慢性乙型肝炎肝星狀細胞形態(tài)改變與肝微循環(huán)障礙的關(guān)系

慢性乙型肝炎肝星狀細胞形態(tài)改變與肝微循環(huán)障礙的關(guān)系

肝星細胞（hct）是肝臟中最重要的非生物細胞之一，約占肝中非生物細胞的1.3或15%，總體積約占肝體積的1.4%。HSC活化后,將發(fā)生一系列的表型改變,包括增殖、收縮、趨化、維生素A缺失、細胞因子的釋放等,在肝臟微循環(huán)障礙和肝纖維化過程中發(fā)揮重要作用。本研究采用光鏡觀察HSC中脂滴數(shù)和體密度的變化,同時采用電鏡觀察HSC的超微結(jié)構(gòu)改變,發(fā)現(xiàn)HSC的形態(tài)改變與肝竇基底膜形成及狄氏腔中膠原沉積等關(guān)系密切,現(xiàn)報告如下。1材料和方法1.1住院患者診斷慢性乙型肝炎患者81例,其中男54例,女27例,年齡18～62歲,平均34.8歲,病程1～20年不等,平均11.4年。以上所有病例均來自解放軍第一二三醫(yī)院南京軍區(qū)肝病中心2009年7月至2010年10月收治住院患者,診斷均符合2000年中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)分會、肝病學(xué)分會聯(lián)合修訂的“病毒性肝炎防治方案”的診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有標(biāo)本均在B超引導(dǎo)下行肝臟穿刺術(shù)獲得。另取5例疑診肝炎患者肝穿標(biāo)本作對照,結(jié)果他們的肝組織學(xué)正常。所有患者均因診斷和治療需要行肝臟穿刺術(shù),本研究取其部分肝組織作試驗用,事前征得患者及其家屬同意,并經(jīng)解放軍第一二三醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。1.2慢性麻黃性肝炎程度結(jié)合肝組織炎癥、壞死和纖維化程度,根據(jù)光鏡觀察結(jié)果,將81例慢性乙型肝炎患者分為慢性乙型肝炎輕度28例,慢性乙型肝炎中度22例,慢性乙型肝炎重度31例。分組標(biāo)準(zhǔn)參照李玉林主編的第6版《病理學(xué)》教科書中的標(biāo)準(zhǔn)。1.3肝星狀細胞計算方法參照文獻的方法進行。肝組織半薄切片經(jīng)次甲基藍-天青Ⅱ-堿性復(fù)紅染色后,在油鏡1000倍下(帶目鏡測試格,相當(dāng)于10000μm2)計數(shù)半薄切片中肝小葉非纖維化區(qū)竇周間隙及相鄰肝細胞之間含脂滴的完整肝星狀細胞20個視野,并計算每個肝星狀細胞所含脂滴數(shù)?？傆嫈?shù)面積200000μm2。在電子放大6000倍下電鏡觀察,拍攝每一病例肝小葉非纖維化區(qū)完整的肝星狀細胞40～50個。用正方測試格與照片重疊,采用點計數(shù)法,以胞體為參照系分別測定每個肝星狀細胞脂滴體密度。1.4透射電鏡觀察肝活檢標(biāo)本用4%戊二醛和1%鋨酸雙固定,酒精脫水,Epon812樹脂包埋,聚合后制備半薄切片,美蘭及堿性復(fù)紅染色,光鏡下定位后做超薄切片,醋酸鈾和檸檬酸鉛染色,透射電鏡觀察。1.5統(tǒng)計學(xué)處理計量資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,采用t檢驗。計數(shù)資料采用χ2檢驗,P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。2不同類型肝星狀細胞的脂滴計數(shù)和細胞體密度檢測2.1各組肝臟微循環(huán)單位超微結(jié)構(gòu)的改變肝竇是肝臟微循環(huán)單位的最重要組成部分。結(jié)果提示,肝竇內(nèi)皮細胞(sinusendothelialcell,SEC)窗孔變小減少最為常見,慢性乙型肝炎輕度即有96.4%的患者有此病變,慢性乙型肝炎重度患者中71%有基底膜形成,提示肝纖維化較為嚴(yán)重。WP(Weibel-Palade)小體主要出現(xiàn)在輕、中度患者肝竇內(nèi)皮細胞中,慢性乙型肝炎重度時較少出現(xiàn)。見表1。2.2各組肝星狀細胞數(shù)量及所含脂滴數(shù)比較隨著肝組織病變程度的加重,肝星狀細胞數(shù)量逐漸減少。脂滴計數(shù)結(jié)果顯示,慢性乙型肝炎輕度肝星狀細胞平均含脂滴數(shù)雖然較正常對照組減少,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),慢性乙型肝炎中度及重度與正常對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。2.3各組肝星狀細胞體密度的變化根據(jù)MAK的分類方法,將肝星狀細胞脂滴體密度在0.2以上者,稱為典型肝星狀細胞,脂滴體密度在0.2以下者,稱為過渡型肝星狀細胞。通過檢測各組肝星狀細胞脂滴體密度,發(fā)現(xiàn)正常肝組織中(90.1±6.2)%的肝星狀細胞為典型HSC,慢性乙型肝炎輕度、中度、重度肝組織中典型HSC分別為(71.5±12.3)%、(58.4±11.7)%和(35.8±9.4)%,組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。2.4各組慢性乙型肝炎肝星狀細胞超微結(jié)構(gòu)結(jié)點正常肝組織中肝星狀細胞處于靜止期,胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的脂滴,由于脂滴的擠壓,細胞胞核多位于細胞一側(cè),細胞膜常出現(xiàn)多處凹陷,異染色質(zhì)較豐富;胞質(zhì)內(nèi)細胞器亦較多,僅見少量短而狹窄的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),線粒體較小,高爾基復(fù)合體也不發(fā)達。胞質(zhì)外周有散在的微絲,并可見致密斑樣結(jié)構(gòu),質(zhì)膜下還常見散在或成束的微吞飲小泡。細胞外無基膜圍繞,局部可見少量膠原纖維(圖1)。慢性乙型肝炎肝組織輕度損傷時,肝星狀細胞即被激活,并逐步向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化,此時細胞體積變小,胞質(zhì)內(nèi)脂滴減少(圖2)。慢性乙型肝炎中度患者HSC主要表現(xiàn)為核被膜表面不規(guī)則,胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯增多,多擴張,內(nèi)有中等電子密度的絮狀物質(zhì),高爾基復(fù)合體發(fā)達,細胞周圍膠原原纖維量明顯增多(圖3),細胞突起較多,突起內(nèi)見質(zhì)膜下微絲及局部微呑飲小泡。慢性乙型肝炎重度患者細胞質(zhì)脂滴完全消失,提示肝星狀細胞已轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞(圖4)。3hsc在肝竇收縮中的病理生理作用正常情況下,肝竇血流的調(diào)節(jié)主要靠血管活性物質(zhì)一氧化氮(nitrogenmonoxidum,NO)和內(nèi)皮素(endothelin,ET)相互作用而實現(xiàn)的。正常SEC可表達內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelialcellnitricoxidesynthase,ecNOS),SEC通過ecNOS合成NO。研究表明,肝竇內(nèi)的血流和血流作用于SEC的摩擦力是調(diào)節(jié)SEC生物反應(yīng)的主要因素。肝竇血流量增加,SEC合成NO亦增加,NO通過提高血管內(nèi)cGMP水平介導(dǎo)血管的擴張,并防止血小板的聚集而調(diào)節(jié)微循環(huán)。肝竇直徑的生理調(diào)節(jié)由肝星狀細胞(HSC)控制。HSC位于狄氏腔內(nèi),與肝竇內(nèi)皮細胞和肝細胞緊密接觸。HSC的一個典型的特征是其長的分支狀的細胞突起,內(nèi)皮下突起緊貼內(nèi)皮細胞環(huán)繞肝竇,竇間突起可穿過肝細胞板伸入鄰近肝竇。研究發(fā)現(xiàn),無髓神經(jīng)纖維十分靠近HSC突起,且傳入肝臟的神經(jīng)刺激可引發(fā)生理反應(yīng),表明HSC有可能接受神經(jīng)刺激,支持了其在肝竇收縮中的生理作用。內(nèi)皮素是體內(nèi)作用最強的縮血管物質(zhì),主要由SEC和HSC分泌。ET-1可通過旁分泌的形式作用于鄰近細胞,也可通過自分泌的形式作用于自身。ET-1通過作用于HSC,使其收縮性增加,增高肝竇的血流阻力,這種病理生理改變是肝硬化門靜脈高壓癥發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)。另外,ET-1還作用于SEC窗孔周圍的肌動蛋白絲,使窗孔收縮,窗孔的數(shù)量減少,孔直徑變小,使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)進入肝竇周隙減少,從而導(dǎo)致肝臟微循環(huán)障礙。本研究發(fā)現(xiàn),慢性乙型肝炎患者肝組織中HSC體積變小,所含脂滴量減少,失去典型的HSC形態(tài),逐步轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞。HSC周邊的SEC中可發(fā)現(xiàn)WP小體,WP小體是WEIBEL于1964年在小鼠肺動脈分支的內(nèi)皮細胞中發(fā)現(xiàn)的,其主要成分是vonWillebrand因子(vWF)和P-選擇素。vWF由血管內(nèi)皮細胞和巨核細胞合成,是凝血因子Ⅷ的主要組成部分,其功能是促進血小板黏附于內(nèi)皮細胞下基質(zhì),具有連結(jié)并穩(wěn)定循環(huán)血中Ⅷ因子的功能;P-選擇素通常位于靜息內(nèi)皮細胞的WP小體膜上,內(nèi)皮細胞活化后,它由分泌顆粒的膜表面快速轉(zhuǎn)移至內(nèi)皮細胞表面,介導(dǎo)中性粒細胞滾動,減慢血液流速,使中性粒細胞與內(nèi)皮細胞密切接觸,導(dǎo)致細胞間黏附,使肝竇內(nèi)血流處于血栓前狀態(tài),易于形成微血栓,導(dǎo)致微循環(huán)障礙。SEC的去窗孔化阻止了肝細胞攝取維生素A,不僅可使體內(nèi)脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂,還使肝星狀細胞內(nèi)維生素A減少,促使肝星狀細胞向成纖維細胞轉(zhuǎn)化,并合成和分泌多種細胞外基質(zhì),導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。此過程被稱為HSC的活化。HSC活化后,將發(fā)生一系列的表型改變,同時合成大量的Ⅰ型膠原,使細胞外基質(zhì)由正常