瓊脂糖凝膠電泳

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瓊脂糖凝膠電泳

1.原理

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩〞和“電泳〞的雙重作用。

瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分開不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辯能力。但由于其孔徑相當(dāng)大，對大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中。

蛋白質(zhì)和核酸會根據(jù)pH不同帶有不同電荷，在電場中受力大小不同，因此跑的速度不同，根據(jù)這個原理可將其分開。電泳緩沖液的pH在6~9之間，離子強(qiáng)度0.02~0.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辯率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備簡單，分開范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分開DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分開高達(dá)10^7bp的DNA片段。

DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，一致數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。2操作流程

準(zhǔn)備清白的配膠板和電泳槽

瓊脂糖凝膠電泳：水平電泳

注意DNA酶污染的儀器可能會降解DNA，造成條帶信號弱、模糊甚至缺失的現(xiàn)象。(1)電泳方法

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一般的核酸檢測只需要瓊脂糖凝膠電泳就可以；假使需要分辯率高的電泳，特別是只有幾個bp的區(qū)別應(yīng)選中擇聚丙烯酰胺凝膠電泳；用普通電泳不適合的巨大DNA鏈應(yīng)當(dāng)使用脈沖凝膠電泳。注意巨大的DNA鏈用普通電泳可能跑不出膠孔導(dǎo)致缺帶。(2)凝膠濃度

對于瓊脂糖凝膠電泳，濃度尋常在0.5～2%之間，低濃度的用來進(jìn)行大片段核酸的電泳，高濃度的用來進(jìn)行小片段分析。低濃度膠易碎，防備操作和使用質(zhì)量好的瓊脂糖是解決方法。注意高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辯，造成條帶缺失現(xiàn)象。(3)緩沖液

常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。電泳時使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。注意電泳緩沖液屢屢使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。

三羥甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane，一般簡稱為Tris）是一種有機(jī)化合物，其分子式為(HOCH2)3CNH2。Tris被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)和分子生物學(xué)試驗中的緩沖液的制備。例如，在生物化學(xué)試驗中常用的TAE和TBE緩沖液（用于核酸的溶解）都需要用到Tris。(4)電壓和溫度

電泳時電壓不應(yīng)當(dāng)超過20V/cm，電泳溫度應(yīng)當(dāng)?shù)陀?0℃，對于巨大的DNA電泳，溫度應(yīng)當(dāng)?shù)陀?5℃。注意假使電泳時電壓和溫度過高，可能導(dǎo)致出現(xiàn)條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。特別是電壓太大可能導(dǎo)致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象

(5)DNA樣品的純度和狀態(tài)

注意樣品中含鹽量太高和含雜質(zhì)蛋白均可以產(chǎn)生條帶模糊和條帶缺失的現(xiàn)象。乙醇沉淀可以去除多余的鹽，用酚可以去除蛋白。注意變性的DNA樣品可能導(dǎo)致條帶模糊和缺失，也可能出現(xiàn)不規(guī)則的DNA條帶遷移。在上樣前不要對DNA樣品加熱，用20mMNaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性。(6)DNA的上樣

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正確的DNA上樣量是條帶明了的保證。注意太多的DNA上樣量可能導(dǎo)致DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導(dǎo)致帶信號弱甚至缺失。(7)Marker的選擇

DNA電泳一定要使用DNAMarker或已知大小的正對照DNA來估計DNA片段大小。Marker應(yīng)選中擇在目標(biāo)片段大小附近ladder較密的，這樣對目標(biāo)片段大小的估計才比較確鑿。需要注意的是Marker的電泳同樣也要符合DNA電泳的操作標(biāo)準(zhǔn)。假使選擇λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要預(yù)先65℃加熱5min，冰上冷卻后使用。從而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接頭導(dǎo)致的片段連接不規(guī)則或條帶信號弱等現(xiàn)象。

(8)凝膠的染色和觀測

試驗室常用的核酸染色劑是溴化乙錠（EB），染色效果好，操作便利，但是穩(wěn)定性差，具有毒性。注意觀測凝膠時應(yīng)根據(jù)染料不同使用適合的光源和激發(fā)波長，假使激發(fā)波長不對，條帶則不易觀測，出現(xiàn)條帶模糊的現(xiàn)象。3回收編輯

(1)DNA片段的膠回收方法

電泳洗脫法

低熔點瓊脂糖凝膠電泳挖塊法凍融回收法玻璃奶回收法柱回收法(2)膠回收本卷須知

a.將電泳槽用ddH2O反復(fù)清洗清白，倒入新鮮配制的滅菌電泳緩沖液；

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b.根據(jù)點樣量制備適合厚度的瓊脂糖凝膠板；c.切膠時盡可能切掉不含DNA片段的凝膠；

d.要盡量減少DNA在紫外下的照射時間以減少對DNA的損傷；e.熔膠要完全。

loadingbuffer

loadingbuffer的中文名字叫上樣緩沖液，6*的緩沖液中可以顯示兩條帶，前面的紫蘭色的條帶是溴酚藍(lán)，在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭的遷移率分別與1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的雙鏈線性DNA片段大致一致；后面的蘭色條帶是二甲苯青，它在1%和1.4%瓊脂糖中電泳時，其遷移速率分別與2Kb和1.6Kb的雙鏈線性DNA大致相像。而對于PAGE膠他們的遷移速率也分別不同。1.主要用途

loadingbuffer的功能主要有兩個：

第一，里邊的指示劑溴酚藍(lán)和二甲苯青FF起到指示的作用，顯示電泳的進(jìn)程，以便我們適時終止電泳；

其次，里邊的成分甘油可以加大樣品密度，使樣品密度大于TAE，從而沉降到點樣孔中，防止樣品飄出點樣孔。

另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都會寫明。SDS主要是促使聚合酶變性，由于沒有除盡的聚合酶會結(jié)合在DNA雙鏈上影響它的遷移速率。細(xì)胞裂解后的裂解液，加loading100℃加熱，也是為了中止酶促反應(yīng)，防止提取的蛋白質(zhì)降解。2.制備方法

loadingbuffer一般配置：(1)6×Loadingbuffer:30mMEDTA36%(v/v)Glycerol

0.05%(w/v)XyleneCyanolFF0.05%(w/v)BromophenolBlue主要用于DNA電泳

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(2)10×Loadingbuffer:30mMEDTA50%(v/v)Glycerol

0.25%(w/v)XyleneCyanolFF0.25%(w/v)BromophenolBlue主要用于RNA電泳

注：（1）10×loadingbuffer中僅有色素溴酚藍(lán)（BromophenolBlue)一種染料（濃度0.05%）；

（2）6×loadingbuffer中含色素溴酚藍(lán)（BromophenolBlue)、二甲苯青藍(lán)FF（XyleneCyanolFF)兩種染料（濃度都是0.05%）

在瓊脂糖凝膠（0.5%~1.4%）中溴酚藍(lán)（BromophenolBlue）約與300bp的雙鏈線狀DNA的遷移速度一致，二甲苯腈藍(lán)FF則與4kbp的雙鏈線狀DNA的遷移速度相等。

6×loadingbuffer是用來上樣的；10×loadingbuffer是stopbuffer，是中止酶促反應(yīng)的，假使一定要用10×loadingbuffer的上樣當(dāng)然也可以，唯一要注意的是：10×loadingbuffer中多了一樣SDS，它會使酶類如taq酶變性，以PCR產(chǎn)物為例，在電泳泳道上會產(chǎn)生一片彌散，假使電泳跑的距離短，和