溫度敏感rp通道與神經(jīng)病理痛機制研究進展

溫度敏感rp通道與神經(jīng)病理痛機制研究進展

及時受體阻滯（trp）通道是單個陽能遺傳因素的重要非選擇性通道。該家族的成員在結(jié)構(gòu)上與電壓依賴鉀離子通道類似,都有6次跨膜結(jié)構(gòu)域,N末端和C末端位于細胞膜內(nèi),第5和第6跨膜螺旋間形成孔道環(huán),功能性通道普遍認(rèn)為以四聚體結(jié)構(gòu)存在。新近的研究表明:TRPV1通道亞基通過C末端位于TRP-like區(qū)域后的21個氨基酸組成的四聚體決定區(qū)域的相互作用最終組成四聚體通道,這一原則有可能同樣適用于溫度敏感TRPV亞家族的其它三個成員TRPV2、TRPV3和TRPV4。根據(jù)氨基酸序列的同源性,已發(fā)現(xiàn)的28種哺乳動物TRP通道,包含在TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPP和TRPML等6個亞家族中(圖1A)。TRP通道可以作為感覺系統(tǒng)的前沿哨兵,響應(yīng)細胞及機體周圍環(huán)境中溫度、觸摸、疼痛、滲透壓、外激素、視覺、嗅覺、味覺、聽覺的變化。某些TRP通道還可被刺激性化合物,如:大蒜素、辣椒素、芥末、薄荷、樟腦、丙烯醛及環(huán)境中的汽車尾氣等所激活。因而這些“環(huán)境感覺離子通道”的研究處于當(dāng)今生命科學(xué)研究的前沿領(lǐng)域。TRP通道分布廣泛,調(diào)節(jié)機制不同,功能差異懸殊,參與溫覺、化學(xué)及機械感覺等眾多基本生命活動。根據(jù)TRP通道被激活的機制不同我們也可以將TRP通道分為:(1)受體激活,如TRPC亞型通道都可被該通路激活;(2)配體激活,如辣椒素激活TRPV1等;(3)溫度激活,如溫度敏感通道TRPV1、TRPV2、TRPV3和TRPV4、TRPM8和TRPA1;(4)機械激活,如TRPV4、TRPA1等。溫度激活的TRP通道也被稱為thermoTRPs,可參與機體溫度感覺及體溫調(diào)節(jié)等重要生命活動。新近的研究發(fā)現(xiàn)TRPM亞家族的另外3個成員TRPM2、TRPM4和TRPM5以及TRPC亞家族的TRPC5通道蛋白也對溫度非常敏感,這就使thermoTRPs家庭成員增至10位,分別來自四個亞家族即TRPV、TRPA、TRPM及TRPC。作為溫度感受器,這10個離子通道有著不同的溫度敏感性:TRPV1/2/3/4以及TRPM2/4/5是熱激活通道,對溫度升高敏感;而TRPM8和TRPC5可以被溫度降低所激活。熱敏和冷敏通道的溫度敏感域有部分重疊。TRPA1在不同的動物種可以以熱敏或冷敏通道存在。目前研究的比較清楚的thermoTRP通道示于圖1B。一、溫度敏感trp通道的分布和激活分子機制(一)trpm4熱刺激試驗TRPV1主要分布于脊髓背根神經(jīng)節(jié)(DRG)和三叉神經(jīng)節(jié)(TG)的小直徑神經(jīng)元。Caterina等(1997)發(fā)現(xiàn)TRPV1可被辣椒素或升溫激活,為辣椒會帶給人熱辣的生理感覺首次提供了分子解釋,同時TRPV1被熱(大于43℃)和酸性(pH<5.9)激活可引起疼痛感覺。TRPV1基因敲除小鼠表現(xiàn)出對熱和疼痛刺激的敏感性的變化。TRPV2主要分布于脊髓背根神經(jīng)節(jié)的中等和大直徑神經(jīng)元,對辣椒素不敏感,酸性也不能激活該通道。熱刺激閾值為52℃。新近Liu等(2010)的研究發(fā)現(xiàn)在肝纖維化及肝癌細胞中TRPV2表達增加。TRPV3分布包括感覺神經(jīng)元和皮膚角化細胞等,它的熱激活溫度范圍為31～39℃。TRPV4分布于外周感覺神經(jīng)元和皮膚角化細胞等,其熱刺激閾值約為25℃。TRPM2主要分布于小神經(jīng)膠質(zhì)細胞、大腦中的免疫細胞,另外在心臟、肝臟以及胰腺中也有表達。Togashi等(2006)報告了TRPM2可以在人體正常體溫及特定電壓條件下被激活,其熱刺激閾值在-60mV條件下約為35℃。TRPM4廣泛分布于機體組織,在人體器官中,胎盤、骨骼肌、心臟、腎臟、肝臟、胰腺、胸腺、脾、前列腺、小腸、結(jié)腸和肺中都發(fā)現(xiàn)TRPM4的表達。在大鼠的胃、腸、胎盤、食道、主動脈血管內(nèi)皮細胞、腎臟、心臟、胰腺和胎盤中也發(fā)現(xiàn)TRPM4的廣泛表達。TRPM5主要分布于舌上的味蕾細胞,在胃、腸中也有表達。Talavera等(2005)發(fā)現(xiàn)TRPM4和TRPM5也是溫度依賴型通道,在15～25℃溫度區(qū)間對TRPM4在電壓25mV條件下電流幅度分析所得出的Q10值約為9。同時TRPM5對溫度依賴也非常明顯,其電流在15～35℃范圍內(nèi)急劇增大。TRPM8分布于脊髓背根神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)小直徑神經(jīng)元,在8～28℃范圍內(nèi)具有溫度敏感性,在生理上產(chǎn)生涼的感覺。TRPM8通道還可被薄荷醇激活,這也可以解釋薄荷味口香糖和牙膏會讓人產(chǎn)生涼爽的感覺。TRPM8如果被反復(fù)刺激,可使通道電流去敏感化。此外,Zhang等(2006)發(fā)現(xiàn)TRPM8通道還分布于前列腺上皮細胞,在神經(jīng)受損及前列腺癌中TRPM8通道蛋白表達上調(diào)。TRPAl作為冷刺激感受通道其激活閾值低于17℃。Gracheva等(2010)以及Panzano等(2010)新近的報道發(fā)現(xiàn)在蛇的紅外感受器中TRPA1也可以感受紅外線介導(dǎo)的熱源信號。TRPAl主要分布于脊髓背根神經(jīng)節(jié),與TRPVl共同表達,在末梢神經(jīng)、腸肌叢神經(jīng)元以及皮膚角化細胞中TRPA1也有分布。Obata等(2005)通過研究發(fā)現(xiàn)在病理疼痛模式下TRPA1表達上調(diào)。TRPC5分布于小鼠和人的脊髓背根神經(jīng)節(jié)的感覺神經(jīng)元,大量的外周神經(jīng)包括上皮內(nèi)神經(jīng)末梢和脊髓背板。在外周神經(jīng)系統(tǒng)中充當(dāng)著對非傷害性降溫敏感的傳感器。(二)trpv1通道熱激活溫度敏感TRP通道的發(fā)現(xiàn)和深入研究讓我們認(rèn)識到它們在人類感覺系統(tǒng)中充當(dāng)分子溫度計的重要角色。該類通道的溫度敏感域包含了從約5℃到55℃整個生理學(xué)范圍,這個范圍覆蓋了早期電生理學(xué)能夠從感覺神經(jīng)纖維上探測到的冷或熱的溫度范圍。目前研究者正致力于探索thermoTRPs感受熱能變化并將其直接轉(zhuǎn)化為感覺神經(jīng)元電興奮信號的分子機理,尤其是溫度如何作用于thermoTRPs通道導(dǎo)致蛋白構(gòu)型變化從而促使通道開啟的謎團。例如現(xiàn)有的研究正嘗試?yán)没蚣夹g(shù)通過基因片段互換或點突變逐步縮小通道蛋白上可能的溫度激活區(qū)域。Grandl等(2008)通過對小鼠TRPV3基因突變體的篩查,認(rèn)為TRPV3通道蛋白的外孔區(qū)與溫度激活關(guān)系密切。Vriens等(2004)通過對TRPV4的研究證明位于通道蛋白第3跨膜螺旋的酪氨酸對于通道的熱激活必不可少。TRPV1作為thermoTRPs通道的代表,目前對其熱激活的機理研究也最深入。研究者在實驗基礎(chǔ)上并借鑒了其它的被廣泛研究的離子通道而提出了三種不同的門控機制模型。C末端作為熱覺感受器模型。這種模型主要基于Brauchi等(2006)對TRPV1和TRPM8的嵌合體重構(gòu)實驗。當(dāng)將對熱刺激敏感的TRPV1和對冷刺激敏感的TRPM8的C端互換,則其各自的溫度敏感特性也隨之互換。C末端溫度感受器機制似乎同配體誘發(fā)環(huán)核苷酸門控(CNG)離子通道激活機制相似。Flynn等(2001)的研究揭示了當(dāng)環(huán)核苷酸結(jié)合到胞內(nèi)C端配體識別區(qū)域則會引發(fā)一系列通道蛋白構(gòu)象的重新組合,從而激活CNG通道。對于C端溫度感受器機制假設(shè),Vlachova等(2003)、Garcia-Sanz等(2007)以及Valente等(2008)研究小組通過包括基因片段刪除、點突變和嵌合體重構(gòu)實驗證實了對通道蛋白C端的操作,可以改變通道的熱激活性質(zhì)。新近的實驗研究也發(fā)現(xiàn)當(dāng)PIP2與TRPV1的C端結(jié)合時會影響TRPV1通道激活。Voets等(2004)研究小組提出了熱、辣椒素和電壓三種刺激協(xié)同作用于同一門控機制從而激活TRPV1通道的假設(shè)。實驗顯示,隨著膜電位或溫度的改變,辣椒素的量效曲線會隨之移動,反之亦然。TRPV1孔區(qū)打開可能牽涉到S6跨膜螺旋的運動,協(xié)同門控機制中蛋白構(gòu)象的變化也許最終耦合S6跨膜螺旋的運動從而調(diào)控TRPV1通道激活。這種門控機制同電壓依賴激活鉀通道十分相似,S1～S4復(fù)合體作為電壓感受器,而TRPV1的辣椒素結(jié)合位點也位于該區(qū)域。第三種假設(shè)提出孔區(qū)參與熱刺激誘發(fā)的TRPV1通道激活。Grandl等(2008,2010)通過對TRPV1和TRPV3的隨機突變實驗證明:位于兩個孔區(qū)胞外環(huán)及第6跨膜螺旋的前半部分的單個或多個點突變可以明顯升高通道激活的閾值溫度;而Myers等(2008)的隨機篩分實驗也提示孔區(qū)的構(gòu)象變化影響TRPV1通道的開啟和關(guān)閉。新近Bohlen等(2010)的研究表明從狼蛛體內(nèi)提純出來的蜘蛛毒素結(jié)合到孔區(qū)位置會促進TRPV1通道激活。定位熒光記錄直接顯示了位于細胞外第5跨膜螺旋和孔螺旋之間的turret區(qū)在溫度激活TRPV1通道過程中產(chǎn)生了構(gòu)象變化,而在辣椒素或電壓激活通道過程中該區(qū)域無變化。綜合上述實驗,溫度誘發(fā)TRPV1通道激活通過獨特的外孔區(qū)通路,這就將熱激活通路從配體激活通路中分離開來。(三)突變體通道熱激活的門控效應(yīng)近年來的突變體實驗所獲得的大量結(jié)果進一步揭示了熱激活的分子基礎(chǔ)。Brauchi等(2004)和Latorre等(2007)通過對溫度敏感TRP通道的研究證實激活通路間的功能性耦合所造成的對通道門控的任何干擾都會體現(xiàn)在通道對溫度的反應(yīng)中。盡管如此,對孔區(qū)的大量突變實驗提示孔區(qū)對通道熱激活具有更特定的影響。當(dāng)Jordt等(2000)突變TRPV1通道蛋白位于胞外連接第5跨膜螺旋和孔區(qū)上的質(zhì)子化位點谷氨酸(E600)到賴氨酸,突變體通道在低于野生型通道的激活溫度,即15℃到20℃狀態(tài)下就可以被激活。突變體的電流-溫度關(guān)系曲線較野生型平緩許多,同時突變體的熱敏感性降低。Grandl等(2010)報告了對孔道turret區(qū)和孔螺旋結(jié)合處的點N628以及連接于選擇性濾器和S6間的短環(huán)區(qū)的點N652和Y653進行修飾的突變體在更高的溫度下被激活。有趣的是,在辣椒素敏感性缺失的情況下仍可觀察到突變體通道熱激活的門控效應(yīng)。另一方面,當(dāng)Myers等(2008)對大鼠TRPV1通道蛋白位于孔螺旋末端的苯丙氨酸的突變體,也即F640L進行研究時發(fā)現(xiàn),激活溫度趨于更低甚至在室溫下即可激活該突變體通道。升高溫度所引起電流幅度的近乎線形的增加可能反映單通道電導(dǎo)對溫度依賴上的增加。突變體通道F640L對酸化效應(yīng)不敏感,而辣椒素卻可以引發(fā)該突變體電流的增加。對熱激活影響強有力的證據(jù)來自于對孔道turret區(qū)域兩個半胱氨酸的突變體。經(jīng)過化學(xué)修飾這些分子可以模擬熱激活對突變體的影響。如同電壓門控鉀通道一樣,TRPV1的第6跨膜結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是通道蛋白的激活門控裝置,因而可能這些突變點影響了如何感覺溫度變化并傳遞到激活門控裝置上。ThermoTRPs感受溫度刺激的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)仍在探索中,這個問題的解決必將為溫度敏感TRP通道的溫度門控機制提供合理的結(jié)構(gòu)解釋。二、疼痛與離子通道疼痛是一種復(fù)雜的生理心理活動,也是臨床上最常見的癥狀之一。作為機體的一種感覺模式,它常指真實的或可感知的傷害性刺激作用于機體所引發(fā)的某種不愉快的感覺、情感或認(rèn)知。通常情況下,痛覺感受/感知只有當(dāng)物理或化學(xué)刺激足夠到可以潛在傷害組織條件下才會產(chǎn)生。作為一種神經(jīng)系統(tǒng)的生理病理反應(yīng),疼痛與多種離子通道的參與直接相關(guān)。近年來溫度敏感TRP通道已經(jīng)被證實除了對溫度變化非常敏感外,還與痛覺的產(chǎn)生和傳導(dǎo)有關(guān),其可作為極端條件下的痛覺感受器對特定痛覺的形成有重要貢獻,這是溫度敏感TRP通道非常重要的一種生理功能。(一)trpa通道并在一定的時間上產(chǎn)生痛覺作為痛覺傳感器,TRPV1在感覺神經(jīng)元中履行多種功能,TRPV1能夠感覺外界環(huán)境中多種有害的物理或化學(xué)刺激,如將高溫、酸度以及辣椒素類的激動劑激活通道以痛覺感覺進行傳遞;另外TRPV1也參與介導(dǎo)機體臟器病理條件下神經(jīng)功能紊亂式痛覺。Caterina等(2000)、Davis等(2000)研究組發(fā)現(xiàn)敲除TRPV1的小鼠對于熱刺激的痛覺過敏大大減弱;對于傷害性化學(xué)刺激及熱刺激反應(yīng)缺失,但對于傷害性機械刺激反應(yīng)正常;在炎癥及病理條件下TRPV1表達上調(diào)。有趣的是,TRPV1通常與TRPA1共同表達于神經(jīng)細胞中,這也讓人聯(lián)想到當(dāng)人處于極冷的環(huán)境中一段時間后會感到身體有發(fā)熱的錯覺。TRPV1通道對各種刺激的過度敏化或者由于炎癥而表達上調(diào)都會產(chǎn)生痛覺過敏。研究表明這也同樣適用于TRPV2。TRPV4被認(rèn)為是由滲透壓刺激引發(fā)痛覺的傳感器,Alessandri-Haber等(2003,2005)報告了在活體內(nèi)和體外實驗,研究發(fā)現(xiàn)低滲(濃度在15%～40%)或高滲(濃度在2%～5%)的鹽溶液均可以激活TRPV4通道蛋白,而且在炎癥條件下(如致痛覺過敏的炎癥中介分子前列腺素PGE2存在),滲透壓刺激會變得對細胞或機體組織更具傷害性。Alessandri-Haber等(2006)和Todaka等(2004)的研究也表明TRPV4在傷害性機械或溫度刺激及炎癥條件下也會產(chǎn)生痛覺過敏,敲除TRPV4的小鼠實驗表明炎癥條件下,其對傷害性機械刺激的痛覺過敏消失,對傷害性溫度刺激的躲避時間明顯延遲。TRPA1最初被Story等(2003)定位為傷害性冷刺激激活通道。但在隨后的研究中其冷激活性質(zhì)受到質(zhì)疑。Jordt等(2004)通過對表達TRPA1的HEK細胞進行冷刺激卻無法激活該通道,從而認(rèn)為TRPA1非冷激活通道,其解釋冷的溫度引發(fā)細胞膜內(nèi)鈣離子濃度增加,進而間接造成通道的激活。新近Karashima等(2009)通過活體內(nèi)及體外實驗證明TRPA1為冷覺感受器。在溫度低于10℃,細胞外液中沒有鈣離子情況下,可以記錄到表達于中國倉鼠卵巢細胞中的TRPA1的單通道電流。Bandell等(2004)、Kwan等(2009)也報告了TRPA1參與調(diào)節(jié)機械刺激、辛辣性化合物刺激所引發(fā)的傷害性痛覺。Hu等(2009)的研究發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)液中低濃度的Zn2+也可以激活感覺神經(jīng)元中的TRPA1通道從而引發(fā)小鼠的傷害性痛覺。Obata等(2005)的研究表明TRPA1通道在炎癥或神經(jīng)受損情況下可以通過激活MAPK路徑而產(chǎn)生冷覺的痛覺過敏。隨后Bautista等(2006)通過對于敲除TRPA1的小鼠的研究證實了TRPA1是感覺神經(jīng)元中由芥末油和大蒜素引發(fā)的唯一痛覺感受器。TRPM8在過冷溫度或薄荷等涼性物質(zhì)刺激下也會產(chǎn)生痛覺過敏,在神經(jīng)受損情況下TRPM8表達上調(diào)。敲除TRPM8基因的小鼠對冷刺激的敏感性大大降低。但在低于10℃條件下小鼠仍具有對冷的敏感性,這也證明了其它冷覺感受器如TRPA1的存在。(二)trpv1激活劑自1876年Thresh首次提純結(jié)晶出辣椒素到1987年Lembeck評述利用其進行鎮(zhèn)痛,辣椒素是在世界范圍內(nèi)被廣泛使用的緩解肌肉疼痛的各種非處方藥劑的標(biāo)準(zhǔn)成分。低濃度辣椒素霜劑(0.025%和0.075%)被用于外用藥膏,以舒緩如帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛、糖尿病神經(jīng)性病變引起的疼痛、乳房切除術(shù)后疼痛綜合癥、三叉神經(jīng)痛、肌纖維痛及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引發(fā)的疼痛。高濃度辣椒素霜劑(10%)用來減輕由神經(jīng)性病變引發(fā)的背痛。Fusco等(1994)還報告了應(yīng)用10mM的辣椒素滴鼻液可以緩解叢集性頭痛。1997年加州大學(xué)舊金山分校Julius研究小組對溫度敏感TRPV1通道蛋白的發(fā)現(xiàn),使人們對辣椒素有了全新的認(rèn)識,也使溫度敏感TRP通道作為新的藥物靶點而進入人們的視野。TRPV1可以由激活劑分子(如外源性化合物香草素類似物、人參皂苷、樟腦以及內(nèi)源性脂質(zhì)分子如類花生酸或大麻酚等)激活,信號分子也可以激活該通道(如緩激肽或神經(jīng)生長因子可以激活磷脂酶C即PLC通路最終增敏TRPV1離子通道)。任何抑制激活劑分子或切斷信號分子通道的方法都可以破壞通道的興奮從而減少因通道激活而產(chǎn)生的疼痛。TRPV1拮抗劑可以直接抑制通道開啟,因而作為潛在鎮(zhèn)痛藥物首選而被納入到研究評估中。目前已確認(rèn)幾十種TRPV1的拮抗劑具有抗痛覺過敏作用,但在評估拮抗劑消除由辣椒素所引起的體溫降低實驗中,Gavva等(2007)發(fā)現(xiàn)拮抗劑本身的使用會造成受體體溫的升高,因而如何消除體溫升高又能安全給藥成為研究者急需解決的課題。TRPV1激活劑藥物研發(fā)主要基于長時間或重復(fù)使用TRPV1的激活劑對通道所造成的脫敏作用可以緩解嚙齒動物及人的疼痛現(xiàn)狀,Menendez等(2006)通過對活體的藥效評估也證明了TRPV1激活劑RTX在大鼠骨癌鎮(zhèn)痛中具有明顯功效。但在實驗中,研究者同時也發(fā)現(xiàn)辣椒素可以使通道長時間脫敏,但難以忍受的是從辣椒素作用于受體到脫敏開始前的那段刺激過程所造成的灼痛感。對于TRPV1,有大量的激活劑可以選擇,如RTX,對通道脫敏效果更強且無初始階段的痛苦的刺激過程,因而更具實用藥物價值。TRPV1擁有很大數(shù)量的激活劑和拮抗劑(表1),其作為醫(yī)用治療藥物進行系統(tǒng)的臨床實驗才剛剛起步,