石墨烯納米金復(fù)合材料的制備及抗壞血酸的還原制備

石墨烯納米金復(fù)合材料的制備及抗壞血酸的還原制備

1無(wú)酶葡萄糖傳感器葡萄糖的分析和檢測(cè)對(duì)人類疾病的診斷、治療和控制非常重要。因此，葡萄糖傳感器的研究一直是化學(xué)和生物傳感器研究的熱點(diǎn)之一。在諸多類型的葡萄糖傳感器中,有關(guān)葡萄糖電化學(xué)傳感器的研究較多。常見(jiàn)的葡萄糖電化學(xué)傳感器主要分為有酶和無(wú)酶兩種類型。有酶?jìng)鞲衅魇腔诿笇?duì)底物的特異性識(shí)別功能,具有專一性及高度選擇性。然而,由于酶的活性易受到周圍環(huán)境如溫度、濕度及化學(xué)環(huán)境等因素的影響,且固載的酶可能會(huì)泄漏,以致影響傳感器的穩(wěn)定性及使用壽命,在一定程度上限制了該類傳感器的應(yīng)用范圍。無(wú)酶葡萄糖傳感器是一種基于葡萄糖分子在相關(guān)催化活性材料表面的電催化氧化信號(hào)對(duì)其進(jìn)行定性及定量檢測(cè)的傳感裝置。近年來(lái),一些具有催化性能的納米材料已被廣泛用于制備新型的無(wú)酶葡萄糖傳感器,此類傳感器因制備簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好,可重復(fù)利用,價(jià)格低廉,能在無(wú)酶情況下直接檢測(cè)葡萄糖,目前已成為葡萄糖電化學(xué)傳感器研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。Kumiawan等研究了金納米顆粒修飾的金電極與未修飾的金電極分別在堿性溶液中對(duì)葡萄糖的響應(yīng)情況,結(jié)果表明:在相同條件下,金納米顆粒修飾的電極對(duì)葡萄糖的催化氧化電流高于未修飾的金電極。俞建國(guó)等采用電刻蝕法制得微鎳電極,利用堿性條件下葡萄糖在該修飾電極表面的電催化氧化性質(zhì),制備了新型抗干擾無(wú)酶葡萄糖微傳感器。目前,基于金屬納米材料與碳納米管等碳基材料復(fù)合物的無(wú)酶葡萄糖傳感器研究多有報(bào)道。石墨烯作為一種具有二維結(jié)構(gòu)的新型碳基材料,因其具有更大的比表面積及高電子傳導(dǎo)能力、原料易得且價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn),已成為繼碳納米管后新一代的理想電極修飾材料。將其代替碳納米管等材料應(yīng)用到無(wú)酶葡萄糖傳感器的制備尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)合金納米顆粒與石墨烯的優(yōu)點(diǎn),通過(guò)同步還原法制得石墨烯/納米金復(fù)合材料,再采用滴涂法并利用Nafion的穩(wěn)定作用將該復(fù)合材料修飾在玻碳電極表面,研制出一種高性能的無(wú)酶葡萄糖生物傳感器。該傳感器可用于對(duì)臨床樣品的檢驗(yàn),具有靈敏度高,選擇性和穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器、設(shè)備和儀器CHI660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司);電化學(xué)測(cè)量采用三電極系統(tǒng):玻碳電極(Φ=3mm)或修飾電極為工作電極,飽和甘汞電極(SCE)為參比電極,鉑絲電極為對(duì)電極;KQ-100E型超聲清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司);BSZ24S型分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);GL-16Ⅱ型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);5500型原子力顯微鏡(AFM,美國(guó)安捷倫科技有限公司)。葡萄糖(上海生物工程有限公司);Nafion(5%,Sigma-aldrich公司);納米級(jí)石墨粉(40nm),抗壞血酸(AA),尿酸(UA),氯金酸(阿拉丁試劑公司);實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水均為二次去離子水。2.2內(nèi)在石墨烯的制備氧化石墨烯(GO)的制備在Hummers法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)。即稱取1g納米級(jí)石墨粉和0.5gNaNO3于250mL燒杯中,在冰浴中混合并攪拌,緩慢加入23mLH2SO4,控制溶液溫度在20℃以下。在劇烈攪拌下加入3gKMnO4,在冰浴中控制溶液溫度低于20℃;隨后移去冰浴升溫到(35±3)℃,保持反應(yīng)30min(在20min后,液體變粘稠且有少量氣體揮發(fā));然后將46mLH2O緩慢加入到粘稠組分中,攪拌(有大量氣泡產(chǎn)生,溫度會(huì)升到98℃);保持溫度反應(yīng)15min,隨后用溫水稀釋至140mL,用3%H2O2還原過(guò)量的KMnO4,還原后溶液呈亮黃色。以8000r/min離心10min,移去上層清液,重復(fù)3次;以4000r/min離心5min,取上層亮黃色氧化石墨烯溶液;最后將氧化石墨烯還原,即得石墨烯產(chǎn)品,產(chǎn)率約為10%。2.3抗壞血酸溶液的制備采用同步還原法制備石墨烯/納米金復(fù)合材料。首先將80μL5mmol/LHAuCl4·3H2O溶液與20μL1.0g/LGO溶液混合;隨后加入800μLH2O稀釋,并使之混合均勻,在超聲振蕩條件下加入100μL0.1mol/L抗壞血酸溶液,維持該條件反應(yīng)20min,所得混合物于室溫下靜置48h。在復(fù)合材料的制備過(guò)程中,石墨烯表面含氧官能團(tuán)的數(shù)量對(duì)其與金納米顆粒間的連接起至關(guān)重要作用。未加入抗壞血酸前,GO表面大量的含氧官能團(tuán)為Au3+在其表面的有效吸附提供了保證;加入抗壞血酸后,GO表面的Au3+首先被還原成微小的金核,隨后逐漸形成金納米顆粒,而GO表面未吸附有Au3+的含氧官能團(tuán)則直接被抗壞血酸還原,最終得到穩(wěn)定的石墨烯/納米金復(fù)合材料。該復(fù)合材料的原子力顯微鏡圖像(圖1)表明,所得的石墨烯材料的厚度約為1nm,其上面負(fù)載納米金顆粒的粒徑約為5nm。2.4玻碳電極的制備將玻碳電極用Al2O3粉在拋光布上拋光,然后依次用蒸餾水,無(wú)水乙醇和二次蒸餾水超聲清洗1min。洗凈的電極再用二次蒸餾水沖洗,最后用N2吹干,備用。實(shí)驗(yàn)前將電極修飾材料(石墨烯、石墨烯/納米金復(fù)合物)預(yù)先超聲分散30min,移取5μL懸浮液滴涂于已拋光好的玻碳電極表面,置于紅外燈下干燥2h,然后在修飾過(guò)的電極表面滴5μL1%Nafion-乙醇溶液,置于室溫下晾干,即制得相應(yīng)材料修飾的玻碳電極。用伏安法測(cè)定前,修飾電極需置于K3Fe(CN)6溶液中循環(huán)掃描(電位掃描范圍-0.6~0.6V,掃描速率100mV/s),直到獲得重復(fù)性響應(yīng)且氧化還原峰電位差在80mV以內(nèi)。2.5電位掃描測(cè)試實(shí)驗(yàn)采用三電極體系,以NaOH溶液作為支持電解質(zhì),加入適量葡萄糖溶液,分別采用循環(huán)伏安法和線性掃描法進(jìn)行測(cè)試。電位掃描范圍為-0.6~0.6V(vs.SCE),掃描速率為100mV/s;電化學(xué)測(cè)量均在室溫條件下進(jìn)行。除特別說(shuō)明,所有測(cè)試底液均通高純氮?dú)?0min除氧,并在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持氮?dú)鈿夥铡?結(jié)果與討論3.1石墨烯/納米金修飾電極的電化學(xué)氧化將制得的石墨烯/納米金修飾電極、石墨烯修飾電極及裸玻碳電極分別置于含0.01mol/L葡萄糖的NaOH溶液進(jìn)行循環(huán)伏安掃描,實(shí)驗(yàn)前未通N2除氧,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,葡萄糖在裸玻碳電極及石墨烯修飾電極上均無(wú)明顯電化學(xué)響應(yīng),而在石墨烯/納米金修飾電極上則可觀察到明顯的氧化還原信號(hào)。表明納米金顆粒在無(wú)酶葡萄糖傳感器的構(gòu)建中具有產(chǎn)生電化學(xué)氧化還原信號(hào)的重要作用。相對(duì)于裸玻碳電極,葡萄糖在石墨烯修飾電極上具有更高的背景電流,表明石墨烯的高電子傳導(dǎo)能力可有效地增強(qiáng)修飾電極的信號(hào)強(qiáng)度,進(jìn)而提高傳感器的靈敏度。在石墨烯/納米金修飾電極上,當(dāng)掃描電位由-0.60V向0.60V變化時(shí),分別在-0.30,0.08和0.35V處觀察到3個(gè)氧化峰,其中-0.30V處的氧化峰歸因于葡萄糖的直接電化學(xué)氧化,0.08V的氧化峰對(duì)應(yīng)著葡萄糖氧化產(chǎn)物“葡萄糖酸內(nèi)酯”的進(jìn)一步氧化,表明石墨烯/納米金修飾電極對(duì)葡萄糖的電化學(xué)氧化具有良好的電催化活性,0.35V處的氧化峰對(duì)應(yīng)著在堿性條件下金氧化物的形成。在電位由0.60V向-0.60V反向掃描的過(guò)程中,在-0.04V處可觀察到一個(gè)明顯的氧化峰同時(shí)該峰在-0.3V附近還伴有一個(gè)肩峰。位于-0.04V處的氧化峰是由反向掃描過(guò)程中金氧化物被還原后,葡萄糖的二次氧化產(chǎn)生的?？紤]到實(shí)驗(yàn)之前未進(jìn)行通N2除氧步驟,位于-0.3V處的肩峰是由于溶液中溶解氧的還原產(chǎn)生的。介于-0.04V處的氧化峰具有良好的峰形和顯著的峰電流,在隨后的實(shí)驗(yàn)中將以該氧化峰的電流強(qiáng)度與葡萄糖的濃度做工作曲線對(duì)葡萄糖進(jìn)行定量分析。3.2檢測(cè)條件對(duì)傳感器響應(yīng)特性的影響3.2.1熱反應(yīng)與底液中葡萄糖的氧化葡萄糖氧化電流的強(qiáng)度不僅與其自身的濃度有關(guān),OH-濃度也是重要的影響因素。OH-的存在能夠使葡萄糖分子更容易吸附于電極表面的石墨烯/納米金上,并降低了葡萄糖氧化的活化能。本實(shí)驗(yàn)將10μL1mol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入10mL濃度為0.02,0.05,0.10,0.20和0.30mol/L的NaOH底液中,用循環(huán)伏安法考察了OH-濃度對(duì)葡萄糖氧化峰電流的影響(圖3)。由圖3可知,隨著NaOH濃度,即溶液中OH-濃度的增加,葡萄糖的氧化峰電流逐漸增大,當(dāng)OH-濃度高于0.20mol/L時(shí),峰電流隨底液濃度增加而降低。因此,本實(shí)驗(yàn)以0.20mol/LNaOH溶液作為葡萄糖電化學(xué)檢測(cè)的支持電解質(zhì)。3.2.2除氧劑的穩(wěn)定性測(cè)定實(shí)驗(yàn)中所配制的溶液在存放過(guò)程中均會(huì)溶解一定量的氧氣,溶液中的溶解氧對(duì)測(cè)定有一定的影響。因此,本實(shí)驗(yàn)采用通氮?dú)?0min除氧,然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)氣氛下進(jìn)行測(cè)定,以消除溶解氧的干擾。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,向樣品溶液中通氮?dú)?0min后,修飾電極在NaOH底液中的循環(huán)伏安曲線更加平整,在含葡萄糖的NaOH底液進(jìn)行循環(huán)伏安掃描時(shí),通氮?dú)馇拔挥?0.3V處的肩峰消失,此結(jié)果進(jìn)一步表明了原-0.3V處的肩峰與溶解氧的還原有關(guān)。3.2.3初始電位的確定線性掃描伏安法是一種常見(jiàn)的定量分析手段,通過(guò)線性掃描的峰電流與標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度之間的關(guān)系即可確定傳感器的工作曲線。在線性掃描的過(guò)程中初始電位的正確選擇與否會(huì)直接影響到傳感器的檢測(cè)性能。本實(shí)驗(yàn)在0.20mol/LNaOH溶液中加入適量葡萄糖,使其最終濃度為0.01mol/L,并通過(guò)線性掃描伏安法測(cè)定了不同初始電位對(duì)葡萄糖氧化峰電流的影響,實(shí)驗(yàn)中掃描初始電位分別為0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7和0.8V,掃描終止電位為-0.6V,掃描速率100mV/s,結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,隨著線性掃描初始電位的正移,響應(yīng)電流呈先增大再減小的變化趨勢(shì),在掃描初始電位為0.6V處傳感器的響應(yīng)電流達(dá)到最大值,即在該初始電位下該傳感器的靈敏度最高,因此,本實(shí)驗(yàn)以0.6V作為線性掃描初始電位。3.2.4石墨烯/納米金比例的確定在石墨烯/納米金復(fù)合材料的制備過(guò)程中,固定5mmol/LHAuCl4·3H2O溶液與1.0g/LGO溶液的總體積為100μL,改變兩者的體積比分別為1∶9,2∶8,3∶7,4∶6,5∶5,6∶4,7∶3,8∶2,9∶1,制得不同石墨烯/納米金比例的復(fù)合材料,在上述優(yōu)化條件下對(duì)0.01mol/L葡萄糖進(jìn)行線性掃描伏安法測(cè)定,葡萄糖氧化峰電流與V(HAuCl4·3H2O∶V(GO)的關(guān)系見(jiàn)圖6。由圖6可知,隨著混合物中HAuCl4·3H2O比例的增加,葡萄糖在修飾電極表面的氧化峰電流強(qiáng)度逐漸增加。當(dāng)兩者體積比達(dá)到8∶2時(shí),峰電流達(dá)到最大值,之后呈微弱的下降趨勢(shì)。即在原料比為8∶2時(shí)得到的復(fù)合材料修飾電極可使傳感器獲得最大電流響應(yīng),故最終選用該復(fù)合材料修飾電極構(gòu)建無(wú)酶葡萄糖生物傳感器。3.3方法重現(xiàn)性和檢出限在上述選定的最佳實(shí)驗(yàn)條件下,用線性掃描伏安法測(cè)定葡萄糖的氧化峰電流與濃度之間的關(guān)系。傳感器的線性范圍為0.1~20mmol/L;線性回歸方程為Y(μA)=2.4544+0.6659X(mmol/L),相關(guān)系數(shù)為0.9994;其檢出限為1.6×10-5mol/L(S/N=3),5次平行實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2%~5%之間,表明方法重現(xiàn)性良好。本傳感器具有較寬的線性范圍和較低的檢出限,其性能可與無(wú)酶葡萄糖傳感器相媲美。由于正常人體內(nèi)的葡萄糖含量在3.0~8.0mmol/L范圍內(nèi),本傳感器可滿足人血清樣品中葡萄糖含量測(cè)定的要求。3.4ua與aa的加入對(duì)葡萄糖氧化的影響在實(shí)際樣品測(cè)定時(shí),一些葡萄糖共存物可能對(duì)測(cè)定會(huì)產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)對(duì)可能產(chǎn)生干擾的物質(zhì),如尿酸(UA),抗壞血酸(AA)等,進(jìn)行了干擾測(cè)試。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,健康人血清中的UA與AA的含量分別是0.02和0.1mmol/L,在含5mmol/L葡萄糖的0.2mol/LNaOH溶液中分別加入0.2mmol/LUA和1.0mmol/LAA后,葡萄糖氧化峰電流分別增加了1.3%和2.6%,表明UA和AA的加入對(duì)葡萄糖的測(cè)定幾乎不產(chǎn)生影響。這主要是由于修飾電極表面的Nafion膜具有排斥中性分子和陰離子的能力,從而可以選擇性地透過(guò)某些電活性物。在堿性條件下,UA和AA均為陰離子,被Nafion陽(yáng)離子交換膜擋在傳感器外,有效阻止了UA和AA向電極表面擴(kuò)散,因而可有效消除這些電活性物質(zhì)的干擾。3.5傳感器穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下使用同一支修飾電極對(duì)葡萄糖濃度為1mmol/L的溶液重復(fù)測(cè)定10次,電流氧化峰電流平均值為3.47μA,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%。實(shí)驗(yàn)后將傳感器于4℃下懸于0.2mol/LNaOH溶液中保存,每天檢測(cè)一次,10d后電極的響應(yīng)信號(hào)為初