測指標(biāo),盡管丹酚酸B含量較高,但仍難以真正體現(xiàn)和保障丹參的內(nèi)在質(zhì)量,傳統(tǒng)中醫(yī)的整體觀要求對中藥材進(jìn)行多藥效成分指標(biāo)的綜合評價。由于丹酚酸B的結(jié)構(gòu)特點,其化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定,長期以來一直面臨對照品難得、貨源嚴(yán)重緊缺和檢測成本昂貴的問題。那么,如何在對照品供應(yīng)不足或缺省的情況下實現(xiàn)對中藥丹參水溶性成分的整體控制,是目前中藥丹參質(zhì)量控制中亟待解決的關(guān)鍵問題和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)難題。“一測多評”(quantitativeanalysisofulti-componentsbysingle-marker,QAMS)技術(shù)為解決這類問題提供了一個可供選擇的方法,這一模式已被2010年版《中國藥典》一部收載。本文重點探討了“一測多評”法在丹參酚酸類成分多指標(biāo)質(zhì)量評價中的技術(shù)適用性和可行性。1材料表面1.1管陣列分離器WatersAlliance高效液相色譜儀,包括2695溶劑管理系統(tǒng),2996二極管陣列檢測器,Empower2色譜工作站(美國WATERS公司);ShimadzuLC-20A高效液相色譜儀,包括LC-20AT溶液傳輸單元,SIL-20A自動進(jìn)樣器,SPD-M20A二極管陣列檢測器,LCSolution色譜工作站(日本島津公司)。1.2藥品化學(xué)品檢定所需藥物有丹參素鈉(批號855-200102),原兒茶醛(批號110810-200506),迷迭香酸(批號111871-201001),丹酚酸B(批號111562-200807)均購自中國藥品生物制品檢定所,供含量測定用;紫草酸購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司,純度均>98%。1.3唇形科植物麻黃tiorrhiz的干燥丹參市售飲片購自各地藥材商店/市場,經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所王智民研究員鑒定為唇形科植物丹參S.miltiorrhiza的干燥根及根莖。1.4試劑甲醇色譜純,水高純水,其余試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.11個研究評估的方法論2.1.1流動相a-3%苯甲酸水溶液b/a流動相,cXtimateTMC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動相:乙腈(A)-3%甲酸水溶液(B),梯度洗脫,0~80min,0%~33%A,流速1mL·min-1,柱溫30℃,檢測波長280nm。理論板數(shù)按丹參素峰計算應(yīng)不低于6000。見圖1。2.1.2續(xù)濾液的制備取丹參粉末(過40目篩)約0.5g,精密稱定,置濾紙包中,精密稱定,置100mL圓底燒瓶中,精密加入純凈水50mL,稱定質(zhì)量,置電熱套(250W,150℃)中加熱回流2h,取下,放冷,再稱定質(zhì)量,用純凈水補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,用0.22μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,備用。2.1.3對照品溶液配制精密稱取丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸及丹酚酸B對照品各約4.00mg,置10mL量瓶中,加甲醇至刻度,配成濃度約為0.4g·L-1的混合對照品溶液1#,備用。分別精密吸取上述混和對照品溶液1.5,1.0,0.5,0.25,0.125,0.06,0.03,0.003mL置2mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,作為混合對照品溶液2#~9#(質(zhì)量濃度分別約為①0.400g·L-1,②0.300g·L-1,③0.200g·L-1,④0.100g·L-1,⑤0.0500g·L-1,⑥0.0250g·L-1,⑦0.0120g·L-1,⑧0.00600g·L-1,⑨0.000600g·L-1)。2.1.4線性回歸高效液相色譜法分別精密吸取2.1.3項下9個濃度的混合對照品溶液10μL注入高效液相色譜儀。以測得的響應(yīng)信號(峰面積)和被測物的量,用最小二乘法進(jìn)行線性回歸,得到各成分的回歸方程以及線性范圍。結(jié)果表明:丹參酚酸混合對照品溶液在如下范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系,結(jié)果見表1。2.2同時測定丹參酚酸phlc的方法研究2.2.1方法的精密度和準(zhǔn)確度取同一份丹參供試品溶液于同1d和3d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣,測定丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B5個酚酸類成分的峰面積,計算RSD。結(jié)果日內(nèi)精密度,各成分峰面積的RSD分別為0.42%,0.43%,0.50%,1.0%,0.57%;日間精密度各成分峰面積的RSD分別為0.67%,0.64%,0.59%,0.78%和0.86%,表明儀器的精密度良好。2.2.2藥材含量測定取同一批丹參藥材粉末(過40目篩)約0.5g,精密稱定,按2.1.2項下方法平行制備6份供試品溶液,測定峰面積,計算藥材含量及RSD。結(jié)果測得丹參中丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B5個酚酸類成分的含量分別為0.351%,0.0215%,0.191%,0.231%,3.53%,RSD分別為3.5%,2.2%,1.6%,3.3%和2.0%,表明該方法的重復(fù)性良好。2.2.3rsd測定取同一份丹參供試品溶液,分別于樣品制備后的第0,1.5,3,4.5,6,7.0,9,12,18,24,36h進(jìn)樣,測定峰面積,計算RSD。結(jié)果丹參中丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B5個酚酸類成分峰面積的RSD分別為0.44%,1.3%,0.44%,0.86%,0.70%,表明36h內(nèi),供試品溶液的穩(wěn)定性良好。2.2.4加樣回收率試驗取已知含量的丹參粉末約0.25g(丹酚酸B加樣回收率取丹參粉末0.025g)(過40目篩),精密稱定,平行6份,分別按藥材含量-對照品(1∶1)的比例加入一定量的對照品溶液,按2.1.2項下方法制備供試品溶液,測定并計算各成分的加樣回收率以及RSD。結(jié)果丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B5個酚酸類成分的加樣回收率分別為100.2%,99.9%,99.9%,100.3%,101.6%,RSD分別為0.41%,0.66%,1.5%,1.0%,1.1%,表明該方法的準(zhǔn)確度良好。見表2。2.3相對校正因子的確定2.3.1不同待考物的相對校正因子及前因子計算以丹參素鈉為內(nèi)參物,根據(jù)相對校正因子計算公式,分別計算各待評價成分原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B與內(nèi)參物丹參素鈉的相對校正因子,見表3。2.3.2抗省法的適用性和系統(tǒng)適應(yīng)性的評估針對可能影響相對校正因子重現(xiàn)性的一些因素,設(shè)計了一系列實驗,重點考察不同實驗條件對相對校正因子重現(xiàn)性的影響。2.3.2.種高效液相色譜對人參酚酸相對校正因子的影響試驗在不同實驗室進(jìn)行,采用XtimateTMC18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱,分別考察了2種不同的高效液相色譜系統(tǒng)對丹參酚酸相對校正因子的影響,結(jié)果各成分相對校正因子重復(fù)性良好(RSD<5%)。見表4。2.3.2.色譜柱對人參酚酸相對校正因子的影響試驗在同一實驗室進(jìn)行,采用WatersAlliance和ShimadzuLC-20A2種不同的高效液相色譜系統(tǒng),分別考察了4種不同型號規(guī)格的色譜柱對丹參酚酸相對校正因子的影響,結(jié)果各成分相對校正因子重現(xiàn)性良好(RSD<5%)。見表5,6。2.3.2.相色譜條件對人參酚酸相對校正因子的影響試驗在同一實驗室進(jìn)行,采用WatersAlliance高效液相色譜系統(tǒng)和XtimateTMC18色譜柱,分別考察了不同流速(1.0,1.1mL·min-1)對丹參酚酸相對校正因子的影響,結(jié)果各成分相對校正因子重復(fù)性良好(RSD<5%)。見表7。2.3.2.色譜柱溫度的確定試驗在同一實驗室進(jìn)行,采用WatersAlliance高效液相色譜系統(tǒng)和XtimateTMC18色譜柱,分別考察了不同柱溫(35℃和30℃)對丹參酚酸相對校正因子的影響,結(jié)果各成分相對校正因子重現(xiàn)性良好,見表8。2.4相對保留值和保留時間差法“一測多評”法色譜峰的準(zhǔn)確定位一般可以采用保留時間差或相對保留值等參數(shù)結(jié)合色譜圖整體特征,以及每個峰的紫外吸收特征來定位其余待測成分(a,b,…,i,…)色譜峰。相對保留值指各待測成分與內(nèi)參物s間保留時間的比值,計算公式:ras=tRa/tRs;保留時間差指各待測成分與內(nèi)參物S間保留時間的差值,計算公式:ΔtRas=tRa-tRs。本研究分別考察相對保留值和保留時間差在不同品牌儀器和不同規(guī)格色譜柱中的重現(xiàn)性。結(jié)果表明相對保留值的波動較為明顯,RSD>5%,不太適合作為待測成分色譜峰定位的依據(jù),保留時間差的波動相對較小,因此采用保留時間差法進(jìn)行丹參中酚酸類待測成分色譜峰的定位較為可行。見表9,10。2.5酚酸類物質(zhì)的測定首先采用外標(biāo)法對丹參中5種酚酸類成分進(jìn)行多成分同步含量測定,再用建立的QAMS法對其含量進(jìn)行計算,并將2種方法計算的結(jié)果進(jìn)行比較,以驗證QAMS法用于酚酸類多指標(biāo)成分質(zhì)量評價的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明,2種方法測得的丹參酚酸類成分含量沒有顯著性差異,相對偏差<5%,提示建立的方法具有較好的可信度。見表11。2.6計算含量測定另取丹參樣品10批,按照QAMS法進(jìn)行含量測定,利用所建立的QAMS法進(jìn)行10批丹參樣品的實際測算,得到其含量計算值;然后再以多成分同步測定方法(外標(biāo)法)進(jìn)行反證,進(jìn)一步驗證QAMS法的合理性。2種方法測得的酚酸類成分含量無顯著性差異,相對偏差<5%,表明建立的QAMS法在丹參酚酸類成分檢測中的適宜性良好,可用于標(biāo)準(zhǔn)的起草與制定,見表12。3相對校正因子的確定檢測波長的選擇采用二極管陣列檢測器,在190~800nm波長下對供試品溶液和對照品溶液進(jìn)行了全波長掃描,并對相應(yīng)吸收波長下的供試品色譜圖進(jìn)行了分析,結(jié)果在270~290nm波長下丹參五種酚酸吸收峰均為最大吸收,且色譜峰分離度良好,全部達(dá)到基線分離,各待測成分色譜峰純度角均小于純度閾值,表明各色譜峰內(nèi)無雜質(zhì)干擾。故采用280nm作為檢測波長。相對校正因子重現(xiàn)性本試驗選用化合物性質(zhì)相對穩(wěn)定,對照品相對易得且價廉的丹參素鈉為內(nèi)參物,建立該成分與其他4種酚酸類成分間的相對校正因子。通過對30余批丹參藥材與飲片的測定,驗證了該色譜方法的精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、系統(tǒng)適應(yīng)性和QAMS法的準(zhǔn)確性,并對QAMS法的適用性和可行性進(jìn)行了探討研究。結(jié)果表明,QAMS法推算的含量與實測法所得含量沒有顯著性差異,提示試驗建立的相對校正因子具有較好的可信度。丹參含量測定結(jié)果顯示,藥材中丹參素與原兒茶醛,迷迭香酸,紫草酸及丹酚酸B的相對濃度比分別約為20/1,3/1,2/1及1/10,因此在對丹參酚酸相對濃度比約為1/1的條件參數(shù)進(jìn)行相對校正因子考察的同時,還根據(jù)藥材中酚酸類成分的不同相對濃度比的條件參數(shù)對其相對校正因子進(jìn)行了考察,結(jié)果原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B與丹參素鈉的相對校正因子分別為6.896,2.927,1.657,1.748,2種條件參數(shù)下的相對校正因子進(jìn)行比較,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%,表明不同相對濃度比條件下丹參酚酸的相對校正因子之間無顯著性差異。QAMS法待測色譜峰的定位在本研究中通過考察相對保留值和保留時間差在不同品牌儀器和不同規(guī)格色譜柱中的重現(xiàn)性,選擇保留時間差作為色譜峰定位依據(jù)。由實驗數(shù)據(jù)見表10的統(tǒng)計中可以發(fā)現(xiàn),不同型號的色譜柱對原兒茶醛的選擇性較強(qiáng),相對標(biāo)準(zhǔn)偏差略大于5%,而對其余成分的選擇性相對較弱,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在2%左右波動。因此為了保證QAMS法待測色譜峰的準(zhǔn)確定位,可參照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》規(guī)定,對試驗所需色譜柱型號和規(guī)格進(jìn)行規(guī)定,即可獲得滿意結(jié)果。實驗中建立的丹參酚酸同步測定的方法同樣適用于丹酚酸A,但是由于丹酚酸A自身化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定,重復(fù)性試驗相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較大,因此未對其進(jìn)行回收率試驗。試驗中發(fā)現(xiàn)丹參的供試品溶液在樣品制備后9.5h內(nèi)、對照品溶液24h內(nèi)丹酚酸A含量相對穩(wěn)定,因此在考察上述丹參酚酸類成分間相對校正因子的耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性的同時,也對丹酚酸A與丹參素鈉間的相對校正因子進(jìn)行了考察,結(jié)果顯示其相對校正因子(f丹酚酸A/丹參素鈉=4.254,RSD