小麥東農和大麥種植酸酶的活性測定

小麥東農和大麥種植酸酶的活性測定

許多植物種子和加工副產品含有天然植酸酶，但不同類型和品種的植物之間存在較大差異（bartnik等人，1987）。麥類籽實中如小麥、大麥、小黑麥、黑麥等具有較高植酸酶活性,而玉米、高梁、油菜籽中的植酸酶活性很低(韓延明等,1995;Eeckhout等,1994;Pointillart1993)。植物植酸酶的最適pH為4.0～6.0,適宜溫度為45℃～60℃(Eeckhout等,1994;Reddy等,1982),但對不同種類植物中植酸酶特性尚缺乏系統(tǒng)的研究。一些研究證實,高植酸酶活性的植物性飼料中磷的利用率較高Nelson,1980),而且,植物中的植酸酶能夠在飼料中發(fā)揮作用,提高飼糧中磷的利用率(韓延明等,1995;Newton等,1983;Scheuermann等,1988;Pointillart,1991;Barrier-Guillot等,1996)。如能合理利用植物性飼料中的這部分植酸酶,植物將是植酸酶的最廉價的來源,因為,它本身即為植物性飼料中的天然成分,不需要額外的增加成本。但是,植物性飼料中天然植酸酶活性很低,提高其活性是開發(fā)利用這部分植酸酶的關鍵步驟。研究表明,當種子吸水萌發(fā)時,植酸酶活性迅速增強(傅啟高,1998;盧良恕,1996;劉迅等,1998)。因此,有希望通過發(fā)芽提高植物籽實中植酸酶活性,直接利用發(fā)芽飼料或從中提取植酸酶因此,本試驗的目的在于研究發(fā)芽對麥類籽實中植酸酶活性的提高程度及麥類籽實中植酸酶的適宜溫度和pH范圍,探討其在飼料中應用的可行性。1材料和方法1.1農學種植及小黑麥加工小麥東農123(WheatNEAU123)、小麥東農973821(WheatNEAU973821)、大麥墾啤2號(BarleyK2)、小黑麥92021(Triticale92021)、小黑麥5305(Triticale5305)及黑麥2號(Rye2),均由東北農業(yè)大學農學院提供。1.2植酸粗酶液的提取風干樣粉碎過0.25mm(60目)篩,用醋酸鈉緩沖液(0.25mol/L,pH=5.50)攪拌抽提1小時,過濾,所得濾液定容即為植酸粗酶溶液。鮮麥芽先勻漿,其他步驟與上述相同。測定方法參照張若寒(1997)、陸文清等(2000)介紹的方法。植酸酶的含量以酶活性單位表示。1植酸酶單位定義為:在37℃、pH5.5的條件下,1分鐘內從0.0051mol/L的植酸鈉溶液中釋放出1μmol無機磷所需要的植酸酶量。1.3保濕和保濕液制備將100g左右風凈的種子放入墊有濾紙的培養(yǎng)皿,厚度以不超過2cm為宜。加入蒸餾水,置于25℃恒溫培養(yǎng)箱。每天澆水4次。分別于發(fā)芽第1、2、3、4、5、6天取樣測其中酶活和干物質含量。1.4不同因素對植酸酶活性的影響以小黑麥5305為代表,固定底物pH值為6.0、5.5、5.0,調節(jié)水浴鍋溫度為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃,分別測定其中植酸酶的活性。固定反應溫度于37℃、55℃,調節(jié)底物pH值為8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.02.5、1.5,分別測定其中植酸酶的活性。1.5數據分析所得數據用SAS6.12軟件包進行數據處理和統(tǒng)計分析。所有數據均以“X±SE”表示,其中n=4。2結果2.1不同發(fā)芽時間、不同小麥、天麻發(fā)芽能夠提高麥類籽實中植酸酶的活性,見表1。從表中可以看出,麥芽中植酸酶的活性與發(fā)芽時間密切相關,隨著發(fā)芽時間的延長而增強,但不同麥類的籽實植酸酶活性達到最高點所需的發(fā)芽時間不同。小黑麥和黑麥在發(fā)芽第1天麥芽中植酸酶的活性最高,絕干基礎植酸酶活性與未發(fā)芽前相比差異極顯著(P<0.01),此后即隨著發(fā)芽時間的延長而逐漸下降;小麥、大麥麥芽中植酸酶活性在第3天才達到最強。不同種類、品種的麥類發(fā)芽過程中植酸酶提高的程度不同。以干物質基礎酶活達到最高點計算,與未發(fā)芽前相比,小麥東農123、小麥東農973821、大麥墾啤2號、小黑麥92021、小黑麥5305、黑麥2號麥芽中植酸酶活性分別增加到2.04、2.55、4.63、1.36、1.82和2.45倍。2.2不同ph值對植酸酶活性的影響植酸酶和其它酶一樣,其活性受溫度的影響,結果見圖1。從圖中可以直觀地看出,在一定溫度范圍內,植酸酶活性隨溫度升高而升高,甚至遠遠地超過標準條件下的酶活性,達到一定臨界溫度后,植酸酶的活性迅速下降,呈現出鐘形曲線。在50℃處,植酸酶活性最大,在40℃～60℃范圍內可保持較高的酶活。表現最大酶活的溫度點與反應體系的pH值有關,隨pH值的降低,整個酶活—溫度曲線右移,即在較低pH條件下,植酸酶的耐熱性能提高。當pH為6.0時,在45℃處具有最大活性,而當pH變?yōu)?.5、5.0時,則分別在50℃、55℃處酶活性最高,但pH為5.5時植酸酶的最大酶活高于其它pH條件下的最大酶活。2.3麥類籽實中植酸酶的最適phpH值與植酸酶活性的關系亦表現為典型的鐘形曲線,在pH5.5處酶活性最大(圖2)。麥類籽實中植酸酶pH范圍很窄,僅在4.5～6.5之間具有較高活性,pH低于4.0或高于7.0時,植酸酶的活性幾乎完全喪失。溫度升高使植酸酶的適宜pH降低。溫度與pH對植酸酶活性的影響表現出互作效應。3討論3.1不同發(fā)芽時間對植酸酶活性的影響植物種子中存在的植酸酶在干燥狀態(tài)下不表現活性,當種子吸水開始發(fā)芽時期,植酸酶被激活并水解植酸鹽,釋放出無機磷供作物生長,因此發(fā)芽可以增加種子中植酸酶活性。植酸酶的活性一般隨萌發(fā)時間增加而增強,在小麥種子中植酸酶活性每千克干種子為680U,吸水第一天為930U,第二天為1400U,第三天為2120U。萵苣種子萌發(fā)72小時后植酸酶的活性增大6倍。大豆發(fā)芽5天后,植酸酶活性提高2.27倍,Dwarf灰豆和Alaska豆分別提高8.07倍和37.56倍(博啟高,1998)。大麥在籽粒萌發(fā)期間,植酸酶活性可增至原來的8倍左右(盧良恕,1996)。本試驗的結果也顯示,麥類籽實發(fā)芽后植酸酶活性極顯著高于發(fā)芽前(P<0.01),但提高程度均低于上述報道,大麥發(fā)芽后植酸酶活性提高的程度最大,也僅為原來的4.63倍。研究中同時發(fā)現,發(fā)芽后植酸酶活性達到最大值所需的時間也低于其他研究者報道的發(fā)芽天數?？梢娭参锲贩N、發(fā)芽條件影響植酸酶活性的提高程度。本研究中,發(fā)芽對植酸酶活性提高程度有限,遠低于前人的報道。今后尚需進一步選擇適宜的品種,優(yōu)化發(fā)芽條件。植酸酶活性在發(fā)芽期間呈現先增高然后有逐漸降低的趨勢,劉訊等(1998)在研究玉米和番茄種子發(fā)芽期間植酸酶活性變化時也發(fā)現了同樣的規(guī)律。作者認為,在種子萌發(fā)后期,因貯藏態(tài)養(yǎng)分耗盡,植酸酶的合成降低。種子萌發(fā)的物質效率較低,種子的干物質損失很大。因此,需選取適當的時間點,優(yōu)化植酸酶和干物質之間的關系,以獲得最佳效益。3.2不同ph對植酸酶活性的影響植物植酸酶的最適pH為4.0～6.0,在pH3.0時活性顯著下降甚至完全失活(Eeckhout等,1994)。Peers等(1953)發(fā)現來源于小麥的植酸酶最適pH為5.15,最適溫度為55℃。Reddy等(1982)認為植物植酸酶最適pH為5.0,適宜溫度為45℃～60℃。Gibson和Ullah(1990)研究了大豆植酸酶的性質,其適宜的pH是4.5～4.8,當pH為6以上時,活性迅速下降;適宜的溫度是50℃,在60℃時發(fā)生變性。張暉等(1998)對小麥麩中植酸酶性質進行了研究,其最適溫度為55℃,最適pH為5.2,當pH值為4或6時,酶的活力下降了近一半。本試驗研究了小黑麥5305中植酸酶的性質,試驗結果與上述報道基本一致。適宜溫度為50℃,在40℃～60℃范圍內可保持較高的酶活;適宜pH為5.5,低于4.0或高于7.0,活性基本喪失。單胃動物胃中pH一般為1.5～3.5,小腸pH為5～6,小腸中的酸堿環(huán)境適合植物性植酸酶發(fā)揮作用。植物植酸酶在籽實中呈結合態(tài)存在,是否能夠經受住胃中低pH的破壞作用,到達小腸中再發(fā)揮作用,有待于進一步研究。家禽嗉囊中pH在4.39～4.82之間,溫度約為40℃,而且飲水可將飼料濕潤和軟化并激活植酸酶活性,另外,飼料在此處與植酸酶均勻混合,停留時間長達2小時(宋金彩,2000),因此嗉囊中的環(huán)境適合植酸酶的作用。本試驗發(fā)現,溫度和pH對酶活性的影響存在著互作效應。降低pH能提高植物植酸酶對熱的相對穩(wěn)定性,而提高