正常和腫瘤組織細胞的培養(yǎng)

關(guān)于正常和腫瘤組織細胞的培養(yǎng)第1頁，共79頁，編輯于2022年，星期一內(nèi)容正常組織細胞培養(yǎng)

上皮細胞的體外培養(yǎng)

血管內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)

腎小管上皮細胞的培養(yǎng)

巨噬細胞的培養(yǎng)

淋巴細胞的培養(yǎng)

腫瘤細胞培養(yǎng)第2頁，共79頁，編輯于2022年，星期一

不同組織細胞和器官的結(jié)構(gòu)和功能、生長特性不同，在體外培養(yǎng)中所需的分離方法和生長條件也不同。第3頁，共79頁，編輯于2022年，星期一上皮細胞的體外培養(yǎng)許多器官上的上皮細胞具有特定的功能，如腎和腸道上皮細胞具有吸收功能，肝和胰上皮細胞的分泌功能，肺上皮細胞的氣體交換功能；上皮組織還常發(fā)生腫瘤。第4頁，共79頁，編輯于2022年，星期一上皮細胞的基本特征：

1.上皮組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)

群體依賴性（populationdependence)

接觸抑制（contactinhibition)2.上皮細胞的極性

貼壁依賴性細胞-貼壁生長生長基質(zhì)

3.上皮細胞間的連接第5頁，共79頁，編輯于2022年，星期一體外培養(yǎng)的上皮組織細胞的生長生物學(xué)1.形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)：

均質(zhì)性、透明性很強，結(jié)構(gòu)不明顯第6頁，共79頁，編輯于2022年，星期一2.體外培養(yǎng)上皮組織的生長與增殖特征(1)

體外培養(yǎng)的特殊條件：

防范微生物污染生長基質(zhì)的支持特殊的培養(yǎng)基

M199RPMI1640DMEMFamF12

無血清培養(yǎng)基

去成纖維細胞第7頁，共79頁，編輯于2022年，星期一根據(jù)上皮組織分布的特性，位于體表或襯貼消化道、呼吸道內(nèi)等處的上皮組織，直接暴露或同外環(huán)境相接觸，組織本身帶有各種病原微生物或受其污染的機會較多。要求在組織取材時就嚴格滅菌；分離、種植、培養(yǎng)等諸多操作步驟上都要設(shè)法消除可能會出現(xiàn)的微生物污染。培養(yǎng)中所使用的各種液體，包括細胞保存液、分離液以及培養(yǎng)基等需添加抗生素，抗生素濃度比其它組織培養(yǎng)高。

防范微生物污染第8頁，共79頁，編輯于2022年，星期一皮細胞依賴貼附于某種支持物上才能生長，即所謂的貼壁依賴性細胞。在培養(yǎng)器皿表面包被生長基質(zhì)，如膠原或其它細胞外基質(zhì)成分等，模擬體內(nèi)的基膜結(jié)構(gòu)，不僅特別有利于上皮細胞的貼附和生長，也有利于培養(yǎng)細胞的分化．使細胞極性表現(xiàn)更為明顯。生長基質(zhì)的支持第9頁，共79頁，編輯于2022年，星期一M199和RPMI1640培養(yǎng)基僅適用于上皮組織的短期培養(yǎng)和維持其生存，對上皮組織的長期培養(yǎng)和促增殖作用并不明顯。DMEM和HamFl2培養(yǎng)基用于上皮組織培養(yǎng)時有其特殊作用。可促進上皮細胞的貼附；維持上皮細胞在體外培養(yǎng)狀態(tài)的分化。HamFl2培養(yǎng)基的特殊性特別適用原代上皮細胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分中添加微量元素的無機離子，更加利于細胞的生長和代謝。在實際培養(yǎng)時，將DMEM與HamFl2按一定比例混合用于上皮組織培養(yǎng)。特殊的培養(yǎng)基第10頁，共79頁，編輯于2022年，星期一去除成纖維細胞上皮組織借薄層基膜和結(jié)締組織相連。取材分離細胞時會帶入少量結(jié)締組織成分，常常造成成纖維細胞與上皮細胞混和生長。由于成纖維細胞具有增殖能力和粘附能力強的特點，很容易“瘋長”為培養(yǎng)物中的優(yōu)勢細胞群，從而干擾或抑制上皮細胞的生長，成為上皮細胞的“細胞污染源”。因此在上皮細胞的取材、分離、種植和傳代的培養(yǎng)過程中，要特別注意上皮細胞的純化，去除和抑制成纖維細胞的生長。第11頁，共79頁，編輯于2022年，星期一(2)體外培養(yǎng)上皮細胞的形態(tài)學(xué)變化第12頁，共79頁，編輯于2022年，星期一體外培養(yǎng)上皮組織細胞的觀察與檢測1.一般形態(tài)學(xué)觀察

光鏡：形態(tài)、輪廓、生長情況等。細胞規(guī)則、明亮而飽滿、細胞輪廓不清

電鏡：橋粒、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征、細胞間關(guān)系培養(yǎng)液pH變化：顏色變化？培養(yǎng)物的污染情況：

透明度變化？

第13頁，共79頁，編輯于2022年，星期一2.組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)觀察與檢測酶類：

堿性磷酸酶琥珀酸脫氫酶特異性抗原標記物：

角蛋白、上皮細胞膜抗原

VIII因子、晶體蛋白、唾液酸糖蛋白第14頁，共79頁，編輯于2022年，星期一血管內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)第15頁，共79頁，編輯于2022年，星期一人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)組織來源：

嬰兒臍帶培養(yǎng)用液：

M199+20%FCSD-Hanks0.1%膠原酶溶液1.主要材料：第16頁，共79頁，編輯于2022年，星期一2.培養(yǎng)方法：

分離細胞培養(yǎng)法第17頁，共79頁，編輯于2022年，星期一1).

將15-20cm長的新生兒臍帶放入無菌的PBS溶液中儲存。（注：4℃下最多貯存24小時，室溫下不超過6小時，否則廢棄）2).

用一個鈍頭的針頭扎入臍帶靜脈管中，用無菌的PBS溶液沖洗3-5次，將污血沖洗干凈為止。3).

用手術(shù)鉗夾緊臍帶下端，加入15ml的膠原酶（1mg/ml）室溫下消化15-20分鐘，并不時上下?lián)u動臍帶。4).

消化完后，將下端手術(shù)鉗松開，消化液流入一個50ml無菌離心管中，用無菌的PBS溶液沖洗臍帶2-3次。5).將收集液離心（2000轉(zhuǎn)/分）3分鐘，去上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細胞懸液，接種入培養(yǎng)器皿中，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，兩至三天可見細胞長成單層。

第18頁，共79頁，編輯于2022年，星期一

(1)關(guān)于接種材料的制備

取材與消化消化酶、濃度、時間

(2)排除成纖維細胞

傳代去除法加肝素培養(yǎng)法(90u/ml)

刮除法

(3)關(guān)于培養(yǎng)液

(4)關(guān)于傳代培養(yǎng)5.討論：第19頁，共79頁，編輯于2022年，星期一

(1)光鏡檢查

(2)透射電鏡檢查：

W-P小體

(3)VIII因子相關(guān)抗原的免疫組化檢測6.內(nèi)皮細胞的鑒定：第20頁，共79頁，編輯于2022年，星期一腎小管上皮細胞的培養(yǎng)第21頁，共79頁，編輯于2022年，星期一1.主要材料：

a.細胞來源：

b.無血清培養(yǎng)液：

基礎(chǔ)培養(yǎng)液：

DMEM/HamF12(1:1)

添加物：

胰島素5

g/ml

轉(zhuǎn)鐵蛋白5

g/ml

硒5

g/ml

氫化可的松36ng/mlT34ng/mlEGF10

g/ml第22頁，共79頁，編輯于2022年，星期一

c.消化液：

0.2%胰蛋白酶d.細胞篩網(wǎng)：

80和100目第23頁，共79頁，編輯于2022年，星期一2.原代培養(yǎng)：切取1cm3外層腎皮質(zhì)、剪碎成1mm380目研磨沖洗、于100目上收集腎小管節(jié)段0.2%胰蛋白酶消化、調(diào)整細胞數(shù)接種于纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)每隔3~4天，更換培養(yǎng)液第24頁，共79頁，編輯于2022年，星期一3.傳代培養(yǎng)：4.培養(yǎng)結(jié)果：

3d長出細胞

5~7d進入對數(shù)生長期

7~9d融合成單細胞層5.鑒定：抗角蛋白抗體染色（+）第25頁，共79頁，編輯于2022年，星期一6.注意事項：a.分離方法：b.鑒定方法：第26頁，共79頁，編輯于2022年，星期一巨噬細胞的培養(yǎng)

巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。巨噬細胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養(yǎng)，難以長期生存。巨噬細胞也建有無限細胞系，大多來自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l，培養(yǎng)中呈巨噬細胞形態(tài)和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難以建株。培養(yǎng)巨噬細胞可用各樣方法和各種來源來獲取細胞，以小鼠腹腔取材法最為實用。

第27頁，共79頁，編輯于2022年，星期一1、實驗前三天，向小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫羥乙酸肉湯lml（勿注入腸內(nèi)?。?，以刺流產(chǎn)生大量的巨噬細胞。2、引頸處死小鼠。3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3－5秒。4、置動物于解剖臺，用針頭固定四肢，持鑷撕開腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁，把皮膚拉向上下兩側(cè)，暴露出腹膜壁。5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同時用手指從兩側(cè)壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內(nèi)流動。6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側(cè)．使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內(nèi)。7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。8、4℃下250g離心10分鐘后，去上清，加10mlDMEM培養(yǎng)基。9、計數(shù)細胞。每只鼠可產(chǎn)生20一30×106細胞，其中90%為巨噬細胞。10、以3×105個貼附細胞/平方厘米接種。11、接種數(shù)小時后，除去培養(yǎng)液，可去除其它白細胞，純化培養(yǎng)細胞，用DMEM液沖洗1一2次，再加新DMEM培養(yǎng)液置CO2溫箱中。

第28頁，共79頁，編輯于2022年，星期一巨噬細胞的培養(yǎng)動物：

小鼠、大鼠、兔、人培養(yǎng)基：

EagleMEMRPMI1640HamF12常用的巨噬細胞：

肺泡和腹腔巨噬細胞第29頁，共79頁，編輯于2022年，星期一獲取巨噬細胞的方法（一）肺泡巨噬細胞

支氣管肺泡灌洗法支氣管鏡肺泡灌洗法（二）腹腔巨噬細胞

1.小鼠腹腔巨噬細胞的獲?。?/p>

(1)主要材料：實驗動物:6周齡小鼠培養(yǎng)液：

10%FCSRPMI1640

第30頁，共79頁，編輯于2022年，星期一巨噬細胞的純化1、原理：

巨噬細胞黏附能力強、貼壁快特點2.方法：用帖壁法純化巨噬細胞用不連續(xù)密度梯度離心純化巨噬細胞第31頁，共79頁，編輯于2022年，星期一1．用含20％～40％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將巨噬細胞配成2×106～4×106/ml的濃度。以每平方厘米2×105～4×105個巨噬細胞的密度將細胞懸液接種到玻璃培養(yǎng)皿（瓶）或塑料培養(yǎng)皿（瓶）中。37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時或24小時。1小時培養(yǎng)節(jié)省時間但會丟失一些粘附力弱的巨噬細胞，而24小時可以得到較多的巨噬細胞。20％～40％的小牛血清可以減少B淋巴細胞的粘附。2．搖晃培養(yǎng)皿（瓶），懸浮未粘附細胞，吸出細胞懸液。用預(yù)溫的Hanks液洗滌細胞3～4次。懸浮細胞可重復(fù)粘附，得到更多巨噬細胞。用適量含2.5mMEDTA的無鈣鎂Hanks液消化細胞37℃15～30分鐘。用吸管吹打分離細胞，離心250×g10分鐘，去上清液。3．用預(yù)冷Hanks液洗滌細胞3～4次，每次離心250×g10min，去上清。最后用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細胞，臺盼藍染色計數(shù)細胞并測細胞活力，將細胞配成所需濃度。

用帖壁法純化巨噬細胞第32頁，共79頁，編輯于2022年，星期一1．取15ml離心管，將制備好的各濃度密度梯度材料按下濃上淡的順序依次分層加在離心管中，每個濃度2ml。最后加上上述巨噬細胞懸液3～5ml（約含2×107～5×107細胞）。2．4℃中，水平離心1000×g30分鐘，垂直取出離心管，小心吸出各交界面的細胞。分別用預(yù)冷的含1％小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌各交界面細胞2次，每次200×g10分鐘。用含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將細胞配成所需的濃度。用不連續(xù)密度梯度離心純化巨噬細胞第33頁，共79頁，編輯于2022年，星期一巨噬細胞的接種和培養(yǎng)（一）主要材料：培養(yǎng)液：

RPMI1640等+10~40%FCS+抗生素

（二）實驗步驟：

a.冷分離

b.調(diào)整細胞濃度：2~4×106/mlc.接種培養(yǎng)第34頁，共79頁，編輯于2022年，星期一（三）培養(yǎng)結(jié)果：大?。?0~50

m形態(tài)：菱形、星形、圓形功能：吞噬功能增殖情況：不增殖、存活1~3周第35頁，共79頁，編輯于2022年，星期一（四）巨噬細胞的鑒定1.吞噬實驗：

加入0.001M(finalcon.)SiO2

吞噬泡2.抗胰蛋白酶消化能力試驗：

0.25%胰蛋白酶消化20min、再用吸管反復(fù)吹打細胞變園但不脫落3.細胞化學(xué)試驗：

ACP酶染色：棕黑色

NSE酶染色：紫藍色第36頁，共79頁，編輯于2022年，星期一淋巴細胞的培養(yǎng)第37頁，共79頁，編輯于2022年，星期一各類淋巴細胞的主要特征表面標志：

1.表面受體：

TCRSRBCRFcRMRMeaslesviruseRT淋巴細胞：第38頁，共79頁，編輯于2022年，星期一

MHCCD2.表面抗原第39頁，共79頁，編輯于2022年，星期一B淋巴細胞1.表面受體

BCRFcRCR

絲裂原受體

EBVR2.表面抗原

MHC抗原

CD抗原（CD19、20、21、23、45）第40頁，共79頁，編輯于2022年，星期一血淋巴細胞的分離（一）單個核細胞的分離密度梯度離心法外周血各種血細胞的密度不盡相同，利用淋巴細胞分層液（Ficoll）作密度梯度離心，使一定比重的細胞群按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。第41頁，共79頁，編輯于2022年，星期一外周血紅細胞粒細胞單個核細胞血小板淋巴細胞單核細胞1.0931.030~1.0351.075~1.090Ficoll：1.077±0.001

(PBMC)1.092PBMC:Peripheralbloodmononuclearcell第42頁，共79頁，編輯于2022年，星期一1.每毫升外周血液大約可獲1×106單個核細胞2.Ficoll應(yīng)適量，外周血應(yīng)充分稀釋2.溫度直接影響到Ficoll的比重和分離效果3.在Ficoll上加入稀釋外周血時，應(yīng)緩慢加，以免沖散界面4.吸取單個核細胞層時，應(yīng)避免吸出過多的上清液或分層液而導(dǎo)致血小板污染第43頁，共79頁，編輯于2022年，星期一1500rpm,20℃

,30minPBMC紅細胞粒細胞Ficoll稀釋外周血Ficoll稀釋的血漿、血小板第44頁，共79頁，編輯于2022年，星期一（二）純淋巴細胞的制備1.玻璃黏附法2.羰基鐵粉法第45頁，共79頁，編輯于2022年，星期一（三）T、B淋巴細胞的分離1.T細胞花環(huán)沉降法2.尼龍毛柱分離法第46頁，共79頁，編輯于2022年，星期一（四）大顆粒淋巴細胞的分離（五）FACS儀分離（六）免疫磁珠法第47頁，共79頁，編輯于2022年，星期一

三、血淋巴細胞的體外培養(yǎng)應(yīng)用第48頁，共79頁，編輯于2022年，星期一（一）淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗（二）B細胞產(chǎn)生Ig的檢查（三）T細胞介導(dǎo)的細胞毒試驗（四）NK細胞毒性試驗（五）K細胞毒性試驗

（六）LAK細胞的制備

（七）TIL細胞的制備第49頁，共79頁，編輯于2022年，星期一（八）淋巴細胞的體外長期培養(yǎng)1.用IL-2建立T淋巴細胞克隆2.用EB病毒轉(zhuǎn)化B淋巴細胞3.用B細胞生長因子建立B淋巴細胞株第50頁，共79頁，編輯于2022年，星期一腫瘤細胞體外培養(yǎng)第51頁，共79頁，編輯于2022年，星期一

腫瘤細胞與體內(nèi)正常細胞相比，不論在體內(nèi)或在體外，在形態(tài)、生長增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。生長在體內(nèi)的腫瘤細胞和在體外培養(yǎng)的腫瘤細胞，其差異較小，但也并非完全相同。培養(yǎng)中的腫瘤細胞具以下突出特點：

腫瘤細胞在體外的生長生物學(xué)特性㈠形態(tài)和性狀

培養(yǎng)中癌細胞無光學(xué)顯微鏡下特異形態(tài)，大多數(shù)腫瘤細胞鏡下觀察比二倍體細胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細胞表面的微絨毛多而細密，微絲走行不如正常細胞規(guī)則，可能與腫瘤細胞具有不定向運動和錨著不依賴性有關(guān)。

第52頁，共79頁，編輯于2022年，星期一㈡生長增殖腫瘤細胞在體內(nèi)具有不受控增殖性，在體外培養(yǎng)中仍如此。正常二倍體細胞在體外培養(yǎng)中不加血清不能增殖，是因血清中含有很細胞增殖生長的因子，而癌細胞在低血清中（2％～5％）仍能生長。已證明腫瘤細胞有自泌或內(nèi)泌性產(chǎn)生促增殖因子能力。正常細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后，出現(xiàn)能在低血清培養(yǎng)基中生長的現(xiàn)象，已成為檢測細胞惡變的一個指標。癌細胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個細胞培養(yǎng)時，形成集落（克?。┑哪芰Ρ日＜毎麖?。另外癌細胞增殖數(shù)量增多擴展時，接觸抑制消除，細胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。

第53頁，共79頁，編輯于2022年，星期一

永生性也稱不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細胞可無限傳代而不凋亡（Apoptosis）。

體外培養(yǎng)中的腫瘤細胞系或細胞株都表現(xiàn)有這種性狀，體內(nèi)腫瘤細胞是否如此尚無直接證明。多數(shù)腫瘤細胞初代培養(yǎng)時并不那么容易。生長增殖并不旺盛；經(jīng)過純化成單一化瘤細胞后，也大多增殖若干代后，便出現(xiàn)類似二倍體細胞培養(yǎng)中的停滯期。過此階段后才獲得永生性，順利傳代生長下去。說明體外腫瘤細胞的永生性有可能是體外培養(yǎng)后獲得的。從一些具有永生性而無惡性性的細胞系，如NIH3T3、Rat－1、10T1/2等細胞證明，永生性和惡性（包括浸潤性）是兩種性狀，受不同基因調(diào)控，但卻有相關(guān)性。可能永生性是細胞惡變的階段。至少在體外是如此。㈢腫瘤細胞永生性第54頁，共79頁，編輯于2022年，星期一（四）浸潤性

浸潤性是腫瘤細胞擴張性增殖行為，培養(yǎng)癌細胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養(yǎng)時，能浸潤入其它組織細胞中，并有穿透人工隔膜生長的能力。

（五）異質(zhì)性

所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細胞組成。異質(zhì)性構(gòu)成同一腫瘤內(nèi)細胞的活力有差別的瘤組織；處于瘤體周邊區(qū)的細胞獲得血液供應(yīng)多，增殖旺盛，中心區(qū)有的細胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態(tài)，那些呈活躍增殖狀態(tài)的細胞稱干細胞（StemCells）、只有這些干細胞才是支持腫瘤生長的成分。腫瘤干細胞培養(yǎng)時易于生長增殖；把干細胞分離出來的培養(yǎng)方法稱干細胞培養(yǎng)。

第55頁，共79頁，編輯于2022年，星期一（六）細胞遺傳

大多數(shù)腫瘤細胞有遺傳學(xué)改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細胞群常由多個細胞群組成，有干細胞系和數(shù)個亞系，并不斷進行著適應(yīng)性演變。

第56頁，共79頁，編輯于2022年，星期一（七）其它

腫瘤細胞在體外不易生長的原因可能由于：①依賴性：腫瘤細胞雖有較強克隆生長力，但仍有一定的群體性或與其它細胞相依存關(guān)系。一是腫瘤細胞與腫瘤細胞的相互依存，二是腫瘤細胞與基質(zhì)成纖維細胞的依賴。體外分散培養(yǎng)和排除成纖維細胞后也會同時消除或減弱這些依存關(guān)系，可能影響癌細胞增殖生長的活性；②腫瘤細胞的自泌也會因分散培養(yǎng)而被稀釋，達不到腫瘤生長的需求，降低腫瘤細胞的生長增殖力；③并非所有腫瘤細胞都有強的生長活力和長的LifeSpan，只有干細胞才有強的增殖生長能力，但這些細胞數(shù)量很少；④離體培養(yǎng)腫瘤細胞可能需求與體內(nèi)相似的特殊生存條件。第57頁，共79頁，編輯于2022年，星期一腫瘤細胞的培養(yǎng)方法

腫瘤細胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個方面。在具體培養(yǎng)方法方面，腫瘤細胞培養(yǎng)與正常組織細胞培養(yǎng)并無原則差別，初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。

第58頁，共79頁，編輯于2022年，星期一RPMI1640+10~20%FCS+0.03%谷氨酰胺：

上皮性癌細胞或懸浮性腫瘤細胞DMEM、199、MEM：

肉瘤細胞的培養(yǎng)F12、L-15:

上皮性癌細胞的培養(yǎng)（如肝癌細胞）加:2g/LNaHCO320mmol/LHEPES腫瘤細胞的培養(yǎng)方法：腫瘤細胞體外培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基（一）培養(yǎng)液的種類和選擇第59頁，共79頁，編輯于2022年，星期一（二）培養(yǎng)液特殊添加劑

常用的促細胞生長因子及使用的終濃度

添加劑終濃度

BSA10-5mol/mlTRF5~10ug/mlInsulin5ug/ml

氫化可的松10-6mol/mlEGF5ng/mlFGF5ng/mlNGF5ng/ml第60頁，共79頁，編輯于2022年，星期一腫瘤組織細胞的原代培養(yǎng)取材：人腫瘤細胞來自外科手術(shù)、活檢瘤組織、胸腹水穿刺、細針頭穿刺、內(nèi)窺鏡活檢等。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū)，取材時盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。

關(guān)鍵：新鮮、無菌、及時、準確第61頁，共79頁，編輯于2022年，星期一技術(shù)-分離純化分離：剪碎、酶消化、Ficoll、Percoll等密度沉降分離純化：反復(fù)貼壁去除成纖維細胞自然淘汰去除正常細胞利用特異抗原標志篩選法(panning)分亞型流式細胞儀分選克隆建株高轉(zhuǎn)移株的建立：反復(fù)接種第62頁，共79頁，編輯于2022年，星期一技術(shù)-培養(yǎng)原代培養(yǎng)：去除纖維細胞及淋巴細胞，防止細菌、真菌污染。傳代培養(yǎng)：增殖力低的細胞需要飼養(yǎng)細胞適當(dāng)密度,基本長滿后傳代,前10代不穩(wěn)定，注意培養(yǎng)條件，適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)基。第63頁，共79頁，編輯于2022年，星期一技術(shù)-鑒定與建株鑒定：組織來源、形態(tài)特征、核型染色體分析、生長特性、對細胞因子的反應(yīng)（TNF)、集落形成、致瘤實驗（裸小鼠）建株：生長半年以上，病理診斷、光鏡及電鏡觀察、生長特征、染色體分析、腫瘤標志、致瘤及轉(zhuǎn)移情況注意：不是每一腫瘤組織都能建株第64頁，共79頁，編輯于2022年，星期一腫瘤細胞對培養(yǎng)基的要求不如正常細胞嚴格，一般常用的RPMIl640、DMEM、Mc-Coy5A等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細胞培養(yǎng)。腫瘤細胞對血清的需求比正常細胞低，正常細胞培養(yǎng)不加血清不能生長，腫瘤細胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長。腫瘤細胞對培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大，是因腫瘤細胞有自泌（Autocrine）性產(chǎn)生促生長物質(zhì)之故。但這并不說明腫瘤細胞完全不需要這些成分。按不同細胞需要不同的生長因子；腫瘤細胞與正常細胞之間、腫瘤細胞與腫瘤細胞之間對生長因子的需求都存在著差異。但大多數(shù)腫瘤細胞培養(yǎng)中仍需要生長因子。有的還需特異性生長因子〔如乳腺癌細胞等）?？傊囵B(yǎng)腫瘤細胞仍需加血清和相關(guān)生長因子培養(yǎng)更易成功。第65頁，共79頁，編輯于2022年，星期一成纖維細胞的排除：

成纖維細胞常與腫瘤細胞同時混雜生長，致難以純化腫瘤細胞。而且成纖維細胞常比腫瘤細胞生長得快，最終能壓制腫瘤細胞的生長。因此排除成纖維細胞成為腫瘤細胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。第66頁，共79頁，編輯于2022年，星期一去除成纖維細胞的方法第67頁，共79頁，編輯于2022年，星期一是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）。刮除程序為：（1）標記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位；（2）刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標記空間；（3）用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細胞；（4）注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細胞殘留，可重復(fù)刮除至完全除掉為止。1、機械刮除法：第68頁，共79頁，編輯于2022年，星期一2、反復(fù)貼壁法：根據(jù)腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點，并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液，把含有兩類細胞的細胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類細胞相互分離，操作方法與傳代相同。（1）待細胞生長達一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，Hanks沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液；（2）取編號為此A、B、C三個培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)5～20分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B培養(yǎng)瓶中后；向A瓶中補充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)；（3）培養(yǎng)B瓶中細胞

5～20分鐘后，接處理A的方法，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中；再向B瓶中補加完全培養(yǎng)基。第69頁，共79頁，編輯于2022年，星期一

當(dāng)三個瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細胞，B瓶兩類細胞相雜，C瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復(fù)處理多次，直至癌細胞純化為止。3、消化排除法：此法曾用于乳癌細胞的培養(yǎng)，具體程序是：

（1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細胞脫落下來后，便立即停止消化；（2）把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶內(nèi)也補加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用此法處理后，成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落。經(jīng)過幾次反復(fù)處理，可能把成纖維細胞除凈。第70頁，共79頁，編輯于2022年，星期一4、膠原酶消化法：

本法是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點，通過消化進行選擇。（1）可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細胞被除掉后，即終止消化；（2）用Hanks洗滌處理一次后