高效液相色譜法同時測定蓮子體內(nèi)四種異喹啉生物堿

高效液相色譜法同時測定蓮子體內(nèi)四種異喹啉生物堿

蓮心是中醫(yī)的一種臨床藥物。主要產(chǎn)于湖南、湖北、福建、江蘇、浙江等省。秋天收集荷花后，去皮并干燥。通常，最好是個大、綠、沒有煮的。其具有消心安神通交心腎、澀精止血之功效,被歷版《中國藥典》所收載。但各版《中國藥典》中蓮子心質(zhì)量標準制訂均不完善,即使是2000版藥典中,蓮子心質(zhì)量標準項下也只收載了生藥性狀、顯微鑒別和生物堿的試管顯色反應。蓮子心中主要共有的有效成分為蓮心堿(Lien),此外還含有異蓮心堿(lsolien)、甲基蓮心堿(Nef)和蓮心季銨堿(Lot)。關于蓮子心生物堿的定量方法,從已有的文獻中可以了解到,有庫侖滴定法、紫外分光光度法、薄層掃描法[6～9]等,其中高效液相法應用最普遍。但很多報道都是只對蓮子心中的1～2種生物堿進行含量測定[10～12];也有同時對Lien,Isolien,Nef3種成分進行定量分析的研究,采用的是離子對反相HPLC法。本實驗針對蓮子心的4種異喹啉生物堿,建立離子對反相HPLC法使各成分均獲分離,用以同時測定37個蓮子心樣品中的Lot,Lien,Isolien和Nef的含量。1材料、試劑和儀器1.1儀器Agilent1100HPLC儀,G1313自動進樣器,G1322A自動脫氣機,G1311A四元泵,G1316A柱溫箱,G1315DAD檢測器;WATER510泵,RHEODYNE7725i進樣器,Water486可調(diào)節(jié)紫外檢測儀,江申通用漢化色譜工作站forWindows,版本號:3.20自動進樣器,G1322A自動脫氣機,G1311A四元泵,G116A柱溫箱,G1315DAD檢測器;METTLERAE240電子天平,SYZ-A石英亞沸高純水蒸餾器,江蘇信達儀器廠;H66025超聲波清洗機,無錫超聲電子設備廠。1.2化學對照品蓮子心的4種異喹啉生物堿均對從藥材中提取分離得到,經(jīng)UV,IR,1HNMR,13CNMR及MS確證結構,蓮心堿(Lien)經(jīng)HPLC歸一法確定其為98%;異心蓮堿(Isolien)為92.06%;甲基蓮心堿(Nef)為96.61%;蓮心季銨堿(Lot)純度為98.76%,本實驗均作為定量對照品。1.3藥材購自湖南、湖北、福建、江蘇、浙江、江西、安徽等省,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室吳德康教授鑒定均來源于蓮科植物NelumbonuciferaGaerhn。種子的幼葉及胚根。1.4試劑甲醇,分析純,上?；瘜W試劑有限公司;乙腈,色譜純,TEDIA,MADEINUSA;冰醋酸,AR,南京化學試劑一廠;十二烷基磺酸納,CP,中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司;水為自制重蒸水。2方法的優(yōu)化設計2.3供試品溶液制備2.3.1提取方法的考察蓮子心生物堿的提取主要有以下幾種方式:冷浸、冷浸-超聲、加熱回流。用這三種方法分別用甲醇和氯仿兩種不同極性的溶劑進行提取,取蓮子心樣品粗粉0.5g,提取一次;(1)50ml甲醇冷浸24h;(2)50ml甲醇冷浸12h,再超聲提取45min;(3)50ml甲醇回流提取2h;(4)50ml氯仿冷浸24h;(5)50ml氯仿冷浸12h,再超聲提取45min;(6)50ml氯仿回流提取2h,均定容至50ml,注入HPLC儀,結果表明,上述六者提取液的HPLC圖譜十分相似,但通過峰面積值的比較,可以看出Lien,Isolien,Nef和Lot在甲醇熱回流的提取條件下,峰面積值最高,因此選擇此條件進行提取。2.3.2提取方法的優(yōu)選本實驗進行了均勻設計優(yōu)選蓮子心提取方法,采用U7(74)(表2),考察了四因素:提取時間、甲醇用量、浸泡時間、提取次數(shù)。精密稱取蓮子心藥材0.5g,按照實驗設計,浸泡,加熱回流提取,提取液濃縮并定容至50ml,共進行了7次實驗。以提取液中生物堿的含量為考核指標進行比較。結果見表1。將7次實驗的結果,經(jīng)計算機軟件多元回歸處理得回歸方程如下:Y=1362934-0.948689A+0.3107645B+0.2868424C-0.4381379D;F=0.514<F0.05(19.247),說明各因素諸水平之間并無顯著性差異。優(yōu)選出最佳提取方法為:A(45.61min),B(98.24ml/g),C(34.38min),D(1.76次)。結合實際情況,確定醇提參數(shù)為:浸泡時間為30min,甲醇與藥材比例為100ml/g,加熱回流2次,25min/次。2.3.3供試品溶液的制備精密稱取蓮子心樣品0.5g,浸泡30min,甲醇與藥材比例為100ml/g,回熱回流2次,25min/次,合并濾液,定容至50ml,取約2ml用0.45μm針筒式微孔濾膜過濾,得續(xù)濾液約1.5ml置進樣瓶中。2.4方法學考察2.4.1線性關系考察以混合標準品溶液依次進樣10,15,20,25,30μl,以含量(μg)為橫坐標(X)峰面積為縱坐標(Y)分別進行線性回歸。結果表明:Lot,Lien,Isolien,Nef在線性范圍內(nèi)呈良好線性關系。2.4.3精密度考察精密吸取上述供試品溶液20μl,連續(xù)進樣5次,測定供試品中各生物堿峰面積值。結果表明,該方法精密度良好。2.4.4重現(xiàn)性考察取同一樣品,按照2.3.3方法平行制備5份供試品溶液,依次進樣,進樣量20μl,測定供試品中各生物堿峰面積值。結果表明,該方法重現(xiàn)性良好。2.4.5回收率考察采用加樣回收法。精密稱取已知含量的樣品約0.25g,精密稱定,精密加入混合對照品溶液,按供試品溶液制備方法制得供試品溶液,依法測定,按下式計算,平均加收率(%)結果如下:Lot為99.02%;Lien為104.10%;Isolien為98.02%;Nef為106.69%,表明本法具有良好的加樣回收率。2.5樣品測定取不同產(chǎn)地的蓮子心粗粉,按上述條件與方法,依法測定。結果見表2。3蓮子體內(nèi)原則3.1由上述結果可以看出,不同產(chǎn)地蓮子心中各種生物堿的含量相差甚大,Lien0%～1.854%;Isolien0%～1.337%;Nef0%～1.185%;Lot0.115%～0.818%;總生物堿0.787%～2.289%?？梢娖渲蠰ot含量和生物堿總含量各樣本差異不大,37個樣本的RSD(%)分別為18.72和22.3。四種生物堿含量的高低似乎與產(chǎn)地關系不大,即便是同產(chǎn)地的蓮子心,其Lien,Isolien,Nef和Lot的含量也相差很大,那么其含量高低是否與栽培品種、采收季節(jié)、加工方法或貯藏條件有關,有待進一步研究。3.2一般認為蓮心堿為蓮子心中生物堿的主要有效成分,但Lien,Isolien,Nef均為雙芐基異喹啉類生物堿,有抗心率失常等心血管系統(tǒng)作用;Lot雖為單芐基異喹啉類生物堿,雖無明顯抗心律失常作用,但有強而持久的降壓作用。因此,單以Lien評價蓮子心藥材的質(zhì)量欠妥,應以含量較穩(wěn)定的4種生物堿的總量來進行定量分析。3.3蓮子心中Lien,Isolien,Nef和Lot對心血管疾病均有一定作用,中醫(yī)用于熱入心包、神昏譫語,臨床應用前景廣闊,我國蓮子心資源豐富,很有開發(fā)價值。2.1色譜條件色譜柱:HibarRT,5μm,250mm×4.6mm,Purosphere,STARRP-18e,Lot,FC025769,MerckKGaA,Germany;流動相:乙腈-水-冰醋酸(55∶45∶1,每1000ml中加入4g十二烷基磺酸鈉);流速:1.2ml/min;檢測波長:282nm;柱溫:30℃。2.2對照品溶液制備分別取Lot對照品4.7mg,Lien對照品5.7mg,Isolien對照品3.5mg,Nef對