啤酒發(fā)酵過程中雙乙酰的產(chǎn)生及控制

啤酒發(fā)酵過程中雙乙酰的產(chǎn)生及控制

與啤酒味道相關(guān)的發(fā)酵產(chǎn)物主要是刺激性酯、醇、酸、乙醇、二醇和硝酸鹽。在許多影響啤酒味道成熟的藥物中，二乙二醇是一個重要的因素。雙乙酰的味閾值很低(0.1~0.2mg/L),當含量超過味閾值時,會使啤酒口味不純正、含有不愉快的餿飯味,直接影響啤酒的質(zhì)量,破壞啤酒風味。我國啤酒國家標準GB4927-2008規(guī)定優(yōu)級淡色啤酒中雙乙酰含量≤0.1mg/L。其它影響啤酒口味成熟的物質(zhì)如乙醛和硫化物等都可以在發(fā)酵后期隨著CO2的排放和物質(zhì)的轉(zhuǎn)化而自然消減,雙乙酰則需較長的時間逐漸排除。1雙乙酰非酶氧化還原酶最初認為,雙乙酰是由啤酒中污染的乳酸菌產(chǎn)生的。20世紀60年代后才發(fā)現(xiàn),啤酒生產(chǎn)過程中的雙乙酰主要來自于酵母的生物合成途徑,酵母也是雙乙酰降解的主要因素。酵母在進行纈氨酸的合成代謝過程中,中間產(chǎn)物α-乙酰乳酸積累并分泌到酵母細胞外,通過氧化脫羧反應而產(chǎn)生雙乙酰,由于至今未找到相應的催化酶,該反應被認為是非酶氧化分解反應。由于酵母在大量出芽繁殖時,作為酵母細胞蛋白質(zhì)原料的纈氨酸才合成較多,雙乙酰的形成峰值出現(xiàn)在發(fā)酵液中酵母達到最高濃度數(shù)小時之后,可高達1.2mg/L。此外,還有部分雙乙酰是由糖代謝過程中的乙酰輔酶A產(chǎn)生,乙酰輔酶A與羥乙基硫氨素的焦磷酸鹽(又稱活性乙醛)直接縮合,進一步放出輔酶A而形成雙乙酰。分泌出胞外的雙乙酰可被酵母細胞重新吸收,并由酵母自身的雙乙酰還原酶催化還原成乙偶姻,乙偶姻進一步還原為2,3-丁二醇,如圖1所示。乙偶姻和2,3-丁二醇具有較高的味閾值(30~100mg/L),遠遠大于雙乙酰,不會影響啤酒的口味。但α-乙酰乳酸的非酶促氧化脫羧生成雙乙酰的反應比雙乙酰的還原反應慢10倍,因此啤酒發(fā)酵需要較長的后發(fā)酵期使雙乙酰還原達標;并且在灌裝后由于瓶和罐中存在空氣和溶氧,非酶氧化反應會繼續(xù)發(fā)生,而此時已經(jīng)不存在酵母和還原酶,灌裝后的啤酒存在雙乙酰反彈的風險。2-乙酰乳酸的積累與雙乙酰還原從雙乙酰形成機制和代謝途徑上看,控制啤酒中雙乙酰的含量主要應從雙乙酰代謝途徑的上游和下游,也就是雙乙酰的合成和分解兩個方面來考慮。加快雙乙酰的分解:雙乙酰的還原速度與發(fā)酵過程中的許多因素有關(guān),如溫度、酵母數(shù)量以及酵母還原能力等。減少α-乙酰乳酸的積累:α-乙酰乳酸作為雙乙酰合成的前體物質(zhì)大量積累,是導致雙乙酰含量過高和啤酒發(fā)酵周期延長的直接原因,也容易造成成品酒中雙乙酰的反彈。在啤酒生產(chǎn)過程中應綜合考慮各因素,選擇適當?shù)姆椒ā?.1-乙酰乳酸的制備α-乙酰乳酸是酵母代謝中纈氨酸合成的中間產(chǎn)物,提高麥汁中氨基氮的含量也就相應地提高了纈氨酸的含量,從而反饋抑制了α-乙酰乳酸的合成和積累,相應的降低了雙乙酰的生成量。通常可采用優(yōu)良的大麥原料和制麥工藝來增加麥汁的氨基氮含量。但麥汁中的氨基酸過多,又會產(chǎn)生較多的高級醇和酯類等,對啤酒的風味和泡沫性能均不利。一般α-氨基氮含量控制在180~200mg/L較合適。此法的主要缺點是重現(xiàn)性差,麥汁的成分很難控制到每一批都一致,并且不利于啤酒生產(chǎn)成本的降低。2.2啤酒發(fā)酵過程中酵母的污染不同的酵母菌株合成α-乙酰乳酸的縮合酶活性差異很大,形成的雙乙酰峰值差別大,而且雙乙酰還原速度也不同?？赏ㄟ^啤酒酵母在不同的雙乙酰含量梯度的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng),篩選到能夠在高濃度雙乙酰含量存在下,能正常進行代謝活動的抗雙乙酰的變異菌株,這些抗雙乙酰的變異菌株的雙乙酰還原能力較強。在發(fā)酵中還可增大酵母使用量。一般啤酒發(fā)酵常用酵母量為0.5~0.6%,可適當提高到0.7~0.8%(泥狀),使雙乙酰加快還原為2,3-丁二醇。但最多不要超過1%,否則極易使啤酒產(chǎn)生酵母味。啤酒發(fā)酵中如污染了四聯(lián)球菌、鏈球菌、多變黃桿菌和乳酸菌等雜菌,雜菌可同化啤酒中的糖類產(chǎn)生雙乙酰。還有許多微生物如嗜酸菌等,雖然不直接產(chǎn)生雙乙酰,但這些微生物的污染可使酵母的雙乙酰還原能力大大減弱,使雙乙酰含量迅速增加。啤酒中微生物的污染一般是在麥汁冷卻之后,主要污染源是與麥汁接觸的空氣、機械設(shè)備和管道、添加劑以及操作人員,種酵母的擴培過程也存在污染的可能。啤酒發(fā)酵生產(chǎn)需建立微生物全面控制方案,針對污染的主要途徑制定檢驗計劃,明確檢驗項目,準確快速確定樣品中污染的情況,進行有針對性的控制。2.3注意雙乙酰的還原和發(fā)酵α-乙酰乳酸的非酶分解和雙乙酰的酶還原作用都與溫度有關(guān),溫度越高,反應越快。因此提高發(fā)酵溫度對于要排除已經(jīng)形成了的α-乙酰乳酸來說是很有效的措施,如采取8.5~10℃主發(fā)酵5~7天,12~13℃后發(fā)酵6~10天。但溫度過高會加速正面風味物質(zhì)的氧化損失,還會增加高級醇的生成,目前已較少采用。當發(fā)現(xiàn)雙乙酰還原不好,并且酵母數(shù)在酒中的數(shù)量也急劇減少,此時即使經(jīng)過較長的后期貯酒,也難以使雙乙酰達標。此時可將酒汁倒出15~25%,然后再外加15~25%的發(fā)酵最旺盛的發(fā)酵液(高泡酒)。利用酵母數(shù)高、新鮮旺盛的重新發(fā)酵可將雙乙酰還原達標?；境墒斓木浦蚬嘌b后的啤酒中若含有多量溶解氧,可使殘留的α-乙酰乳酸氧化形成雙乙酰,這種情況造成的雙乙酰反彈超標一直是市場上啤酒質(zhì)量監(jiān)督檢查中出現(xiàn)的主要質(zhì)量不合格現(xiàn)象。因此需要防止酒汁中氧的吸入,減少溶解氧,一般在酒汁過濾時清酒罐用純度99.9%以上的CO2備壓;裝酒機罐酒時采用二次抽真空;在酒汁中加入抗氧化劑,對于含有少量葡萄糖的酒汁,可添加葡萄糖氧化酶和亞硫酸鹽。3-乙酰乳酸脫羧酶基因檢測α-乙酰乳酸脫羧酶(EC4.1.1.5)可將雙乙酰的前體α-乙酰乳酸快速催化分解為乙偶姻,不經(jīng)過雙乙酰的生成步驟,不僅可以使啤酒很快成熟,而且由于大大降低啤酒中殘存的α-乙酰乳酸,可解決成品酒中的雙乙酰反彈問題。α-乙酰乳酸脫羧酶催化反應的途徑如圖2所示。啤酒酵母細胞中并沒有編碼a-乙酰乳酸脫羧酶的基因。目前應用α-乙酰乳酸脫羧酶主要有兩種方法:發(fā)酵過程外加α-乙酰乳酸脫羧酶制劑以及采用基因工程酵母菌。3.1b合成高效酶1982年丹麥Carlsberg實驗室的Godtfredsen等首次利用從產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)1033菌株中提純的a-乙酰乳酸脫羧酶進行加速啤酒成熟的研究。在新釀制的(主發(fā)酵期后)啤酒中加入該酶制劑,在10℃保溫24h,雙乙酰含量可達到味閾值以下,啤酒的主要指標和感官性質(zhì)與常規(guī)熟化三周的啤酒相同,大大縮短啤酒的成熟期。此后發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生a-乙酰乳酸脫羧酶的微生物還有產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、克雷伯氏土生菌(Klebsiellaterrigena)等。其中短芽孢桿菌的a-乙酰乳酸脫羧酶的最適pH為5.5~6.5,在pH4.4下仍保持75%的活性;溫度穩(wěn)定性較好,在主發(fā)酵后的啤酒中10℃測定的酶半衰期在11天以上,這些性質(zhì)在啤酒生產(chǎn)應用上較為理想。由于天然短芽孢桿菌的產(chǎn)酶量很低,1990年丹麥NovoNordisk公司克隆了短芽孢桿菌ATCC11031的a-乙酰乳酸脫羧酶基因,并在大腸桿菌中得到74U/ml的表達,在枯草芽孢桿菌中得到51U/ml的表達,并且胞外酶達74%。此后推出了商品化的酶制劑Maturex,酶活力≥1500U/ml,作為啤酒熟化添加劑大量應用。1997年陳煒等率先在國內(nèi)將短芽孢桿菌的a-乙酰乳酸脫羧酶基因進行克隆和表達。目前我國生產(chǎn)a-乙酰乳酸脫羧酶制劑的單位主要有南寧邦爾克生物技術(shù)有限責任公司等,1998年開始推出的重組a-乙酰乳酸脫羧酶制劑,液體酶活力≥2000U/ml,固體酶活力≥8000U/g。在大規(guī)模啤酒發(fā)酵中應用時,酶添加量約5~10mg/L麥汁,即使輔料大米的比例提高到45%,麥汁中的α-氨基氮含量低于160mg/L的條件下,也可將成熟啤酒發(fā)酵液的雙乙?？刂圃?.08mg/L以下,縮短發(fā)酵周期3~7天,提高啤酒質(zhì)量、提高啤酒旺季的生產(chǎn)能力的效果十分顯著。3.2yepl3型發(fā)酵載體將細菌來源的α-乙酰乳酸脫羧酶基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母中并使其表達,構(gòu)建成具有α-乙酰乳酸脫羧酶活性的重組酵母工程菌株,也可以達到快速降解α-乙酰乳酸,減少雙乙酰生成,縮短啤酒發(fā)酵周期的目的。Sone等1988年首次報道將產(chǎn)氣腸桿菌的α-乙酰乳酸脫羧酶基因通過自主復制型載體YEpl3引入到淡啤酒酵母中,實驗室規(guī)模的對比發(fā)酵試驗表明,此重組酵母菌株發(fā)酵的啤酒總雙乙酸(包括乙酰乳酸和雙乙酰)降到親株的1/4以下,發(fā)酵能力、風味成分的含量均無明顯差別。此后國內(nèi)外陸續(xù)有將克雷伯氏土生菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、醋化醋桿菌的α-乙酰乳酸脫羧酶基因整合重組到釀酒酵母染色體中的報道,一般都能得到α-乙酰乳酸脫羧酶基因多拷貝、穩(wěn)定遺傳和高效表達,發(fā)酵液中雙乙酰的峰值及還原時間較原始菌降低1/3左右的效果。4-乙酰乳酸脫羧酶基因缺失菌株在啤酒生產(chǎn)中的最佳選擇近年來,我國啤酒行業(yè)通過選育優(yōu)良的酵母菌種,強化發(fā)酵全過程的微生物管理,杜絕污染,控制麥汁組成合理,雙乙酰已經(jīng)不再成為啤酒質(zhì)量和產(chǎn)量的瓶頸問題。在啤酒生產(chǎn)和銷售的旺季,以及設(shè)置雙乙酰內(nèi)控指標大大低于國家標準的啤酒生產(chǎn)中,仍然需要添加α-乙酰乳酸脫羧酶加快啤酒的熟化。而轉(zhuǎn)入細菌來源α-乙酰乳酸脫羧酶基因的酵母工程菌是否安全,能否用于生產(chǎn)啤酒還未能得到廣泛的認同。目前重組酵母的研究已轉(zhuǎn)到采用自克隆技術(shù)將來源于酵母本身纈氨