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王老吉奶茶對(duì)訓(xùn)練小鼠腎臟細(xì)胞毒性細(xì)胞活性的影響

約束反應(yīng)是一種廣泛使用的模擬心理壓力的響應(yīng)模型。許多研究表明,該模型可以產(chǎn)生抗感染藥物。多年來人們非常關(guān)注天然產(chǎn)物對(duì)免疫調(diào)節(jié)作用的研究,但對(duì)傳統(tǒng)中藥體內(nèi)賦活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)殺傷活性的研究并不多見。王老吉涼茶由崗梅根(Ilexasprella)等10味草藥組成,具有清熱解暑、祛濕生津等功能,在嶺南地區(qū)作為泄火良藥使用已有近200年的歷史。研究證明,王老吉涼茶具有抗菌消炎、利尿、促進(jìn)小腸蠕動(dòng)及提高免疫力等功能。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也表明,王老吉涼茶可以增加拘束負(fù)荷小鼠脾臟NK細(xì)胞數(shù)目,提高NK細(xì)胞殺傷活性。本實(shí)驗(yàn)通過拘束負(fù)荷小鼠誘發(fā)身心壓力的角度,研究王老吉涼茶的瀉火作用與機(jī)體免疫狀態(tài)的關(guān)系,以揭示王老吉涼茶對(duì)人體健康調(diào)節(jié)作用的科學(xué)內(nèi)涵。1材料和方法1.1藥品、試劑與儀器王老吉涼茶浸膏由王老吉藥業(yè)股份有限公司提供,批號(hào):0605125;處方組成藥材(崗梅、山芝麻、五指柑、淡竹葉、木蝴蝶、布渣葉、火炭母、金沙藤、金錢草、金櫻根)均由廣州王老吉藥業(yè)股份有限公司送樣,廣州市藥品檢驗(yàn)所高級(jí)工程師張永耀、江英橋鑒定;PE標(biāo)記抗小鼠CD3單克隆抗體,FITC標(biāo)記抗小鼠CD4單克隆抗體,FITC標(biāo)記抗小鼠CD8單克隆抗體購自美國Biolegend;DiOC18(DiO,3,3′-dioctadecyloxacarbocyanineperchlorate),PI(propidiumiodide)購自美國Sigma公司;小鼠白細(xì)胞介素-3ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;IL-2標(biāo)準(zhǔn)品購自日本鹽野義制藥株式會(huì)社。1.4連續(xù)給藥和給藥劑量C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、致敏對(duì)照組、應(yīng)激對(duì)照組、125mg/kg及500mg/kg王老吉(WHT)給藥組,每組7只小鼠,共分5組。實(shí)驗(yàn)組每天灌胃給藥1次,連續(xù)給藥11d,正常對(duì)照組和應(yīng)激對(duì)照組給予等容量蒸餾水。除正常對(duì)照組外,其余各組給藥第二天腹腔接種P815瘤細(xì)胞1×107cells致敏小鼠。應(yīng)激對(duì)照組,125mg/kg及500mg/kgWHT給藥組在致敏后每天12h連續(xù)6d拘束應(yīng)激,小鼠致敏后的10d進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.5psbs重懸液制備小鼠拉頸處死后放入75%酒精中消毒,無菌條件下快速取出脾臟稱重,于培養(yǎng)皿冷PBS液中清洗,置于玻璃勻漿器中加3mLPBS研磨,200目銅網(wǎng)過濾,1000r/min4℃離心5min,棄上清液,加入紅細(xì)胞裂解液1mL,混勻,靜置2min后加PBS液3mL終止裂解反應(yīng),1000r/min4℃離心5min,棄上清液,用PBS液洗兩次后,加0.5mLPBS重懸調(diào)整脾淋巴細(xì)胞懸液于所需濃度。1.7pe雙色熒光抗體標(biāo)記調(diào)整脾淋巴細(xì)胞濃度為5×106cells/mL,取流式細(xì)胞分析專用管,每管加入細(xì)胞懸液100μL。每個(gè)樣本制備兩管,進(jìn)行FITC,PE雙色熒光抗體標(biāo)記,第一管加入2μLPE標(biāo)記抗CD3抗體和1μLFITC標(biāo)記抗CD4抗體;第二管加2μLPE標(biāo)記抗CD3抗體和1μLFITC標(biāo)記抗CD8抗體;室溫閉光孵育15min后各管加入500μLPBS,振蕩混勻,上流式儀分析記錄各管CD3+細(xì)胞%、CD3+CD4+細(xì)胞%、CD3+CD8+細(xì)胞%。1.8ctl殺傷活性檢測(cè)細(xì)胞系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)采用DiO標(biāo)記的靶細(xì)胞被殺傷破損時(shí),染料PI進(jìn)入細(xì)胞標(biāo)記細(xì)胞核,根據(jù)效靶細(xì)胞大小和DiO染色差異,可在流式分析結(jié)果FL1/FS圖中區(qū)分靶細(xì)胞群,進(jìn)而研究靶細(xì)胞死亡情況,計(jì)算CTL殺傷活性。具體實(shí)驗(yàn)為,10%FCS-RPMI1640培養(yǎng)液將脾淋巴細(xì)胞懸液調(diào)至1×106、5×105、2.5×105及1.25×105cells/100μL濃度后,以100μL/well分別添加到96孔圓底培養(yǎng)板中作為CTL殺傷效應(yīng)細(xì)胞。10%FCS-RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整P815細(xì)胞濃度至106cells/mL,添加DiO(10μL/mL),在37℃5%CO2條件下孵育15min后,用培養(yǎng)液洗滌兩次,過300目尼龍網(wǎng),用上述培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至104cells/100μL作為CTL靶細(xì)胞以100μL/well添加到效應(yīng)細(xì)胞中(效:靶細(xì)胞比分別為100∶1,50∶1,25∶1及6.25∶1)。P815靶細(xì)胞自然死亡率為104cells/100μL靶細(xì)胞內(nèi)添加100μL培養(yǎng)液作為對(duì)照組。37℃、5%CO2培養(yǎng)3h后,每孔加入500mg/LPI5μL,繼續(xù)孵育1h后取出,將培養(yǎng)板置于冰上終止殺傷反應(yīng),避光保存用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。將培養(yǎng)板中各孔細(xì)胞輕輕吹起并將待測(cè)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入流式分析管后添加500μLPBS,用流式細(xì)胞儀對(duì)每個(gè)樣本中的2000個(gè)靶細(xì)胞作CTL殺傷活性的檢測(cè)分析。CTL殺傷活性用CTL細(xì)胞對(duì)P815靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性來表示,并通過以下公式計(jì)算:本實(shí)驗(yàn)還計(jì)算了整個(gè)脾臟全部細(xì)胞所具有的CTL殺傷活性(LU10/Spleen):1.9統(tǒng)計(jì)與分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示,采用SPSS軟件,利用ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1應(yīng)激組與對(duì)照組胸徑指數(shù)和臟器指數(shù)的比較和正常對(duì)照組相比,致敏組小鼠的胸腺指數(shù)明顯下降(P<0.01),脾臟指數(shù)稍有增加但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;和致敏對(duì)照組相比,應(yīng)激對(duì)照組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)分別下降70.6%(P<0.01)和28.3%(P<0.01);與應(yīng)激對(duì)照組相比,王老吉涼茶125mg/kg及500mg/kg組均使小鼠胸腺指數(shù)(P<0.05)和脾臟指數(shù)(P<0.05)增高,見表1。2.2小鼠被迫應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正常組相比,致敏組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞總數(shù)無明顯變化;和致敏組相比,小鼠拘束應(yīng)激后脾臟淋巴細(xì)胞總數(shù)明顯下降(P<0.01);與應(yīng)激對(duì)照組相比,王老吉涼茶125mg/kg及500mg/kg組均使小鼠脾臟淋巴細(xì)胞總數(shù)顯著增加(P<0.01),見表2。2.3應(yīng)激對(duì)小鼠臟器thcd3+cd8+細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響如表2所示,與正常對(duì)照組相比,致敏組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞總數(shù)變化都不大,Tc(CD3+CD8+)淋巴細(xì)胞的比例由14.65%顯著地上升到21.08%(P<0.01),表明P815瘤細(xì)胞致敏后殺傷性T淋巴細(xì)胞數(shù)目明顯增多。應(yīng)激對(duì)照組和致敏組相比,Tc(CD3+CD8+)淋巴細(xì)胞的比例變化不顯著,但拘束應(yīng)激使小鼠脾臟Th(CD4+CD3+)淋巴細(xì)胞總數(shù)顯著減少。與應(yīng)激對(duì)照組相比,125mg/kg及500mg/kg口服王老吉涼茶明顯升高小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞中的Th比例(P<0.01)。此外,結(jié)合脾臟淋巴細(xì)胞總數(shù)來看,125mg/kg及500mg/kg口服給藥王老吉涼茶顯著增加應(yīng)激小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞(CD3+)總數(shù)(P<0.01)。2.4束縛應(yīng)激對(duì)小鼠肝臟ctl活性的影響如表3所示,以DiO/PI雙染色法檢測(cè)脾臟細(xì)胞CTL殺傷活性結(jié)果表明,與致敏對(duì)照組CTL活性相比,拘束應(yīng)激顯著降低小鼠脾臟CTL活性LU10/Spleen(P<0.01)。與應(yīng)激對(duì)照組相比,125mg/kg及500mg/kg口服給藥王老吉涼茶后的小鼠脾臟CTL活性LU10/Spleen分別上升33.0%(P<0.01)和52.3%(P<0.01)。2.5il-3分泌量如表3所示,與致敏對(duì)照組相比,拘束應(yīng)激顯著減少小鼠脾臟淋巴細(xì)胞因子IL-2(P<0.01)和IL-3分泌量(P<0.05)。與應(yīng)激對(duì)照組相比,125mg/kg及500mg/kg口服給藥王老吉涼茶顯著增加小鼠脾臟淋巴細(xì)胞因子IL-2(P<0.01)和IL-3(P<0.05)分泌量。3王老吉茯苓茶湯對(duì)小鼠肝臟ctl和th細(xì)胞的作用本實(shí)驗(yàn)表明,拘束應(yīng)激使小鼠胸腺及脾臟指數(shù)下降,同時(shí)顯著減少脾臟淋巴細(xì)胞總數(shù),而王老吉涼茶(125及500mg/kg)給藥均能不同程度地改善上述指標(biāo),與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,表明王老吉涼茶對(duì)拘束應(yīng)激引起的免疫損傷有調(diào)節(jié)作用。P815瘤細(xì)胞致敏C57BL/6小鼠第10天,小鼠脾臟淋巴細(xì)胞CTL活性達(dá)到峰值,而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)致敏后連續(xù)拘束6d,顯著降低小鼠脾臟淋巴細(xì)胞CTL活性,并顯著降低脾細(xì)胞中Th與Tc細(xì)胞比率。與拘束組相比,王老吉涼茶給藥后均可明顯增強(qiáng)拘束小鼠脾臟CTL對(duì)P815細(xì)胞的殺傷活性,并提高脾細(xì)胞中Th與Tc細(xì)胞比率。一般認(rèn)為腫瘤細(xì)胞或同種異體細(xì)胞致敏的CTL,與帶有相應(yīng)抗原細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)的殺傷作用是反映機(jī)體特異性細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)。又因CD8+T細(xì)胞在抗原刺激下可分化為特異性CTL,因此CD3+CD8+表型T細(xì)胞在功能上可代表CTL。與拘束組不同,王老吉涼茶給藥后不僅促進(jìn)CTL殺傷活性,也相應(yīng)提高脾臟細(xì)胞中CD8+CTL細(xì)胞比率,表明王老吉涼茶賦活體內(nèi)CTL殺傷活性是從增加CTL細(xì)胞數(shù)量和提高細(xì)胞殺傷活性兩方面完成的。我們的結(jié)果表明,拘束負(fù)荷主要通過減少Th細(xì)胞的比例來破壞機(jī)體淋巴細(xì)胞亞群的穩(wěn)定,而Th細(xì)胞是分泌IL-2等細(xì)胞因子的主要細(xì)胞亞群。我們的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),王老吉涼茶能提高拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠脾臟細(xì)胞因子IL-2和IL-3的分泌,結(jié)果表明王老吉涼茶在一定程度上提高Th細(xì)胞比率,同時(shí)有利于Th細(xì)胞提供細(xì)胞因子IL-2和IL-3等用以提高CTL細(xì)胞對(duì)抗原識(shí)別,選擇性作用靶細(xì)胞及增強(qiáng)連續(xù)殺傷活性。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物雄性C57BL/6小鼠,7周齡,購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(粵)2004-0011,飼養(yǎng)溫度(23±2)℃,飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。雌性DBA/2小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,許可證號(hào):SCXK(滬)2003-0003。P815淋巴瘤細(xì)胞由中山大學(xué)細(xì)胞中心提供,接種前在DBA/2小鼠體內(nèi)傳代培養(yǎng)。CTLL-2細(xì)胞購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫,實(shí)驗(yàn)前體外培養(yǎng)。1.3高速冷凍離心系統(tǒng)sartorCoulterXL流式細(xì)胞儀(Beckman,US-A),多功能熒光酶標(biāo)儀(奧地利TECAN公司),3-18K型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Sartorius,Gttingen,Germany),BS210S電子分析天平(Sartorius,Germany),WH-861型渦漩混合器(太倉市科教器材廠),及pHS-25型酸度計(jì)(上海偉業(yè)儀器廠)。1.6ctll-2細(xì)胞級(jí)配對(duì)C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、應(yīng)激對(duì)照組、125mg/kg及500mg/kgWHT給藥組,每組7只小鼠。按“1.5節(jié)方法”制備脾細(xì)胞懸液5×106cells/mL,置于24孔板內(nèi),加等量的ConA(10mg/L),37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,離心收集上清液,置

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