生物制藥工程設備【4】細胞生物反應器2

《生物制藥工程設備》細胞生物反應器細胞生物反應器CotterBrothersCo.(美國)提綱第一節(jié)發(fā)酵罐第二節(jié)動物細胞生物反應器第三節(jié)植物細胞生物反應器第四節(jié)細胞生物反應器的攪拌功率第五節(jié)細胞生物反應器中氧的傳遞第六節(jié)細胞生物反應器的放大第七節(jié)圓筒體和攪拌軸強度的計算預制一次性生物反應器第二節(jié)動物細胞生物反應器通用的微生物發(fā)酵罐不適用于動物細胞的大量培養(yǎng)，需要針對其特點和培養(yǎng)要求設計新型的細胞生物反應器通過動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)，可以得到疫苗、診斷試劑、單克隆抗體、酶等貴重藥品和生物制品。動物細胞沒有細胞壁，比較脆弱，對剪切作用十分敏感，甚至承受不了通氣鼓泡造成的剪切作用。動物細胞對培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求苛刻，對環(huán)境條件的變化也相當敏感。動物細胞培養(yǎng)難度大，多數(shù)設備結構復雜，一般生產(chǎn)規(guī)模比較小。因此，設備容積相比微生物發(fā)酵要小得多。一、氣升式細胞培養(yǎng)生物反應器開發(fā)于1956年。目前已廣泛地應用于動物細胞培養(yǎng)。最初用于大型化生產(chǎn)單細胞蛋白，后來發(fā)現(xiàn)可用于動植物細胞培養(yǎng)。雜交瘤細胞可在氣升式反應器中培養(yǎng)，也可以在攪拌槽式反應器中培養(yǎng)。一、氣升式細胞培養(yǎng)生物反應器一般采用內循環(huán)式，有時也采用外循環(huán)式。一、氣升式細胞培養(yǎng)生物反應器一、氣升式細胞培養(yǎng)生物反應器一、氣升式細胞培養(yǎng)生物反應器Air-liftbioreactorbeingraisedintopositionattheICI,Ltd.factory,Billingham,UK一、氣升式細胞培養(yǎng)生物反應器(一)反應器的操作規(guī)模從5L到10000L。逐級放大的主要問題是控制通氣速率和混合性能，以保證細胞、溶解氧和培養(yǎng)物質的均勻分布。培養(yǎng)工藝是采用階段式系統(tǒng)，如：先在10L反應器中培養(yǎng)2-3天，再逐級轉移到100L和1000L或更大的反應器。階段式培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)點：細胞優(yōu)化生長，從10L到1000L培養(yǎng)，共需17天，可生產(chǎn)單克隆抗體100g。(一)反應器的操作空氣進入采用環(huán)形管氣體噴射器，孔的設計要保證在規(guī)定的空氣流量下使氣泡直徑達到要求的范圍之內?？諝饬髁恳话憧刂圃?.01-0.06vvm，反應器的高徑比一般為3-12。(二)無菌控制材料：不銹鋼材質管道：盡量采用焊接，必要時可配備密封性能好的閥門和泵。滅菌：就地清洗(CIP)，就地滅菌(SIP)。氣體：除菌后噴入反應器；一定要經(jīng)過處理后再通過過濾器排放。培養(yǎng)基：過濾除菌。只要嚴格遵守操作規(guī)程，就可保證過程無菌(三)過程控制及自動化溶氧：自動調節(jié)進入空氣、純氧、氮氣的流量pH：在空氣中加入二氧化碳或在培養(yǎng)基中加入氫氧化鈉溫度：夾套循環(huán)水消泡：一般不會產(chǎn)生泡沫，如果需要可采用特定的消沫劑進行控制細胞生長：無菌取樣離線計數(shù)或通過氧的消耗量進行間接測定通過過程優(yōu)化后，氣升式反應器顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的反應器(三)過程控制及自動化動物細胞培養(yǎng)，一般首選氣升式反應器二、中空纖維管生物反應器膜反應器的一種，既可培養(yǎng)懸浮生長的細胞，又可培養(yǎng)貼壁依賴性細胞，細胞密度可高達109/ml。二、中空纖維管生物反應器中空纖維管生物反應器由多根中空纖維管組成，中空纖維管是半透性多孔膜，內徑為200μm，壁厚為50-75μm。氧與二氧化碳可以自由透過膜雙向擴散，而大分子的有機物則不能透過。動物細胞貼附在中空纖維管的外壁生長。生長表面積與容積之比可達40多倍。溶氧傳遞速率比懸浮培養(yǎng)高三倍。缺點：滅菌困難，一旦污染，將導致整個裝置報廢。二、中空纖維管生物反應器HollowfiberBioreactor二、中空纖維管生物反應器Crosssectionofahollowfibercartridge.二、中空纖維管生物反應器Biovest’shollowfiberbioreactors

二、中空纖維管生物反應器Crosssectionofahollowfibercartridge.二、中空纖維管生物反應器Cross-sectionofahollowfiberbioreactorshowingthefibersandlymphocytesinsuspensiongrowingaroundthefibers.二、中空纖維管生物反應器Scanningelectronmicroscope(SEM)imageofvascularsmoothmusclegrowingontheoutsideofthefiber;bovineaorticendothelialcellsareontheinsideofthefiber.二、中空纖維管生物反應器二、中空纖維管生物反應器AutovaxIDhollow-fiberbioreactor二、中空纖維管生物反應器二、中空纖維管生物反應器Hollowfiber二、中空纖維管生物反應器FiberCellSystemsHollowfiberBioreactor二、中空纖維管生物反應器FiberCellSystemsHollowfiberBioreactor二、中空纖維管生物反應器McGowanHollowfiberBioreactor三、通氣攪拌生物反應器動物細胞培養(yǎng)的通氣攪拌生物反應器要求剪切力小且混合性能好。三、通氣攪拌生物反應器(3-5個)轉速<50rpm載體不能進入氣腔氣泡不與細胞直接接觸旋轉鼓泡四、流化床生物反應器原理：支持細胞生長的微粒呈流化狀態(tài)。微粒的直徑為500μm左右，具有多孔性，可由膠原制備，再用無毒性的物質增加密度至1600kg/m3或更高，使其能在向上流動的培養(yǎng)液中呈流態(tài)化。細胞接種于微粒之中，通過反應器內向上循環(huán)流動的培養(yǎng)液使之成為流化床，并不斷供給必要的營養(yǎng)，使細胞得以生長。同時，新鮮培養(yǎng)基不斷加入，培養(yǎng)產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物不斷排出。四、流化床生物反應器反應器應滿足以下要求：(1)細胞密度高(2)高產(chǎn)細胞長時間停留在反應器中(3)優(yōu)化細胞生長與產(chǎn)物合成的環(huán)境四、流化床生物反應器流化床反應器既可以培養(yǎng)貼壁依賴性細胞，也可培養(yǎng)非貼壁依賴性細胞，可以達到較高的細胞密度。五、細胞培養(yǎng)灌注系統(tǒng)高密度培養(yǎng)動物細胞需要及時補給營養(yǎng)和排除有毒的代謝產(chǎn)物。分批培養(yǎng)通過部分換液實現(xiàn)營養(yǎng)的補給和有毒代謝物的排除。缺點是當細胞濃度達到一定量時，廢代謝物的濃度可能在換液前已達到抑制濃度。連續(xù)灌注可解決以上問題。五、細胞培養(yǎng)灌注系統(tǒng)分批培養(yǎng)中，細胞密度為2×106~4×106個/ml，灌注系統(tǒng)中可達2×107~5×107個/ml。五、細胞培養(yǎng)灌注系統(tǒng)五、細胞培養(yǎng)灌注系統(tǒng)

PerfusionBioreactorSideviewoftheperfusionchamber;Topdownviewoftheperfusionchamber;Representationofthebioreactorsetupwithperistalticpumpandmediareservoirattached.六、一次性生物反應器使用由三層塑料膜組成的一次性塑料袋替代培養(yǎng)管或培養(yǎng)罐。第一層：一般為聚對苯二甲酸乙酯(PET)或低密度聚乙烯(LDPE)，以提供機械穩(wěn)定性。第二層：使用的聚乙酸乙烯酯(PVA)或聚氯乙烯(PVC)制成，提供阻氣性。第三層：即接觸層，由PVA或聚丙烯(PP)制成。六、一次性生物反應器一次性生物反應器的攪拌與傳統(tǒng)生物反應器類似，但其攪拌器是預先滅菌并整合在塑料袋之中的，通過機械或磁力與驅動器連接。也有的一次性生物反應器通過振蕩實現(xiàn)攪拌作用。一次性生物反應器的參數(shù)測量較困難。pH主要通過含有pH敏感的微量pH包進行檢測。優(yōu)點：操作簡單，減少清洗和滅菌的步驟，降低染菌風險，降低成本(超過60%)缺點：氧的傳輸較差，參數(shù)控制困難六、一次性生物反應器WAVE生物反應器六、一次性生物反應器WAVE生物反應器六、一次性生物反應器六、一次性生物反應器七、動物細胞對剪切作用的敏感性動物細胞生物反應器與常規(guī)反應器的主要區(qū)別：要求在溫和地通氣和緩慢的攪拌條件下保證較高的溶氧水平。此外，大部分動物細胞為貼壁生長細胞，更容易受到湍流帶來的剪切作用和機械碰撞造成的破壞。在大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)中，剪切力主要來自深層通氣氣泡的破碎、機械攪拌引起的漩渦和機械剪力等。(一)氣泡對細胞的損傷一個氣泡內部的壓力可用下式表示：在普通發(fā)酵罐內氣泡平均直徑約為10-4m，則其半徑為5×10-5m，代入上式，有p=1.42KPa，若氣泡半徑為10-5m時，則壓力會更大。氣泡的破裂相當于“爆炸”，其剪切力對細胞的殺傷力很大。(一)氣泡對細胞的損傷在動物細胞培養(yǎng)過程中，加入較高濃度的血清和特定的非離子型表面活性劑可防止或減少氣泡破碎造成的剪切作用。原理是加入的血清和表面活性劑可在液相界面上形成了一層高度稠密的界面結構，起到了保護細胞的作用。在設計無泡通氣結構的反應器時，一般采用聚丙烯或硅橡膠為原料制成的多孔管作為通氣材料，可以有效地克服因氣泡破碎而引起的剪切損傷。(二)機械攪拌和湍流漩渦對細胞的損傷氧傳遞效果的好壞直接關系到反應器的生產(chǎn)能力。采用機械攪拌加強液相的湍流可以提高氧的傳遞，而液相湍流和槳葉帶來的剪切力大小及其對培養(yǎng)的影響非常重要。在微載體培養(yǎng)中，當槳葉產(chǎn)生剪切力增加到一定的程度時，生長速度會突然下降。容易對細胞造成傷害的還有液相中的某些小的湍流漩渦，其大小及速度都會影響細胞的生長。此外，湍流中微載體之間的碰撞、微載體與反應器內靜止部件的相互碰撞產(chǎn)生的剪切力同樣會對細胞產(chǎn)生損傷。(三)剪切力的估算對細胞產(chǎn)生損傷的臨界剪切力為：τcr=5Pa以昆蟲細胞在氣升式反應器中培養(yǎng)為例，其最大剪切力可用下式計算：若取液體密度ρL=1000kg/m3，阻力系數(shù)取最高值Kw=1.3，則可得出最大允許流體流速接近w。(三)剪切力的估算在氣升式反應器中，氣泡的噴射、上升和破碎是產(chǎn)生剪切力的三個主要因素，其剪切力可根據(jù)牛頓黏性定律進行估算：在培養(yǎng)液中，一般有類似甲基纖維素一類的物質時，其最大黏度可達μ=50×10-3Pa·s，假設細胞一邊流體的速度等于臨近氣泡的速度，另一邊的速度為零，氣泡的速度取噴射口處的速度wi，其值可用下式近似求得：(三)剪切力的估算取每個孔的氣體流量V=10-3m3/h，di=1mm，則可求出ωi。ωi=(三)剪切力的估算dx取細胞直徑18μm，μ=50×10-3Pa·s。即可計算得到噴嘴處的剪切力：將計算得到的wi代入下式：τ=(三)剪切力的估算氣泡上升的速度大致為0.25m/s左右，由此可計算得到氣泡上升的剪切力為700Pa，比臨界值仍然高出很多。氣泡在液體表面下，由于液膜的表面張力作用會使液膜破碎，液體返回到液相主體時，必然伴隨一定流體速度的產(chǎn)生。若取該速度為1.3m/s，此速度不算大，但產(chǎn)生的氣泡破碎剪切力可高達3.7KPa，是產(chǎn)生剪切力三個主要因素中的最大值。(三)剪切力的估算通過上面的計算結果可以看出，在通氣的條件下培養(yǎng)細胞，產(chǎn)生的剪切力遠遠超過細胞所能承受的臨界剪切力。在實際通氣時，高的剪切力只能再瞬間對細胞起作用。由于細胞本身的伸縮性很大，足以在一定范圍內忍受大多數(shù)短時間的剪切。由此也可得出細胞膜表面張力小有助于提高細胞形狀的伸縮性