南開大學(xué)儀器分析課件-第十二章 高效液相色譜分析法

第十二章高效液相色譜分析法

(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC）第一節(jié)概述一、HPLC的特點(diǎn)1、

高壓：液相色譜法使用液體作為流動相(簡稱載液)，液體流過色譜柱時，所遇到的阻力很大，為了使載液迅速通過色譜柱，必須對載液施加高壓150-350×105Pa。2、高速：高效液相色譜法的分析時間較經(jīng)典的液相色譜所需的時間要少得多，分離一個樣品只需幾分鐘至幾十分鐘，僅為經(jīng)典液相色譜的幾十分之一。3、

高效：一般氣相色譜法的塔板數(shù)是數(shù)千塔板／米，高效液相色譜法的塔板數(shù)可達(dá)約3萬塔板/米，使分離效率大大提高。4、

高靈敏度:紫外光度檢測器的檢測限可達(dá)10－9g，熒光檢測器的靈敏度可達(dá)10－11g。二.HPLC與GC的比較1.分析對象不同

GC:20%有機(jī)物總數(shù)(氣體、沸點(diǎn)較低的、熱穩(wěn)定的化合物）

HPLC：80%有機(jī)物總數(shù)（高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差）2.流動相不同

GC：僅起運(yùn)載作用

HPLC：除具有運(yùn)載作用外,還與組分產(chǎn)生親和力（增加了一個控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)）3.操作條件不同

GC：較高溫度

HPLC：室溫下進(jìn)行（設(shè)備費(fèi)用高）第二節(jié)HPLC的理論基礎(chǔ)一、范第姆特方程式：H=A+B/u+C·u1.渦流擴(kuò)散項－AA=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子固定相顆粒越小dp↓，填充的越均勻，A↓，H↓，n↑,柱效↑

。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。

2.縱向擴(kuò)散項（B/u)

B/u=2γDm/u

γ—彎曲因子

Dm—組分分子在流動相中的擴(kuò)散系數(shù)

Dm很小，只要流速u不是太低（不小于0.5cm/s

），

B/u項可忽略3.傳質(zhì)阻力項

液—液分配色譜

Cu=Cmu+Csu

Cmu—流動相傳質(zhì)阻力項

Csu—固定相傳質(zhì)阻力項Cmu=(ωmdp2/Dm+ωsmdp2/Dm）u（包含流動的流動相中的傳質(zhì)阻力和滯留的流動相中的傳質(zhì)阻力）

Dm—組分在流動相中的擴(kuò)散系數(shù)

ωm—柱和填充性質(zhì)決定的因子（柱系數(shù)）

ωsm

—與顆粒微孔中被流動相所占據(jù)部分的分?jǐn)?shù)及容量因子有關(guān)。

dp—固定相粒度Csu=(ωsdf

2/Ds)u

Ds—組分在固定相（液）的擴(kuò)散系數(shù)

ωs—與容量因子k有關(guān)的系數(shù)

df—固定相液膜的厚度

綜合式：H=2λdp+

2γDm/u+(ωmdp2/Dm+ωsmdp2/Dm+ωsdf2/Ds）u第三節(jié)高效液相色譜儀貯液罐高壓泵

進(jìn)樣器

檢測器記錄儀色譜柱溫度控制梯度洗脫裝置液相色譜儀（1）液相色譜儀（2）液相色譜儀（3）液相色譜儀（4）一、高壓輸液系統(tǒng)

1.貯液罐:

用來貯存作為流動相的各種溶劑

2.高壓輸液泵（核心）：使流動相較快的通過色譜柱(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性

3.梯度洗脫裝置：相當(dāng)于氣相色譜中的程序升溫，在樣品分離過程中按一定的程序通過改變流動相中兩種（或兩種以上）溶劑的比例來調(diào)整流動相的極性、離子強(qiáng)度、pH值外梯度:

利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:

一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。二.進(jìn)樣系統(tǒng)

1.隔膜注射進(jìn)樣器

2.高壓進(jìn)樣閥

三.分離系統(tǒng)——

色譜柱

不銹鋼制成，內(nèi)壁拋光，長度5-30cmid:4-5mm四.檢測系統(tǒng)檢測器應(yīng)具有：靈敏度高、噪音低、線性范圍寬、定量準(zhǔn)確、適應(yīng)范圍廣等特點(diǎn)，同時還應(yīng)該對溫度和載液流速的變化不敏感。

可用的檢測器有：紫外、熒光、折光、電化學(xué)、質(zhì)譜等

常用的檢測器有：紫外-可見光度檢測器和示差折光檢測器1.紫外-可見光度檢測器（包括固定波長型和可調(diào)波長型）固定波長型：常采用汞燈的254nm或280nm譜線可調(diào)波長型：光電二極管陣列檢測器（photodiodearraydetector,PAD)光電二極管陣列檢測器：

2048個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。

紫外-可見光度檢測器靈敏度很高，檢測限可達(dá)10-9g·mL-1（1）優(yōu)點(diǎn)：這種檢測器對溫度和流速不敏感，適宜于梯度洗提（2）缺點(diǎn)：不能用于對紫外-可見光完全不吸收的試樣的檢測2.示差折光檢測器

一種濃度型檢測器，是通過連續(xù)測定測量池中溶液折射率的變化來測定組分的濃度。（1）優(yōu)點(diǎn)：凡與流動相折射率不同的組分，都可以用示差折光檢測器來檢測，所以示差折光檢測器是一種通用型檢測器。示差折光檢測器的靈敏度可達(dá)10-7g·mL-1。（2）缺點(diǎn)：對溫度的波動很敏感，并且不能用于梯度淋洗。第四節(jié)HPLC的固定相和流動相一、固定相

固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。1.表面多孔型固定相它的基體是實心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等。表面活性材料為硅膠的固定相，如國外的Zpax，CorasilI和II，Vydac，Pellosil以及上海試劑一廠的薄殼玻璃珠等；表面活性材料為氧化鋁的固定相，如Pellumina；表面活性材料為聚酰胺的固定相，如Pellion。

這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達(dá)平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。2．全多孔型固定相由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。如國外的Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列，上海試劑一廠的堆積硅珠，青島海洋化工廠的YWG系列，天津試劑二廠的DG系列等。也可由氧化鋁微粒凝聚成全多孔型固定相，如國外的LichrosorbALOXT。這類固定相由于顆粒很細(xì)（5～10μm），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析.

二.流動相

HPLC流動相是液體，除具有運(yùn)載作用外，它對組分有親和力，并參與固定相對組分的競爭。由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力，并參與固定相對組分的競爭。因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是：（1）溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。（2）溶劑要與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。

溶劑的紫外截止波長指當(dāng)小于截止波長的輻射通過溶劑時，溶劑對此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，此時溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測量。對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達(dá)最高靈敏度。

（3）高純度。由于高效液相靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長值增加50～1OOnm。

（4）化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑。

（5）低粘度。若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇、乙腈等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離。

（6）毒性小，安全性好。第五節(jié)HPLC的主要類型及選擇一、液—液分配色譜（LLPC)（一）分離原理：與液—液萃取相同，根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。（二）固定相

固定液：β，β’-氧二丙腈強(qiáng)極性聚乙二醇中極性角鯊?fù)榉菢O性（三）流動相1.對流動相要求：盡可能不與固定相互溶，且與固定相的極性差別越顯著越好。2.流動相和固定相的極性程度

正相分配色譜：流動相極性<固定相反相分配色譜：流動相極性>固定相二、液—固吸附色譜法(LSAC)

根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進(jìn)行分離的。（一）、分離原理Kad=X—試樣分子S—流動相溶劑分子Kad↑→組分在吸附劑上保留強(qiáng)，難洗脫Kad↓→組分在吸附劑上保留弱，易洗脫(二)固定相吸附強(qiáng)弱不等的吸附劑,如:硅膠(適宜對脂肪胺、芳香胺分離）、氧化鋁（芳香烴異構(gòu)體分離）、聚酰胺等表面多孔型、全多孔型都可作吸附色譜中的固定相（三）流動相對極性大的試樣宜采用極性強(qiáng)的洗脫劑對極性弱的試樣宜采用極性弱的洗脫劑

三、尺寸排阻色譜法（SEC)

尺寸排阻色譜法（凝膠色譜法）：用于較大分子的分離，基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離。（一）、分離原理具有一定孔穴，體積大的分子不能滲入孔穴，先淋洗出；中等體積的分子部分滲透；小分子完全滲入，最后洗出色譜柱（二）、固定相1、軟性凝膠：葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠2、半剛性凝膠：高交聯(lián)度的聚苯乙烯3、剛性凝膠：多孔硅膠、多孔玻璃（三）、流動相

所選用的流動相必須能溶解樣品，并與凝膠本身非常相似以水溶液為流動相的凝膠色譜適用于水溶性樣品，以有機(jī)溶劑為流動相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。(常用:四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酰胺、水）四、分離類型的選擇（一）、根據(jù)相對分子質(zhì)量選擇相對分子質(zhì)量低的樣品——揮發(fā)性好，適合用GC相對分子質(zhì)量200-2000——標(biāo)準(zhǔn)液相色譜類型（液—固液—液、離子交換色譜）相對分子質(zhì)量>2000——尺寸排阻色譜（二）、根據(jù)溶解度選擇

樣品可溶于水并屬于能離