蛋白質(zhì)間相互作用研究分析技術(shù)的研究進(jìn)展

蛋白質(zhì)間相互作用研究分析技術(shù)的研究進(jìn)展

蛋白質(zhì)組是后基因組時代出現(xiàn)的一個新領(lǐng)域。這是對身體、組織或細(xì)胞所有蛋白質(zhì)的形態(tài)和功能模式的研究。2003年4月人類基因組圖譜基本繪制完成,生命科學(xué)的重心開始轉(zhuǎn)移到對基因的表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)的研究。生物體內(nèi)大多數(shù)生命活動是通過各種蛋白質(zhì)的參與而完成的。在細(xì)胞內(nèi),蛋白質(zhì)間相互作用體現(xiàn)在酶與其蛋白底物的作用以及短暫或持久的蛋白裝配(此裝配在控制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分裂、DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄起始等方面發(fā)揮作用)上;在細(xì)胞外,蛋白質(zhì)間相互作用促使了細(xì)胞間相互交流,表達(dá)在細(xì)胞表面的配體可與表達(dá)在鄰近細(xì)胞的蛋白受體結(jié)合,而細(xì)胞分泌的蛋白配體則可以與遠(yuǎn)處細(xì)胞的受體結(jié)合。了解蛋白質(zhì)間相互作用的方式、程度及結(jié)果,將有助于蛋白質(zhì)功能的分析、生命發(fā)育的探索、疑難病理的研究及藥物的開發(fā)等。因此,揭示蛋白質(zhì)間相互作用關(guān)系,建立其相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖,已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的熱點。本文對用于蛋白質(zhì)間相互作用研究的各種新型分析技術(shù)作一綜述。1基于蛋白間相互作用的誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建酵母雙雜交系統(tǒng)(yeasttwo-hybridsystem)由Fields和Song(Nature,1989年)首創(chuàng),是建立在對真核轉(zhuǎn)錄激活因子認(rèn)識的基礎(chǔ)上。真核轉(zhuǎn)錄激活因子包括兩個功能結(jié)構(gòu)域:一個是與DNA上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)結(jié)合的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain,BD);另一個是DNA激活結(jié)構(gòu)域(DNAactivationdomain,AD)(見圖1)。當(dāng)某一報告基因位于UAS下游時,轉(zhuǎn)錄因子中的AD區(qū)可通過BD區(qū)與UAS結(jié)合而激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。這兩個結(jié)構(gòu)域在功能上是可以分離的,當(dāng)將它們彼此分開時,BD仍可結(jié)合DNA,但因缺少AD而不能激活轉(zhuǎn)錄;而AD雖可激活轉(zhuǎn)錄,但卻無法正確地定位到特異的DNA序列上。只有當(dāng)通過某種相互作用將它們聯(lián)系在一起時,它們才具有轉(zhuǎn)錄因子的功能,激活下游報告基因的轉(zhuǎn)錄。在目前通用的酵母雙雜交系統(tǒng)中,根據(jù)BD來源不同可分為GAL4系統(tǒng)和LexA系統(tǒng),其中GAL4系統(tǒng)用于真核細(xì)胞中,而LexA系統(tǒng)用于原核細(xì)胞中,其轉(zhuǎn)錄啟動因子是LexA。利用此原理,可構(gòu)建兩個重組質(zhì)粒,將目的蛋白的基因轉(zhuǎn)入帶有BD結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒載體中,并把其轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中表達(dá)一個融合蛋白——誘餌蛋白(bait);把要篩選的cDNA文庫中所有基因片段克隆至帶有AD結(jié)構(gòu)域的另一質(zhì)粒載體中,表達(dá)另一個雜交蛋白——靶蛋白(prey)。然后共轉(zhuǎn)化酵母菌或是通過兩個單倍體酵母菌融合,在選擇性缺陷培養(yǎng)基上篩選,通過對報告基因表型的鑒定來確定兩個蛋白是否存在相互作用。雙雜交質(zhì)粒上分別帶有不同的抗性基因和營養(yǎng)標(biāo)記基因,從而有利于轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒的篩選和鑒定。轉(zhuǎn)化的酵母菌株應(yīng)該帶有一個或多個報告基因,常用的報告基因有HIS3、LACZ、ADE2和URA3等,轉(zhuǎn)化的菌株則具有相應(yīng)的缺陷型。依靠簡便的酵母遺傳分析以及對報告基因表型的檢測,就可以進(jìn)行蛋白質(zhì)間相互作用的研究。Sullivan等通過酵母雙雜交系統(tǒng)對果蠅飛行肌肉中涉及糖分解途徑的6種糖分解酶進(jìn)行蛋白相互作用分析,成功鑒定出兩組相互作用的蛋白,分別是GPDH和GAPDH與GPDH和PGLYM。Song等利用LexA和B42系統(tǒng),通過酵母雙雜交方法發(fā)現(xiàn),Prox1蛋白與膽汁合成基因CYP7A1的轉(zhuǎn)錄激活子HNF4可發(fā)生強(qiáng)烈特異性的相互作用,從而抑制CYP7A1基因的表達(dá)。Rebecca等通過酵母雙雜交系統(tǒng)將全長的輪狀病毒腸毒素NSP4及其7種突變體作為誘餌,胞膜窖結(jié)構(gòu)蛋白Caveolin-1作為靶標(biāo),測定出NSP4的112~140殘基可直接作用于Caveolin-1蛋白。隨著功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究的開展,需要分析各種物種、組織或細(xì)胞中所有蛋白之間的相互關(guān)系,以構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用圖譜。為適應(yīng)這種需要,大規(guī)模雙雜交篩選技術(shù)應(yīng)運而生。目前,大規(guī)模酵母雙雜交技術(shù)已成功應(yīng)用于牛痘病毒、肝炎病毒C、番茄病毒A、噬菌體T7等多種蛋白體系的研究,其中基因開放閱讀框(openreadingframe,ORF)表達(dá)克隆集合的獲得為蛋白質(zhì)相互作用圖譜的構(gòu)建提供了條件。ORF組學(xué)通過原核或真核系統(tǒng)中ORF的表達(dá),對所有功能蛋白進(jìn)行分析,并應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng),將誘餌蛋白和靶蛋白系統(tǒng)進(jìn)行兩兩配對表達(dá),為蛋白質(zhì)相互作用研究提供蛋白組學(xué)規(guī)模的數(shù)據(jù),從而用于構(gòu)建相互作用組圖譜。酵母雙雜交系統(tǒng)采用體內(nèi)實驗,不易受外界環(huán)境的影響,不需要蛋白質(zhì)的大量純化,就可以檢測到蛋白間微弱的相互作用。但該系統(tǒng)也存在一定的局限性:1)不能檢測3個以上蛋白的相互作用以及相互作用蛋白質(zhì)的動力學(xué);2)易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。某些蛋白由于本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能或在酵母內(nèi)表達(dá)時的轉(zhuǎn)錄激活作用,使prey-AD融合基因與bait-BD融合基因表達(dá)產(chǎn)物無需特異結(jié)合,就能啟動轉(zhuǎn)錄系統(tǒng);若某些蛋白的表面有對其他蛋白的低親和力區(qū),則易形成蛋白體復(fù)合物,也可引起報告基因的表達(dá),使酵母出現(xiàn)相應(yīng)表型,產(chǎn)生假陽性結(jié)果。假陰性現(xiàn)象是雙雜交分析過程中經(jīng)常碰到的問題,但采用兩個或多個報告基因的方法或可改善這種狀況。酵母雙雜交系統(tǒng)所分析的可能存在相互作用的蛋白必須定位于核內(nèi)才能激活報告基因,但很多蛋白的相互作用依賴于翻譯后加工,如二硫鍵的形成等要在胞漿內(nèi)完成,因此有些蛋白的分析就不能采用該方法。鑒于此,酵母雙雜交系統(tǒng)建立至今,始終處于不斷發(fā)展和完善的過程中。目前已在使用中的此類系統(tǒng)還包括酵母單雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)、反向雙雜交系統(tǒng)以及細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)等,它們被廣泛用于蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究,成為檢測蛋白質(zhì)間相互作用、發(fā)現(xiàn)新的作用蛋白、分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的有力工具。2其他突變體的應(yīng)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)理論由F?rster于1948年提出,是指兩個熒光發(fā)色基團(tuán)在足夠靠近時,若供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài),當(dāng)該電子回到基態(tài)時,可通過偶極子相互作用,實現(xiàn)能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移,即發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移(見圖2)。產(chǎn)生FRET現(xiàn)象的兩種熒光基團(tuán)必須滿足以下兩個基本條件:第一,供體的發(fā)射光譜必須與受體的吸收光譜(又稱激發(fā)光譜)有相當(dāng)程度的重疊;第二,供體熒光基團(tuán)與受體熒光基團(tuán)的距離必須足夠小,一般約為1~10nm。這與生物大分子的尺度很吻合。目前在蛋白質(zhì)相互作用研究中應(yīng)用最為廣泛的是綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)及其突變體。近年來研究人員開發(fā)了GFP的多種突變體,通過引入各種點突變,使其發(fā)光基團(tuán)的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜均發(fā)生變化,從而發(fā)出不同顏色的熒光,如黃色熒光蛋白(yellowfluorescentprotein,YFP)、青色熒光蛋白(cyanfluorescentprotein,CFP)等,這些突變體使將FRET方法用于研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用成為可能,其中增強(qiáng)型黃色熒光蛋白(enhanceyellowfluorescentprotein,EYFP)和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhancegreenfluorescentprotein,EGFP)的聯(lián)合應(yīng)用可產(chǎn)生比其他突變體更強(qiáng)的熒光。Dawen等將熒光蛋白分別標(biāo)記驅(qū)動蛋白Kinesin-1的重鏈(KHC)和輕鏈(KLC),并通過FRET技術(shù)觀察到Kinesin-1在活性及非活性狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的改變:在非活性狀態(tài)下Kinesin-1分子折疊并自動抑制KHC尾巴與微管的接合,且KHC接合區(qū)域被KLC亞單位分開。這是通過FRET技術(shù)揭示活細(xì)胞內(nèi)蛋白復(fù)合物的構(gòu)象改變的典型例子。Sundar等發(fā)現(xiàn)以一種YFP的突變體——共振能量結(jié)合色蛋白(ResonanceEnergy-AcceptingChromoprotein,REACH)作為受體分子,以EGFP作為供體分子,二者在發(fā)生FRET時可展示最佳的光譜重疊,從而避免了狹窄光譜的過濾,而多余的光譜空間使在同一個細(xì)胞中使用附加的熒光標(biāo)記成為可能。同時,REACH還可用作FLIM(熒光壽命成像顯微檢測)和FqRET(熒光猝滅共振能量轉(zhuǎn)移)生物檢測方法中的供體分子。另外,在研究過程中還發(fā)現(xiàn),以REACH標(biāo)記泛素,以GFP標(biāo)記底物,可通過FRET技術(shù)實現(xiàn)對二者動力學(xué)的監(jiān)測。FRET技術(shù)能夠定時、定量、定位、無損傷地檢測活細(xì)胞內(nèi)兩個蛋白質(zhì)間的相互作用,但細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的生命活動常常是通過兩個以上分子之間相互作用實現(xiàn)的,如何檢測這種多分子間的動態(tài)作用機(jī)制是當(dāng)今分子生物學(xué)研究面臨的一個難題。為滿足這種需求,研究人員提出了一種三色熒光的二步級聯(lián)FRET(2-stepFRET)技術(shù),作為一種新興技術(shù),它能檢測活細(xì)胞內(nèi)3個生物分子間的相互作用(見圖3)。另外,基于量子點的FRET技術(shù)(量子點既可以作為FRET供體,也可以作為其受體)在蛋白質(zhì)相互作用研究中也得到了廣泛應(yīng)用。3spri技術(shù)檢測細(xì)胞中h--的相互作用表面等離子體共振(surfaceplasmonresonance,SPR)技術(shù)是瑞典Pharmacia公司在20世紀(jì)90年代開發(fā)的生物傳感技術(shù),其基本原理是,當(dāng)一束平面單色偏振光以一定角度入射到鍍有薄層金膜的玻璃表面發(fā)生全反射時,如入射光的波向量與金膜內(nèi)表面電子的振蕩頻率匹配,光線則耦合入金膜引發(fā)電子共振,即表面等離子體共振,其中電子吸收入射光線能量后達(dá)到最小反射光強(qiáng)度時所對應(yīng)的入射光角度被稱為SPR角。使用SPR生物傳感器進(jìn)行生物分子相互作用分析(biomolecularinteractionanalysis,BIA)時,將探針或配體固定于傳感器芯片的金膜表面,當(dāng)含分析物的液體流過傳感片表面,分子間發(fā)生特異性結(jié)合時,可引起傳感片表面折射率的改變,從而通過檢測SPR角的信號改變,測定分子間的相互作用(見圖4)。Petri等運用SPR技術(shù)比較了噬菌體P2、P2Hydis和WΦ的野生型操縱子及其突變體與野生型抑制子及其突變體形成復(fù)合物的動力學(xué)特征,結(jié)果顯示,P2和WΦ的操縱子突變體的結(jié)合速率常數(shù)降低,分離速率常數(shù)增加,而P2Hydis因結(jié)合速率太快沒有測定,說明幾種同源關(guān)系非常近的噬菌體(結(jié)構(gòu)基因的同源性為96%)其操縱子和抑制子所形成復(fù)合物的動力學(xué)特征及其特性之間存在很大差異。SPR技術(shù)除了可通過SPR角的變化實現(xiàn)對生物分子相互作用的實時監(jiān)測外,其成像(SPRi)技術(shù)亦已成為用于蛋白質(zhì)間相互作用研究的一種全新手段。SPRi技術(shù)是利用偏振光和棱鏡的色散作用激發(fā)傳感膜表面等離子體的共振而檢測共振信號,通過光源的轉(zhuǎn)換可檢測到SPR成像信號或波長掃描共振信號,對傳感膜進(jìn)行微點陣處理后可達(dá)到芯片研究的效果,并能實現(xiàn)成像與共振波長譜圖分析轉(zhuǎn)換,它與SPR角檢測方法相比所具有的優(yōu)勢在于可以更大規(guī)模地實現(xiàn)對單個膜表面生物分子相互作用的實時監(jiān)測(見圖5)。Emeline等用SPRi技術(shù)對細(xì)菌核蛋白H-NS復(fù)合物的形成進(jìn)行了檢測,通過質(zhì)譜(MS)鑒定高親和性的連接位點,并與BIA-MS技術(shù)進(jìn)行了比較,證明了SPRi-MS方法的可行性。Li等利用SPRi技術(shù)檢測到5種RNA適配體可與蛋白因子fIXa發(fā)生相互作用,并檢測到與fIXa親和性最高的一種適配體的Langmuir吸附系數(shù)為1.6×107mol-1,同時還發(fā)現(xiàn),若適配體基因序列中單個堿基發(fā)生突變,將徹底破壞二者之間的相互作用。SPR技術(shù)的特點是檢測快速、安全,不需標(biāo)記物或染料,靈敏度高。它能在保持蛋白質(zhì)天然狀態(tài)的情況下實時提供靶蛋白的細(xì)胞器分布、結(jié)合動力學(xué)及濃度變化等功能信息,主要可用于檢測蛋白質(zhì)間相互作用,還可檢測蛋白質(zhì)與核酸及其他生物大分子之間的相互作用,并能對整個作用過程進(jìn)行實時監(jiān)測,但無法完成對靶分子的鑒定。將SPR-BIA技術(shù)與傳統(tǒng)的蛋白鑒定技術(shù)MALDI-TOF-MS(基質(zhì)輔助的激光解吸離子化時間飛行質(zhì)譜)結(jié)合,形成了一種新的BIA-MS研究手段,其綜合了SPR-BIA和MALDI-TOF-MS兩種技術(shù)的優(yōu)勢,實現(xiàn)了定量與定性的結(jié)合,在研究蛋白質(zhì)復(fù)合物組分間相互作用的動力學(xué)參數(shù)、利用結(jié)合位點結(jié)構(gòu)的研究篩選功能性的突變、通過依次結(jié)合事件的分析揭示重要的生理分子級聯(lián)反應(yīng)機(jī)制、研究任何蛋白質(zhì)間的相互作用等方面具有廣泛的用途,是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的有力工具。4生物素化的鈣調(diào)蛋白與激酶原激酶相互作用的研究蛋白質(zhì)微芯片(proteinchip)技術(shù)是近年來在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項高新技術(shù),其基本原理是,將各種蛋白質(zhì)有序地固定于滴定板、濾膜或載玻片等各種載體上作為檢測用的芯片,然后,用標(biāo)記了特定熒光抗菌素的蛋白質(zhì)或其他成分與芯片作用,將未能與芯片上蛋白質(zhì)互補(bǔ)結(jié)合的成分洗去,再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術(shù),測定芯片上各點的熒光強(qiáng)度,通過熒光強(qiáng)度分析蛋白質(zhì)間的相互作用,最終達(dá)到測定各種蛋白質(zhì)功能的目的。Zhu等將生物素化的鈣調(diào)蛋白固定于載玻片上,采用蛋白質(zhì)微芯片技術(shù)測定其與酵母蛋白質(zhì)組中球蛋白的相互作用,結(jié)果,測得39種已知的鈣調(diào)蛋白與激酶可產(chǎn)生相互作用,并發(fā)現(xiàn)33種新的蛋白質(zhì)與鈣調(diào)蛋白存有潛在的相互作用。目前,以日本科學(xué)家田中教授發(fā)明的“對生物大分子的MS分析法”為應(yīng)用原理、由美國Ciphergen公司研發(fā)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)微芯片-飛行質(zhì)譜儀,已經(jīng)在國內(nèi)外的多個蛋白質(zhì)組學(xué)研究機(jī)構(gòu)得到廣泛應(yīng)用,其最大優(yōu)點是檢測快速、簡便易行、樣本用量少、可進(jìn)行高通量分析,具有高度并行性、多樣性、微型化和自動化的特點;不需進(jìn)行蛋白質(zhì)分離,只是利用抗體或其他類型親和探針構(gòu)成的芯片,即可直接在不經(jīng)處理的各種體液和分泌物中進(jìn)行檢測等,并可同時檢測幾千種蛋白質(zhì),效率非常高,且可檢測到樣品中特異性蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。因此,此項技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中較現(xiàn)有常規(guī)方法更具優(yōu)勢。蛋白質(zhì)微芯片技術(shù)不同于基于簡單的核酸雜交的DNA芯片——DNA分子的組成只需4種核苷酸,其芯片中蛋白質(zhì)具有復(fù)雜的連接方式,且由很多構(gòu)件模塊組成,需要高品質(zhì)和包含廣泛的表達(dá)文庫、較好的排列產(chǎn)物的方法和大量活化的功能蛋白,這就使得蛋白質(zhì)微芯片在固定蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性方面比DNA芯片面臨更大的挑戰(zhàn)。5生物組織學(xué)研究生物信息學(xué)(bioinformatics)是在生命科學(xué)、計算機(jī)科學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)和數(shù)學(xué)的基礎(chǔ)上逐步發(fā)展而形成的一門新興交叉學(xué)科,是以理解各種數(shù)據(jù)的生物學(xué)意義為目的、運用數(shù)學(xué)與計算機(jī)科學(xué)手段進(jìn)行生物信息的收集、加工、存儲、傳播、分析與解析的科學(xué)。生物信息學(xué)在基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中起著特殊的重要作用,因為基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究所提供的數(shù)據(jù)數(shù)量之巨大在生物學(xué)史上是史無前例的,且蛋白質(zhì)組學(xué)比基因組學(xué)更具復(fù)雜性,因而蛋白質(zhì)組信息學(xué)的發(fā)展與應(yīng)用面臨著更多挑戰(zhàn)。在后基因組時代,生物信息學(xué)的研究內(nèi)容已經(jīng)從對基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的高效分析轉(zhuǎn)移到比較基因組學(xué)、代謝網(wǎng)絡(luò)分析、基因表達(dá)譜網(wǎng)絡(luò)分析、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析以及藥物靶點篩選等方面,分別與功能基因組、蛋白質(zhì)組、結(jié)構(gòu)基因組等研究領(lǐng)域互相配合、緊密相關(guān),成為目前極其熱門的系統(tǒng)生物學(xué)研究的重要基石。生物信息學(xué)方法大都是基于從已知數(shù)據(jù)庫來分析比較未知蛋白的功能及其相互作用蛋白,已知數(shù)據(jù)庫中包括細(xì)菌和酵母的全部基因序列或已知的相互作用蛋白。以比較基因簇的同源性推測蛋白功能(conservedgeneneighborhood,GN)、相關(guān)基因具有相似的系統(tǒng)發(fā)生模式(co-occurrenceofgenes,CO)、相互作用蛋白的基因可能相互融合(genefusionevents,GF)等為依據(jù),采用合適的軟件,就可對大規(guī)模的蛋白質(zhì)間相互作用進(jìn)行分析,目前已有許多網(wǎng)站開發(fā)了這樣的功能(見表1)。Arnaud等利用PPI