四環(huán)素類抗生素的分離和鑒定

四環(huán)素類抗生素的分離和鑒定

四環(huán)素抗生素是臨床上廣泛使用的光譜抗生素。由于它既有抗生作用和抗炎作用，近年來，四環(huán)素被用于治療各種非感染性疾病，并取得了良好的治療效果。此外,在包括美國在內(nèi)的一些國家,四環(huán)素還被大量用作生長促進劑投喂給動物。故其在藥品市場中占有重要地位。1圖4所示的四環(huán)素類抗生素1948年,高效廣譜、具有口服活性的第一個四環(huán)素類金霉素(chlortetracycline)從鏈霉菌aureofacients中提取得到。在隨后短短幾年內(nèi)土霉素和四環(huán)素也被從鏈霉菌發(fā)酵液中分離得到,這三種四環(huán)素類抗生素都顯示了完全的交叉抗性,它們有著相似的,廣泛的抗菌譜,不僅對革蘭氏陽性,革蘭氏陰性和支原體,甚至對立克次體和衣原體之類的微生物都有活性。1957年,去甲環(huán)素也被發(fā)現(xiàn),通過對這些抗生素進行降解研究,發(fā)現(xiàn)它們具有極為相似的化學(xué)結(jié)構(gòu),有四個環(huán)線形相連構(gòu)成主體骨架,從此“四環(huán)素”被看成一類新的抗生素。隨著四環(huán)素類抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)被逐漸澄清,許多實驗室加入到開發(fā)半合成品的研究工作中。美他環(huán)素、多西環(huán)素和米諾環(huán)素為一些最重要的半合成品,稱為第二代四環(huán)素。為了獲得在中性pH值下,水溶性良好、利于吸收的四環(huán)素類衍生物,通過對酞氨基團的修飾,得到了毗咯烷甲四環(huán)素和賴甲四環(huán)素。2外輸泵基因超家族耐藥四環(huán)素類抗生素的廣譜抑菌作用是通過干擾細菌蛋白質(zhì)的合成起作用的。四環(huán)素類有既抑制70S,又抑制80S核糖體的功能,能和16SrRNA上臨近與氨酞tRNA連接的區(qū)域形成可逆復(fù)合物。從作用機制上看是非選擇性的,但四環(huán)素類抗生素對細菌有選擇性毒性,因為原核細胞中的主動轉(zhuǎn)運體系能使藥物特異地透過細胞,真核細胞卻能主動地外排這類抗生素。在革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中都有外輸泵基因,而且大部分外輸泵基因都具有四環(huán)素抗性。四環(huán)素外輸泵蛋白屬于主要異化超家族(MFS),是目前Tet蛋白中研究最清楚的。所有tet外輸泵基因都編碼膜相關(guān)蛋白可將四環(huán)素泵出胞外,降低了細胞內(nèi)藥物濃度保護了胞內(nèi)的核糖體,從而產(chǎn)生耐藥性。Tet(X)基因是唯一通過產(chǎn)生滅活四環(huán)素的酶而耐藥的。已報道兩株厭氧擬桿菌轉(zhuǎn)座子上攜帶有Tet(X)基因。Tet(X)產(chǎn)生44ku胞漿蛋白,它在氧和NADPH存在時可化學(xué)修飾四環(huán)素,序列分析表明這個酶與其他NADPH需要的氧化還原酶有同源性。細菌對四環(huán)素類抗生素的耐藥機制主要有兩點:(1)由質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子編碼排出系統(tǒng);(2)由質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子編碼的核糖體保護因子表達。已分離出由不同四環(huán)素耐藥因子編碼的一組分子量為42Kda的細胞膜內(nèi)蛋白。Tet(A-E類存在于腸球菌中,K和L類存在于G+菌中)的表達將導(dǎo)致藥物被排出體外,從而產(chǎn)生耐藥性。這種耐藥性是由四環(huán)素誘導(dǎo)產(chǎn)生的。Tet的抑制因子對大腸埃希菌體內(nèi)TetA的產(chǎn)生進行負調(diào)節(jié),但四環(huán)素能與該抑制因子結(jié)合從而使其失去活性并導(dǎo)致細菌產(chǎn)生耐藥性。近年來報道了兩類由質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子編碼的核糖體的保護因子TetM和TetO。雖然它們的確切作用尚未明了,但普遍認為它們通過自身與四環(huán)素類抗生素的結(jié)合而阻礙四環(huán)素與核糖體的結(jié)合,從而起到保護核糖體的作用。3反應(yīng)物系抗生素類化合物的合成在對天然四環(huán)素類抗生素進行化學(xué)改造的同時,還有一些學(xué)術(shù)機構(gòu)致力并最終完成了四環(huán)素類抗生素全合成的研究工作。Muxfeldt、Lederle、Woodward和Barton等都在這方面做出了突出貢獻。雖然繁復(fù)的化學(xué)反應(yīng)過程和艱難的色譜純化過程使得這些全合成過程難以付諸實施,但他們的努力使四環(huán)素類抗生素的構(gòu)效關(guān)系更加清楚明了,一些重要的化學(xué)反應(yīng)也為后來高效優(yōu)良的半合成品打下了堅實的基礎(chǔ)。四環(huán)素的主體骨架是由Muxfeldt首次合成的,但得到的最終化合物沒有生物活性。Barton等也進行過全合成的研究,但未取得成功。后來Woodward研究團體完成了四環(huán)素衍生物結(jié)構(gòu)的全合成,這是第一個具有生物活性的純合成四環(huán)素衍生物。隨后Gurevich,Katpetjan及Kolosovy等研究團體從不同途徑合成了脫水四環(huán)素。在所有的合成工作中,最值一提的要算Muxfeldt,Vedejis等對土霉素的全合成研究。4高效四環(huán)素衍生物由于四環(huán)素類抗生素的大量使用,對四環(huán)素耐藥菌株日漸增多,使其臨床應(yīng)用受到很大限制。但近年來,新型四環(huán)素類化合物的合成和四環(huán)素類非抗菌作用的不斷發(fā)現(xiàn)為其臨床新用開辟了廣闊的前景。從80年代起,發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類抗生素具有很多非抗菌作用。研究表明,四環(huán)素類抗生素包括無抗菌作用的CMT類,可抑制膠原酶、明膠酶、溶基質(zhì)素等基質(zhì)金屬蛋白酶,并阻止病理性結(jié)締組織損傷。四環(huán)素有抑制磷脂酶活力的作用,四環(huán)素通過抑制CZYD7胞外磷脂酶的分泌,降低了菌株的毒性。最近由Dactylosporajium發(fā)酵得到了帶有糖殘基的四環(huán)素衍生物(Dactylocycline),其C-6位置甲基和羥基的構(gòu)象和其他四環(huán)素衍生物恰恰相反。它對四環(huán)素敏感型及耐藥G+菌都有良好的活性,但對G-菌沒有活性。但Dactylocycline的脫糖衍生物Aglycone對G-菌有活性。C-9-甘氨酞四環(huán)素Glycylcyclines是新一代廣譜高效四環(huán)素類衍生物。它們對含有核糖體保護因子(TetM和TetO)或排出因子(TetE,K和L)的四環(huán)素敏感株和耐藥株均有效;它們對G+菌和G-菌都有效,包括對米諾環(huán)素、萬古霉素和β-內(nèi)酞胺類抗生素耐藥的菌株。其中最具開發(fā)前景的是9-二甲氨基甘氨酞胺-6-去甲基-6-去氧基四環(huán)素(DMG-DMDOF)和9-叔丁氨基甘氨酞胺二甲胺四環(huán)素(TBG-MINO),已完成I期臨床試驗,目前正在進行Ⅱ期臨床試驗。四環(huán)素類除對骨質(zhì)疏松癥和風(fēng)濕病有療效外,近兩年又發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素和米諾環(huán)素對腦缺血引起的神經(jīng)損傷具有良好的保護作用。如米諾環(huán)素在腦缺血發(fā)生前3h給藥