rnai技術(shù)在農(nóng)業(yè)有害生物中的應用

rnai技術(shù)在農(nóng)業(yè)有害生物中的應用

干預后，基因（pts）壓縮性疾病首次在植物中發(fā)現(xiàn)（napoli等人，1990），但基因沉淀的真正原因是sdrn（多重共價）引起的共價遺傳模型。直到1998年，這才被證實為卡倫西亞病毒（柴胡等人，1998）?，F(xiàn)已在真菌、植物、線蟲、昆蟲、小鼠等許多真核生物體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象,目前的研究認為RNAi是生物進化過程中保留下來的一種抵抗病毒侵入(viralinvasion)、轉(zhuǎn)座子擴展(transposonexpansion)和對基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的強有力機制(Buckinghametal.,2004;Tijstermanetal.,2004)。由于RNAi誘導基因沉默的特異性和高效性,特別是在非模式生物之中操作的簡便性,現(xiàn)已廣泛的用于多種生物的基因功能研究之中,而且在基于RNAi技術(shù)的有害生物控制和疾病醫(yī)療方面也都展現(xiàn)出良好的應用前景(AuerandFrederick,2009;Perrimonetal.,2010)。在昆蟲學研究中,現(xiàn)在已經(jīng)采用注射、飼喂導入dsRNA或siRNA(smallinterferingRNA)的方法在多種昆蟲之中發(fā)現(xiàn)可以誘導RNAi的產(chǎn)生(Tereniusetal.,2011)。這些昆蟲包括鞘翅目、鱗翅目、膜翅目、雙翅目和直翅目等種類的昆蟲,而且研究還發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)昆蟲之中RNAi是系統(tǒng)性的,在某些昆蟲如赤擬谷盜Triboliumcastaeum和蟋蟀Gryllusbimaculatus之中還發(fā)現(xiàn),對親本實施RNAi在其子代中仍可觀察到基因沉默現(xiàn)象(Bucheretal.,2002;Roncoetal.,2008)。隨著研究的深入和多種昆蟲基因組序列的公布,利用RNAi方法對單個基因功能的分析已發(fā)展到對多個基因乃至整個基因組水平基因功能的研究之中。近年來,利用RNAi介導的轉(zhuǎn)基因植物控制害蟲,以及在野外控制益蟲病害的研究方面亦有了成功的報道(Baumetal.,2007;Maoetal.,2007;Hunteretal.,2010;Maoetal.,2010)。本文重點就RNAi與昆蟲免疫和RNAi技術(shù)在昆蟲學中的應用,以及RNAi在昆蟲系統(tǒng)生物學研究中的最新進展進行綜述。1非靶標基因的脫靶效應RNAi一般由dsRNA介導,然后被細胞內(nèi)一種稱之為Dicer的酶切割成21~25nt的siRNA,siRNA與RISC(RNA-inducedsilencingcomplex)結(jié)合,在ATP供能的情況下,尋找到與siRNA序列互補的靶mRNA進行切割,使其降解,最終達到了降低mRNA表達水平的作用?，F(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn),導致靶標基因沉默的小分子RNA除了siRNA以外,還有miRNA(microRNA)和endo-siRNA(endogenoussmallinterferingRNAs)(OkamuraandLai,2008;Ulvilaetal.,2010;Yamaguchietal.,2011)。在昆蟲基因功能研究中,導入蟲體的長鏈dsRNA進入細胞內(nèi)即會被Dicer切割成許多小片段的siRNA,而這些siRNA除了會與互補mRNA結(jié)合外,還有一些siRNA可能會與某些非靶標基因結(jié)合,即導致非靶標基因沉默而產(chǎn)生脫靶效應(off-targeteffects,OTEs)(Seinenetal.,2010)。在果蠅Drosophilamelanogaster之中的研究發(fā)現(xiàn)RNAi篩選時dsRNA設計不恰當會產(chǎn)生許多OTEs,而且當siRNA分子中有大于19以上的堿基與非靶標基因互補時,那么OTEs的幾率則會快速增加(Kulkarnietal.,2006;Maetal.,2006)。由此可以看出,OTEs對于我們通過RNAi來鑒定基因功能會有較大的影響,所以設計合適的dsRNA以避免OTEs的產(chǎn)生對我們得到準確的實驗結(jié)果顯得尤為重要。Seinen(2010)和Booker(2011)通過對果蠅進行生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)針對基因不同區(qū)域設計dsRNA可以有效避免OTEs的產(chǎn)生,這將會為我們在其它昆蟲中實施RNAi起到一定的參考作用,有助于我們在研究中得到較準確的結(jié)果。我們知道昆蟲為天然免疫系統(tǒng),包括體液免疫和細胞免疫2種方式,主要用來攻擊、消滅入侵病原體,從而為昆蟲的發(fā)育提供保障(王英和黃復生,2008)。RNAi作為基因功能研究的重要工具,研究發(fā)現(xiàn)其也是昆蟲抵抗外源病毒的一種重要的天然免疫反應,主要包括siRNA和miRNA介導的2種方式。siRNA介導方式主要是由外源病毒進入生物體細胞內(nèi)以后,以病毒作為模板合成與病毒RNA相對應的dsRNA,然后進入到RNAi途徑被Dicer切割成siRNA,并使RNAi信號在入侵外細胞間傳遞,從而導致病毒RNA的降解以起到抵御病毒的影響。例如Dicer基因突變的果蠅與其野生型相比對病毒的感染能力更為敏感,且隨著病毒滴度的提高其死亡率也逐漸增加(Galiana-Arnouxetal.,2006)。這即說明了RNAi參與了抵抗病毒的免疫反應。研究還發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)源性的miRNA也參與了維護和調(diào)節(jié)免疫反應的過程,其作用方式與siRNA的抗病毒方式相似。RNAi抵抗病毒的功能在植物中最初發(fā)現(xiàn),但是目前的研究表明在昆蟲、線蟲和哺乳動物細胞中這種抵抗病毒的天然免疫方式亦廣泛存在,是一種古老的抵抗外源核酸的保護機制(BerkhoutandHaasnoot,2006;Ulvilaetal.,2010;Blair,2011;Siuetal.,2011)。在這些生物體中,正是由于這種免疫機制的存在,才使我們通過RNAi對生物基因功能的研究成為現(xiàn)實。2內(nèi)森ri在昆蟲研究中的應用2.1ssna的合成和蛻皮RNAi技術(shù)自發(fā)現(xiàn)以來,已在昆蟲學研究中取得了廣泛的應用。例如在美國國家醫(yī)學圖書館的PubMed文獻檢索系統(tǒng)中以RNAi和insect為關鍵詞檢索,可以發(fā)現(xiàn)與昆蟲RNAi研究相關的文獻已近1400余篇。由此可見,自從1998年首次應用RNAi技術(shù)在果蠅胚胎中研究frizzled和frizzled2在Wingless途徑中的基因功能以來(KennerdellandCarthew,1998),RNAi技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代昆蟲學基因功能研究之中一項被廣泛采用的方法。在昆蟲中主要通過將dsRNA或siRNA分子導入到昆蟲細胞或活體昆蟲內(nèi)來實施RNAi。對于昆蟲細胞而言,可采用將其浸泡在dsRNA溶液中的方法來進行研究(Rogersetal.,2002)。而對活體昆蟲的研究,主要采用注射法和飼喂法2種。注射RNAi由于其相對簡便高效,已在包括鞘翅目、鱗翅目、膜翅目、雙翅目、半翅目、直翅目、蜚蠊目等多個種類的昆蟲中成功應用。作者實驗室利用注射法RNAi研究了甜菜夜蛾Spodopteraexigua幾丁質(zhì)合成通路中的相關基因SeCHSA、SeTPS、SeTre-1、SeTre-2和SeEcR的功能,明確了上述基因在甜菜夜蛾幾丁質(zhì)合成和蛻皮發(fā)育中的作用,為深入理解幾丁質(zhì)合成中的關鍵基因及篩選具有害蟲控制潛力的候選基因提供了理論基礎(Chenetal.,2008,2010;Tangetal.,2010;Yaoetal.,2010)。注射RNAi的方法雖然具有操作簡便,效率較高的特點,但是對于某些微小昆蟲往往會導致較高的蟲體死亡率,且技術(shù)要求頗高,因此研究人員在此基礎上又發(fā)展出了飼喂dsRNA的方法。通過飼喂RNAi的方法于2006年首先用來研究長紅烈蝽Rhodniusprolixus基因NP2和蘋果透翅蛾Epiphyaspostvittana的EposCXE1基因,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過飼喂dsRNA降低了靶標基因轉(zhuǎn)錄水平,這說明可以采用飼喂RNAi方法研究昆蟲的基因功能(Araujoetal.,2006;Turneretal.,2006)。飼喂RNAi一般是通過將試劑盒合成的dsRNA加入試驗昆蟲的飼料中來實施研究的,但是由于飼喂法與注射法相比其基因沉默的效率較低,所以一般需要較大量的dsRNA,這就將帶來研究成本的增加。作者實驗室在此基礎上發(fā)展出了利用大腸桿菌表達dsRNA方法來飼喂甜菜夜蛾,研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)取食dsRNA后幾丁質(zhì)合成酶基因SeCHSA的表達受到了抑制,且昆蟲的蛻皮發(fā)育也受到了阻礙(Tianetal.,2009)?，F(xiàn)在采用飼喂大腸桿菌表達dsRNA的方法研究相關基因的功能在棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、桔小食蠅Bactroceradorsalis和馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata中也已有了成功的報道(Houetal.,2010;Lietal.,2011;Liuetal.,2011;Zhuetal.,2011)。而現(xiàn)在采用飼喂RNAi的方法對基因功能的研究在其它類的昆蟲諸如玉米根螢葉甲Diabroticavirgiferavirgifera、雙蟋蟀Gryllusbimaculatus、小菜蛾Plutellaxylostella、歐洲玉米螟Ostrinianubilalis、褐飛虱Nilaparvatalugens、散白蟻Reticullitermesflavipes、意蜂Apismellifera和岡比亞按蚊Anophelesgambiae等多種昆蟲中也已被證實可行(Baumetal.,2007;Meyering-VosandMuller,2007;Zhouetal.,2008;Bautistaetal.,2009;FrancisandZilo,2009;Hunteretal.,2010;Khajuriaetal.,2010;Zhangetal.,2010)。飼喂法的應用不僅為一些難于采用注射RNAi研究的昆蟲提供了可供選擇的方法,更重要的是通過飼喂RNAi的方法可以篩選到一些可用于害蟲控制的候選基因資源,這將會為害蟲的可持續(xù)治理提供重要的保障。在昆蟲RNAi的研究過程中,由于dsRNA不會誘導產(chǎn)生類似于哺乳動物中的干擾素效應(inteferonresponse),所以目前發(fā)表的絕大多數(shù)論文中主要是以dsRNA在昆蟲中開展研究工作(Bridgeetal.,2003)。且由于siRNA的合成費用相對較高,因此以siRNA進行的研究工作只有極少的報道。但是最近日本研究者Yamaguchi等(2011)在家蠶Bombyxmori胚胎中實驗發(fā)現(xiàn),與dsRNA相比siRNA誘導的RNAi效果更佳。這即研究說明,在昆蟲中直接采用siRNA不僅會誘導基因沉默,而且對于一些直接采用dsRNA較難誘導RNAi產(chǎn)生的昆蟲和基因來說,采用導入siRNA的方法不失為一個較好的選擇。在果蠅中,研究人員采用Gal4-UAS系統(tǒng)在果蠅體內(nèi)表達dsRNA的方法誘導RNAi,這種方法可以在果蠅的多個組織中有效誘導可持續(xù)性RNAi產(chǎn)生,并且可在多個世代中觀察到有效的基因沉默(Milleretal.,2008)。由于此方法的有效性,果蠅中多個基因的功能已被解析,并且在美國哈佛醫(yī)學院建立了果蠅RNAi篩選中心(DrosophilaRNAiscreeningcenter,DRSC),現(xiàn)在果蠅中正利用RNAi對其整個基因網(wǎng)絡調(diào)控及系統(tǒng)生物學開展相關研究工作(Doumanisetal.,2009;Salehetal.,2009;Perrimonetal.,2010;Chooetal.,2011)。昆蟲RNAi研究一般是通過檢測靶標基因的沉默水平和分析相應生物表型來研究其相應基因功能,但是由于每個基因在生物體中具體功能的差異,并非每個基因的沉默均能導致可見的表型。例如在長紅烈蝽Rhodniusprolixus之中通過喂食針對唾液腺NP2基因的dsRNA有效降低了靶標基因的表達水平,然而卻沒有產(chǎn)生可見的表型(Araujoetal.,2006)。通過注射RNAi對家蠶pgFAR、pgACBP和PBANR等信息素生物合成途徑中的相關基因的抑制并沒有對蛹的發(fā)育和成蟲羽化產(chǎn)生任何影響,然而信息素的生物合成卻受到了抑制(Ohnishietal.,2006)。這就說明,并不是所有基因的沉默均會導致可見表型的產(chǎn)生,我們必須依據(jù)所研究基因的具體功能進行具體分析,不能以表型作為判斷RNAi實驗成功與否的絕對標準。2.2rnai誘導的基因?qū)οx控制的作用自從2007年中國和美國的研究人員在NatureBiotechnology雜志上發(fā)表的2篇獨立研究報告表明,通過RNAi介導的轉(zhuǎn)基因植物有可能用于害蟲控制,基于RNAi技術(shù)在害蟲控制中的研究就已成為昆蟲學中的熱門領域(Baumetal.,2007,2010)。這兩個研究小組均首先通過對候選基因進行篩選并選擇合適的目標基因,再通過轉(zhuǎn)基因植物表達相應dsRNA并確保目標害蟲取食dsRNA的量達到誘導RNAi的要求,這兩項措施為研究的成功提供了重要的保障。其研究結(jié)果也同時說明,通過RNAi介導的轉(zhuǎn)基因植物控制害蟲具有極大的潛力。最近在半翅目昆蟲褐飛虱和桃蚜Myzuspersicae中的研究結(jié)果更加使我們相信RNAi介導的轉(zhuǎn)基因植物在控制害蟲中的潛力。Zha等(2011)通過水稻表達NlHT1、Mlcar和Nltry基因的dsRNA飼喂褐飛虱若蟲,結(jié)果發(fā)現(xiàn)降低了中腸內(nèi)靶標基因的轉(zhuǎn)錄水平,但是并沒有觀察到死亡表型。作者實驗室在水稻中表達褐飛虱蛻皮激素受體基因的dsRNA,飼喂褐飛虱若蟲后發(fā)現(xiàn)其存活率雖然還有90%左右,但后代若蟲數(shù)卻減少了約30%~60%(未發(fā)表)。Pitino等(2011)通過對桃蚜飼喂表達腸道基因Rack1和唾腺基因MpC002dsRNA的轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥,研究發(fā)現(xiàn)目標基因的表達被抑制達60%以上,而且目標基因被抑制的桃蚜所產(chǎn)的后代數(shù)量更少。這些研究均表明,要通過RNAi介導的植物控制害蟲,篩選合適的靶標基因是成功的關鍵。目前的第二代高通量測序技術(shù)可以從mRNA直接獲得相應cDNA序列信息,這就使得對單個物種特別是非模式生物整個轉(zhuǎn)錄組和基因組的分析成為可能。利用此技術(shù)可以大規(guī)模的篩選用于RNAi植物進行害蟲控制的候選基因,這將極大的拓展目標抗蟲基因資源(Wangetal.,2011)。上述研究結(jié)果使我們相信,通過RNAi介導的轉(zhuǎn)基因植物在大田中控制害蟲極有可能成為現(xiàn)實,就如轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲植物的廣泛應用一樣。但是就像轉(zhuǎn)Bt基因植物存在的風險一樣,對RNAi轉(zhuǎn)基因抗蟲植物也必須進行相應的風險評估。例如在模式植物煙草和擬南芥中存在的RNAi植物抗蟲機制是否與目標農(nóng)作物中相同,是否有關鍵的差異和潛在的風險,這些問題目前都還沒有進行研究。雖然理論分析表明,RNAi植物與轉(zhuǎn)Bt基因植物不同,因為它不會產(chǎn)生有毒蛋白,而且在植物中小分子RNA的量相對比較少,這些都會使我們得出RNAi抗蟲植物風險較低的結(jié)論。但是小分子RNA在極低濃度下非?；钴S,而且有研究表明保存在濾紙上血液中的胞外RNA可以在32℃下保存達3月之久。而且轉(zhuǎn)入的基因還有可能產(chǎn)生OTEs和對非靶標生物造成一定的影響,特別是對人類健康可能產(chǎn)生某些潛在風險,這提醒我們也不能對RNAi抗蟲植物的風險掉以輕心,必須謹慎對待,對RNAi抗蟲植物提供科學的安全評價(AuerandFrederick,2009)。2.3食品產(chǎn)量和節(jié)能技術(shù)以前昆蟲RNAi的研究主要集中在昆蟲基因功能的解析和害蟲控制的研究之中,最近的研究顯示RNAi還可用于在野外控制益蟲的病害,這又進一步拓展了RNAi在昆蟲學研究中應用范圍。我們知道蜜蜂是昆蟲世界中非常重要的有益昆蟲,對于世界經(jīng)濟具有獨特的貢獻,它不僅給人類帶來香甜的蜂蜜,更重要是通過給植物授粉的方式為全世界帶來了近30%食品產(chǎn)量提升?？山陙碛捎谑艿紺CD(ConlonyCollapseDisorder)疾病的困擾,蜜蜂的生產(chǎn)遇到了嚴重的挑戰(zhàn),目前的研究認為CCD可能是由一種IAPV(Israeliacuteparalysisvirus)病毒引起,雖然這種病毒并未在所有診斷患有CCD疾病的蜂群中發(fā)現(xiàn),但是研究發(fā)現(xiàn)IAPV會導致蜜蜂的死亡。實驗室內(nèi)的研究證明,通過飼喂意蜂ApismelliferaIAPVdsRNA的方式可以有效抑制目標基因的表達(Maorietal.,2009)。最近Hunter等(2010)通過對意蜂的野外實驗發(fā)現(xiàn),IAPVdsRNA可以阻止蜜蜂自然養(yǎng)殖條件下受IAPV干擾而導致的死亡現(xiàn)象。這項研究分別在美國東北部的賓夕法尼亞州(Pennsylvania)和東南部的佛羅里達州(Florida)獨立進行,總共研究包括了160個蜂房。這項研究也是利用RNAi技術(shù)在益蟲的真實生態(tài)環(huán)境中進行病害控制的首次報道,為在真實的生物生存環(huán)境下利用RNAi控制益蟲病害提供了極具價值的探索。3采用rnai進行大規(guī)?；蚬δ苎芯康木唧w制度設計系統(tǒng)生物學的目標是致力于闡明細胞和生物體內(nèi)基因與蛋白水平之間相互作用調(diào)控的關系,明確在一個生物過程之中相關基因和蛋白所起的作用,以及當生物體受到刺激時細胞行為和反應的內(nèi)在復雜調(diào)控途徑。其特點是將生物體內(nèi)基因和蛋白的功能作用與生物體行為反應聯(lián)系了起來,而不是孤立研究單個基因或蛋白的功能,這將有助于更加準確的理解相關基因和蛋白在生物體中的作用和價值。與經(jīng)典正向遺傳學單基因分析技術(shù)相比,RNAi介導的反向遺傳學研究方法結(jié)合基因組學研究技術(shù)為大規(guī)?；蚬δ芎拖到y(tǒng)生物學的研究提供了更加有力的支持(Kohletal.,2010;NeumüllerandPerrimon,2011)。近些年,果蠅已經(jīng)成為在系統(tǒng)基因組范圍內(nèi)利用RNAi技術(shù)進行大規(guī)?；蚬δ苎芯康膬?yōu)勢系統(tǒng)。采用RNAi技術(shù)可以將果蠅特定的表型與相關基因或基因類群聯(lián)系起來,同時再結(jié)合蛋白與蛋白之間相互作用研究的數(shù)據(jù),可以闡明某一類特定表型下的調(diào)控網(wǎng)絡并提供一個遺傳框架,進一步的生化分析將有可能揭示表型下隱藏的分子機制。為了系統(tǒng)的研究果蠅特定細胞型的內(nèi)基因功能,研究人員構(gòu)建了大量果蠅轉(zhuǎn)基因RNAi系,主要有VDRC(ViennaDrosophilaRNAiCollection)目前擁有13327個,NIG-FLY(NationalInstituteofGenetics-FLY)保存有6000個,此外TRIP(transgenicRNAiproject)保存了2034個。這些果蠅RNAi系均基于Gal4-UAS系統(tǒng)在特定發(fā)育時期和組織中誘導RNAi的表達(Dietzletal.,2007;Nietal.,2009)。當然,由前文中的概述我們已經(jīng)知道利用RNAi大規(guī)模研究基因功能時有可能會導致OTEs,僅依靠生物信息學的分析還是不準確的,我們還必須以最終的RNAi表型作為確認的依據(jù)。果蠅作為昆蟲中研究最為深入的模式物種,通過RNAi對果蠅系統(tǒng)生物學的分析,并伴隨現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展,在果蠅中獲取的信息資源將有助于我們對其它種類昆蟲相關基因和基因組學的研究,這必將極大促進整個昆蟲系統(tǒng)生物學的發(fā)展。4采用第二代基因測序技術(shù)RNAi技術(shù)從誕生起就吸引了昆蟲學研究者高度關注的目光,現(xiàn)已成為當代昆蟲學特別是昆蟲基因功能研究方面的熱門工具,在多種昆蟲中均有了成