發(fā)酵工程制藥-發(fā)酵工程制藥菌種的選育

微生物菌種的保藏技術(shù)內(nèi)容導(dǎo)入菌種保藏主要是根據(jù)微生物生理生化特點(diǎn)，人工創(chuàng)造條件，使微生物代謝處于不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)，即采取低溫、干燥、缺氧3個條件，使菌種暫時處于休眠狀態(tài)。任務(wù)內(nèi)容菌種保藏目的及原理常用菌種的保藏方法一、菌種保藏目的及原理目的使菌種不生長不死亡不污染不降低或不喪失其優(yōu)良性以盡量延長使用時間干燥無氧缺營養(yǎng)低溫保藏注意1、用保種培養(yǎng)基2、及時保藏（菌絲占斜面2/3）3、最好換膠塞4、用時活化5、嚴(yán)防棉塞受潮基本原則1、挑選典型菌種的優(yōu)良純種。2、盡量使用分生孢子、芽孢等休眠體3、創(chuàng)造有利于休眠的保藏環(huán)境（如干燥、低溫）。4、盡可能多的采用不同的手段保藏一些比較重要的微生物菌株。二、常用菌種的保藏方法以母種形式保藏1.斜面低溫法

斜面菌種置4~6℃冰箱中（3~6個月）特點(diǎn)簡便

保藏時間短

易污染及退化

不適于草菇等菌類2.礦油保藏法斜面或半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)物上加滅菌石蠟（約1cm高），保存時間1-2年。用途：用于霉菌、酵母菌、放線菌、好氧性細(xì)菌等的保存礦油處理注入種管無菌檢驗(yàn)？滅菌：152kpa、30min

去水：40~50℃烘至無色透明

淹沒斜面約1cm3.自然基質(zhì)保藏法基質(zhì)的處理麥粒浸透、煮熟

麩皮拌濕裝管滅菌接種培養(yǎng)干燥器去水特點(diǎn)防衰老、保藏時間長

轉(zhuǎn)接后生長旺

易污染，滅菌要徹底4、沙土保藏法特點(diǎn)：干燥、無營養(yǎng)用途：保存比較干燥的微生物孢子或芽孢、放線菌。保存時間數(shù)年或數(shù)十年5、冷凍真空干燥法原理：在極低溫度下快速的將菌體細(xì)胞凍結(jié)且保持完整，在減壓條件下利用升華現(xiàn)象出去水分，真空條件下熔封管口稱為凍干法。特點(diǎn)：干燥、低溫、無氧、保護(hù)劑，保存時間可達(dá)15年以上。保護(hù)劑：牛乳血清、糖類、甘油、二甲基亞砜6、液氮冷凍保藏技術(shù)原理：將安瓿管置于-70℃冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。使用時從液氮罐中取出，立即放置在38～40℃水浴中使其溶化，而后直接將其接種到適宜的培養(yǎng)基中即可。特點(diǎn)：此法存活率高，穩(wěn)定性強(qiáng)，保藏時間長，是長期保藏菌種的最好方法。冷凍保護(hù)劑在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用的甘油—般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。幾種常用菌種保藏方法的比較方法名稱主要措施適宜菌種保藏期評價(jià)冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固體）石蠟油封藏法*沙土保藏法冷凍干燥法低溫低溫低溫、缺氧干燥、無營養(yǎng)干燥、無氧、低溫、有保護(hù)劑各大類細(xì)菌、酵母菌各大類**產(chǎn)孢子微生物各大類3~6月6~12月1~2年1~10年5~15年以上簡便簡便簡便簡便有效簡便有效1、菌種保藏的目的原理。思考與討論：我學(xué)到什么？任務(wù)菌種保藏的基本方法有哪些？各方法適宜保藏的菌種有何不同？為什么？2、常用菌種保藏方法:菌種的退化與復(fù)壯內(nèi)容導(dǎo)入在微生物研究應(yīng)用領(lǐng)域，菌種的退化是一種潛在威脅，性狀穩(wěn)定的菌種是微生物學(xué)工作最重要的基本要求，否則生產(chǎn)或科研都無法正常進(jìn)行。任務(wù)內(nèi)容一、菌種的退化：定義、現(xiàn)象原因及防治衰退的措施二、菌種的復(fù)壯：定義、復(fù)壯的方法一、菌種的衰退菌種在培養(yǎng)或保藏過程中，由于自發(fā)突變的存在，出現(xiàn)某些原有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標(biāo)記的丟失等現(xiàn)象，稱為菌種的衰退。1.衰退（degeneration）衰退的原因：①基因突變，②分離現(xiàn)象。菌種衰退的現(xiàn)象及原因變異有正變（自發(fā)突變）和負(fù)變兩種。菌種退化的主要原因是基因的負(fù)突變。常見的菌種退化現(xiàn)象中，最易覺察到的是菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)和生理等多方面的改變隨著菌種保藏時間的延長或菌種的多次轉(zhuǎn)接傳代，菌種本身所具有的優(yōu)良的遺傳性狀可能得到延續(xù)，也可能發(fā)生變異。衰退：菌種出現(xiàn)或表現(xiàn)出負(fù)變性狀菌種衰退的原因：大量群體中的自發(fā)突變純菌種自發(fā)突變不純菌種傳代增殖衰退菌種原始個體突變個體菌種衰退的現(xiàn)象1.菌落和細(xì)胞形態(tài)改變2.生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少；3.生產(chǎn)性能下降：代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主寄生能力下降4.對生長環(huán)境的適應(yīng)能力減弱菌種衰退的原因1.有關(guān)基因的負(fù)突變2.育種后未經(jīng)很好的分離純化3.培養(yǎng)條件的改變4.污染雜菌防止衰退的措施1）減少傳代次數(shù)；4）經(jīng)常進(jìn)行純種分離，并對相應(yīng)的性狀指標(biāo)進(jìn)行檢查；2）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件；5）采用有效的菌種保藏方法；二、菌種的復(fù)壯（rejuvenation）使衰退的菌種恢復(fù)原來優(yōu)良性狀狹義的復(fù)壯是指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和生產(chǎn)性能測定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個體，以達(dá)到恢復(fù)該菌原有典型性狀的措施。廣義的復(fù)壯是指在菌種的生產(chǎn)性能未衰退前就有意識的經(jīng)常、進(jìn)行純種的分離和生產(chǎn)性能測定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。實(shí)際上是利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選種。菌種的復(fù)壯措施①純種分離：（平板劃線法、涂布法、傾注法、單細(xì)胞挑取法等）。②通過寄主體內(nèi)生長進(jìn)行復(fù)壯（如Bacillusthuringiensis的復(fù)壯）；③淘汰已衰退的個體（采用比較激烈的理化條件進(jìn)行處理，以殺死生命力較差的已衰退個體）。④采用有效的菌種保藏方法。1、菌種的退化：定義、現(xiàn)象原因及防治衰退的措施思考與討論：我學(xué)到什么？任務(wù)1、怎樣防止菌種的衰退？2、怎樣判斷菌種的衰退？2、菌種的復(fù)壯：定義、復(fù)壯的方法菌種的自然選育（一）菌種選育種子培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)物分離純化成品滅菌培養(yǎng)基的優(yōu)化工業(yè)菌種的育種是運(yùn)用遺傳學(xué)原理和技術(shù)對某個用于特定生物技術(shù)目的的菌株進(jìn)行的多方位的改造。通過改造，可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強(qiáng)化，或去除不良性狀或增加新的性狀。菌種選育改良的具體目標(biāo)

?改變生物代謝途徑，提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量?提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度，減少副產(chǎn)物提問：生產(chǎn)菌從來源分為哪幾類？野生型菌種、突變菌、基因工程菌經(jīng)驗(yàn)育種定向育種誘變育種自然選育菌種選育基因工程育種雜交育種定向育種經(jīng)驗(yàn)育種一、野生型菌株的來源非人工誘變自然選育：不經(jīng)過人工誘變處理，而直接進(jìn)行篩選的育種方法菌種的自發(fā)突變的兩種可能：菌種衰退，生產(chǎn)性能下降；菌種代謝更加旺盛，生產(chǎn)性能提高。1.從大自然中分離篩選的菌種2.從自發(fā)突變的菌種中篩選的菌種。二、分離的原則原則：依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準(zhǔn)確地篩選出目的菌種。如，在篩選分泌某種特定成分的微生物時，根據(jù)所需物質(zhì)的特性和微生物的性質(zhì)制定篩選方案實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進(jìn)行分離純化。三、新菌分離的步驟1.案例篩選能降解石油的菌株時，方法是在受石油污染的土壤或水域中取樣，配置以石油為唯一碳源的合成培養(yǎng)基，篩選出仍能快速生長的菌株，獲得性能優(yōu)異的單菌落。2.請根據(jù)上述案例歸納菌種篩選的步驟平板分離確定采集樣品的生態(tài)環(huán)境（有針對性的采集樣品）確定特定的增殖條件確定特殊的選擇培養(yǎng)基及可能的定性或半定量檢出法調(diào)查研究及查閱充分的資料設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案采樣增殖培養(yǎng)人為地通過控制養(yǎng)分或培養(yǎng)條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。較優(yōu)化3-5株原種斜面篩選初篩復(fù)篩再復(fù)篩確定發(fā)酵培養(yǎng)基基本條件（1株1瓶）（1株3～5瓶）←定性或半定量測定單株純種培養(yǎng)菌種鑒定保藏及生產(chǎn)性能試驗(yàn)毒性試驗(yàn)等自然選育的含義菌株分離的原則菌株分離的步驟小結(jié)菌種的自然選育（二）菌種的篩選流程初篩文獻(xiàn)調(diào)研設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案較優(yōu)化3-5株單株純種培養(yǎng)復(fù)篩采樣增殖培養(yǎng)平皿分離菌種鑒定一、采樣1、采樣對象以采集土壤為主，也可以是植物、腐敗物品和某些水域等。

一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細(xì)菌和放線菌為主；富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi)。2、采土方式選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，應(yīng)便及時分離。二、增殖培養(yǎng)指利用不同微生物間生命活動特點(diǎn)的不同，人為地提供一些特定的環(huán)境條件，使特定微生物旺盛生長，使其在數(shù)量上占優(yōu)勢，更利于分離出該特定微生物，稱為增殖培養(yǎng)也叫富集培養(yǎng)。方法：1、控制一定的養(yǎng)分；如：為目的菌株提供唯一氮源或碳源2、控制一定的培養(yǎng)條件。如：控制PH●細(xì)菌和放線菌要求pH7.0～7.5●霉菌和酵母菌要求pH4.5～6三、培養(yǎng)分離盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài)，因此還必須分離純化。在這—步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用，而且控制得細(xì)一點(diǎn)。純種分離的方法有稀釋分離法、劃線分離法。1.稀釋平皿分離法a.傾注平皿分離法b.涂布平皿分離法2.平皿劃線分離法a.分區(qū)劃線分離法b.連續(xù)劃線分離法2、控制培養(yǎng)基的酸堿度如：要分離耐高滲透壓酵母菌，在采用含40%葡萄糖的培養(yǎng)基時，PH控制2.0~4.0，幾乎分離出的酵母菌全都是耐高滲透壓的。純種分離時培養(yǎng)條件的控制措施：1、營養(yǎng)成分的控制如：若要分離產(chǎn)淀粉酶的微生物，可以用淀粉作唯一碳源。3、添加抑制劑如分離放線菌時，加10%的酚，可抑制細(xì)菌和霉菌4、熱處理根據(jù)芽孢對熱的耐性而淘汰不產(chǎn)芽孢的細(xì)菌和其他微生物。6、通氣條件的控制5、控制培養(yǎng)溫度純種分離時培養(yǎng)條件的控制措施：四、生產(chǎn)能力的檢測篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以迅速篩出大量的達(dá)到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異.1、初篩平板篩選如，水解酶產(chǎn)生菌的篩選：將酶的作用底物加在培養(yǎng)基中，接種后適溫培養(yǎng)，根據(jù)菌落周圍是否產(chǎn)生水解圈篩選出水解酶產(chǎn)生菌。初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復(fù)篩者，而將大量的菌落淘汰。用剛果紅染色法鑒定篩選降解纖維素的菌株，羧甲基纖維素鈉作培養(yǎng)物2、復(fù)篩采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件