claudin-1表達(dá)與膠質(zhì)瘤侵襲分級和預(yù)后的關(guān)系

claudin-1表達(dá)與膠質(zhì)瘤侵襲分級和預(yù)后的關(guān)系

橡膠瘤是最常見的腦腫瘤。其死亡率高和預(yù)后差的原因主要與膠質(zhì)瘤的分化程度、侵襲生長、細(xì)胞增殖和血管生成密切相關(guān)。腫瘤的組織學(xué)分級是重要的預(yù)后參數(shù),其中與腫瘤細(xì)胞的極性變化密切相關(guān),而控制腫瘤細(xì)胞極性的最重要分子成分是細(xì)胞的緊密連接。緊密連接由整合素蛋白組成,例如occludin、claudin家族以及連接相關(guān)蛋白如ZO-1。目前已知Claudin家族有24個成員,以組織特異性的模式表達(dá)。Claudin通過兩個細(xì)胞外的環(huán)相互連接。近來有關(guān)Claudin基因在不同腫瘤中的表達(dá)的研究逐漸增多,但其確切的表達(dá)模式尚不知道,僅僅在少量的腫瘤上對有限的Claudin基因進(jìn)行研究,有關(guān)Claudin在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中的作用目前未見文獻(xiàn)報道。本文應(yīng)用免疫組化方法研究Claudin-1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其與Ki-67、微血管密度的關(guān)系,探討Claudin-1的表達(dá)在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的意義。1材料和方法1.1質(zhì)瘤兩組年齡的性別分布取自福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2002年1月～2006年12月手術(shù)切除膠質(zhì)瘤存檔蠟塊50例,其中男26例,女24例,年齡15～70歲。所有標(biāo)本均經(jīng)常規(guī)4%中性甲醛固定,HE染色,按照WHO腫瘤分類(2000年)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤病理學(xué)與遺傳學(xué)分冊標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行膠質(zhì)瘤的分級,其中≤Ⅱ級的膠質(zhì)瘤17例,Ⅲ～Ⅳ級33例。1.2單克隆抗體檢測兔抗人Claudin-1多克隆抗體,購自美國ZYMED公司,鼠抗人Ki-67單克隆抗體(克隆號MIB-1)和CD34單克隆抗體(克隆號QBEnd/10)購自美國NeoMarkers公司,EnVision二步法非生物素免疫組化試劑盒購自美國DAKO公司。所有操作嚴(yán)格按照說明進(jìn)行。用已知乳腺癌Claudin-1陽性切片為陽性對照,PBS代替一抗為陰性對照。1.3細(xì)胞內(nèi)表達(dá)分析選擇具有非腫瘤區(qū)、腫瘤與非腫瘤移行區(qū)(交界區(qū))和腫瘤區(qū)的切片進(jìn)行研究分析。Claudin-1陽性染色者在細(xì)胞膜和/或漿有棕黃色顆粒沉著。根據(jù)腫瘤細(xì)胞膜和/或漿的染色程度以及染色細(xì)胞百分率進(jìn)行分析評分:基本不著色者為0分;著色淡者為1分;著色適中者為2分;著色深者為3分。著色細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞百分率≤5%為0分;6%～25%為1分;26%～50%為2分;≥51%為3分。將每張切片相同區(qū)域的腫瘤細(xì)胞著色程度得分與著色細(xì)胞百分率得分各自相乘,為每個區(qū)域腫瘤細(xì)胞染色的最后得分。得0～1分為陰性(-);得2～3分為弱陽性(+);得4～6分為中等陽性(++);6分以上為強(qiáng)陽性(+++)。1.4微血管密度檢測CD34陽性染色定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞,呈棕黃色顆粒沉著,腦組織內(nèi)孤立的棕黃色血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇代表一條單獨(dú)得微血管。在10×物鏡下分別在不同的分區(qū)挑選微血管分布最高的區(qū)域,然后在40×物鏡下(0.196mm2/每視野)計數(shù)5個視野中被CD34染成棕黃色的血管數(shù)目,取其平均值作為微血管密度。分辯不清或染色模糊的細(xì)胞不計入。1.5ki-67原子能育種抗劑的評價標(biāo)準(zhǔn)陽性染色者為細(xì)胞核呈現(xiàn)深棕色顆粒沉著。分別在不同區(qū)域計數(shù)1000個腫瘤細(xì)胞中Ki-67陽性標(biāo)記細(xì)胞數(shù)即為不同區(qū)域的標(biāo)記指數(shù)。1.6統(tǒng)計處理統(tǒng)計分析采用SPSS12.0軟件進(jìn)行。計數(shù)資料采用χ2檢驗,計量資料組間比較采用t檢驗。2結(jié)果2.1cladin-1對膠原瘤的檢查Claudin-1表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。2.2不同級別膠質(zhì)瘤claudin-1表達(dá)情況在非腫瘤區(qū),高、低級別的膠質(zhì)瘤其Claudin-1的表達(dá)(圖1a,圖2a)未見明顯差別;在膠質(zhì)瘤交界區(qū)(侵襲前沿),高級別膠質(zhì)瘤Claudin-1表達(dá)率(圖2b)明顯高于低級別的膠質(zhì)瘤(圖1b)(P<0.05);而在腫瘤區(qū),低級別膠質(zhì)瘤Claudin-1的表達(dá)率(圖1c)明顯高于高級別的膠質(zhì)瘤(圖2c)(P<0.05)(表1)。2.3膠質(zhì)瘤ki-雙n-9ki-雙1除非腫瘤區(qū)外,高級別膠質(zhì)瘤Ki-67標(biāo)記指數(shù)明顯高于低級別膠質(zhì)瘤(P<0.05)。對于低級別膠質(zhì)瘤來說,雖然腫瘤區(qū)的Ki-67標(biāo)記指數(shù)高于非腫瘤區(qū),但無統(tǒng)計學(xué)差異;而對于高級別的膠質(zhì)瘤,腫瘤區(qū)的Ki-67標(biāo)記指數(shù)明顯高于交界區(qū)和非腫瘤區(qū),交界區(qū)也高于非腫瘤區(qū)(P<0.05)(表2)。2.4雙側(cè)菌株7的表達(dá)低級別膠質(zhì)瘤不同分區(qū)中Claudin-1的表達(dá)與Ki-67的表達(dá)未見明顯關(guān)系;高級別的膠質(zhì)瘤,除非腫瘤區(qū)外,高表達(dá)Claudin-1的膠質(zhì)瘤其Ki-67的標(biāo)記指數(shù)明顯高于低表達(dá)Claudin-1者(P<0.05)(表1)。2.5低級別膠質(zhì)瘤中,各組織的mvd的比較在腫瘤區(qū)高級別的膠質(zhì)瘤的MVD高于低級別膠質(zhì)瘤的MVD,而在非腫瘤區(qū)和交界區(qū)無明顯差異(P>0.05)。在低級別膠質(zhì)瘤中,腫瘤區(qū)的MVD高于非腫瘤區(qū)和交界區(qū)的MVD,非腫瘤區(qū)和交界區(qū)間MVD未見明顯差異(P>0.05);而在高級別膠質(zhì)瘤中,腫瘤區(qū)MVD高于非腫瘤區(qū)和交界區(qū)MVD,交界區(qū)MVD高于非腫瘤區(qū)(P<0.05)(表2)。2.6結(jié)果表達(dá)數(shù)及>級膠質(zhì)瘤中ki-雙不論在腫瘤區(qū)、交界區(qū)還是非腫瘤區(qū),Claudin-1的表達(dá)與MVD未見明顯相關(guān)性(P>0.05)(表1)?！鞅硎劲蟆艏壞z質(zhì)瘤腫瘤區(qū)Claudin-1表達(dá)率與<Ⅱ級膠質(zhì)瘤比較,P<0.05#表示Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)Ki-67標(biāo)記指數(shù)與<Ⅱ級膠質(zhì)瘤比較,P<0.05□表示Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤腫瘤區(qū)和交界區(qū)Claudin-1高低表達(dá)組Ki-67標(biāo)記指數(shù)間的比較,P<0.05☆表示Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤交界區(qū)和腫瘤區(qū)MVD水平與<Ⅱ級膠質(zhì)瘤比較,P<0.05△表示Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤交界區(qū)與非腫瘤區(qū)Ki-67標(biāo)記指數(shù)比較,P<0.05#表示Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤腫瘤區(qū)與非腫瘤區(qū)Ki-67標(biāo)記指數(shù)比較,P<0.05□表示Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤腫瘤區(qū)與交界區(qū)Ki-67標(biāo)記指數(shù)比較,P<0.05☆表示Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤腫瘤區(qū)MVD水平與<Ⅱ級膠質(zhì)瘤比較,P<0.05○表示膠質(zhì)瘤交界區(qū)與非腫瘤區(qū)MVD水平比較,P<0.05

表示膠質(zhì)瘤交界區(qū)與腫瘤區(qū)MVD水平比較,P<0.05◎表示Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤交界區(qū)與非腫瘤區(qū)MVD水平比較,P<0.053claudin-1與腫瘤的關(guān)系Claudin屬于一類跨膜緊密連接蛋白,目前已發(fā)現(xiàn)有24個家族成員,分子量在～17-27kDa之間,其主要作用是確定通過細(xì)胞間分子的大小,第一個Claudin基因(CLDN1)是在篩查與整合素緊密連接蛋白,occludin相互作用的鼠類蛋白時鑒定的,與occludin、連接粘附分子1(JAM1)等其他整合素膜蛋白一起形成特異性的膜功能,包括維持細(xì)胞的極性和細(xì)胞間屏障功能。緊密連接蛋白表達(dá)的降低常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞極性消失及細(xì)胞間緊密連接功能失常。另外緊密連接蛋白還參與細(xì)胞增殖,分化的調(diào)節(jié)。Claudin蛋白主要位于細(xì)胞膜和/或細(xì)胞漿,目前的研究結(jié)果不一致,一些研究發(fā)現(xiàn)Claudin蛋白表達(dá)下調(diào)或不表達(dá),另一些研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)。作者通過觀察腫瘤的侵襲情況,鏡下將膠質(zhì)瘤分為非腫瘤性區(qū)、腫瘤與非腫瘤交界區(qū)和腫瘤區(qū),通過比較不同區(qū)域中Claudin-1的表達(dá)來探討與腫瘤生物學(xué)行為間的相關(guān)性。結(jié)果顯示Claudin-1的表達(dá)與患者年齡、性別和發(fā)生部位無關(guān),而與腫瘤的侵襲、組織學(xué)分級以及腫瘤的增生密切相關(guān)。Sheehan等發(fā)現(xiàn)前列腺癌中Claudin-1表達(dá)降低與腫瘤的分級呈負(fù)相關(guān),分級越高Claudin-1表達(dá)越低,多因素分析提示Claudin-1表達(dá)降低是前列腺癌獨(dú)立的預(yù)后參數(shù)。Higashi等也發(fā)現(xiàn)Claudin-1表達(dá)的丟失與肝細(xì)胞癌的組織學(xué)分級、靜脈內(nèi)癌栓形成明顯相關(guān),低分化和門靜脈癌栓形成的肝細(xì)胞癌Claudin-1表達(dá)丟失,提示Claudin-1表達(dá)下調(diào)可作為肝癌患者預(yù)后差的標(biāo)志。目前僅見Claudin-1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的研究。本文也有相似的結(jié)果,研究發(fā)現(xiàn)Claudin-1的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的侵襲、分級和瘤細(xì)胞的增殖明顯相關(guān),高級別的膠質(zhì)瘤Claudin-1表達(dá)降低,即丟失率增加。同時首次發(fā)現(xiàn)一個有趣的Claudin-1表達(dá)相反的現(xiàn)象,即Claudin-1的表達(dá)模式在腫瘤交界區(qū)與在腫瘤區(qū)明顯不同,在膠質(zhì)瘤交界區(qū)高級別的膠質(zhì)瘤其Claudin-1表達(dá)率明顯高于低級別的膠質(zhì)瘤(P<0.05),而在腫瘤區(qū)高級別的膠質(zhì)瘤其Claudin-1表達(dá)率明顯低于低級別的膠質(zhì)瘤(P<0.05)。這種表達(dá)模式相反的現(xiàn)象尚難以解釋,提示在膠質(zhì)瘤進(jìn)展的不同階段Claudin-1可能發(fā)揮不同作用,待深入研究。研究發(fā)現(xiàn)Ki-67標(biāo)記指數(shù)與膠質(zhì)瘤的組織學(xué)分級和預(yù)后密切相關(guān),Ki-67標(biāo)記指數(shù)越高的膠質(zhì)瘤患者其生存時間和復(fù)發(fā)時間越短本研究也發(fā)現(xiàn)高級別的膠質(zhì)瘤Ki-67標(biāo)記指數(shù)明顯高于低級別的膠質(zhì)瘤;同時高級別膠質(zhì)瘤的腫瘤區(qū)Ki-67標(biāo)記指數(shù)明顯高于交界區(qū)和非腫瘤區(qū),交界區(qū)也高于非腫瘤區(qū)。Halasz等在肝母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)Claudin-1的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖活性負(fù)相關(guān),提示侵襲強(qiáng)、高增殖活性的胚胎表型與Claudin-1表達(dá)降低/丟失有關(guān)。本文研究結(jié)果與之相反,顯示高級別的膠質(zhì)瘤Claudin-1的表達(dá)與Ki-67的標(biāo)記指數(shù)呈正相關(guān)性,即Claudin