國家自然科學基金項目申請書范文【醫(yī)學領(lǐng)域】

國家自然科學基金項目申請書范文【醫(yī)學領(lǐng)域】國家自然科學基金項目申請書（一）立項依據(jù)與研究內(nèi)容（4000-8000字）：1．項目的立項依據(jù)細胞增殖和凋亡(apoptosis)調(diào)節(jié)失控與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，以促進腫瘤細胞凋亡為策略的腫瘤生物治療倍受國內(nèi)外學者的重視。1997年Ambrosini等發(fā)現(xiàn)survivin基因是一種獨特的凋亡抑制基因，表達于幾乎所有人類的腫瘤組織，但在分化的正常組織中沉默[1-3]。Survivin的表達可顯著抑制腫瘤細胞凋亡[4]。由于survivin在腫瘤細胞高表達及促進細胞增殖和抗凋亡的雙重作用，設計以survivin為靶點，使其沉默進行抗腫瘤治療，可促進腫瘤細胞凋亡，同時抑制腫瘤細胞浸潤并增強其對放化療的敏感性。最近，國外學者及本實驗室采用基因阻遏技術(shù)如反義技術(shù)等抑制survivin的表達，可直接促進白血病細胞及部分實體腫瘤細胞凋亡[5，6]。而腫瘤細胞的徹底清除最終有賴于機體的特異性免疫應答，由于大多數(shù)腫瘤抗原以及凋亡的腫瘤細胞免疫原性較弱，不能誘導機體產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應答。故抑制腫瘤細胞增殖與促進腫瘤細胞凋亡的治療策略均難以徹底清除機體內(nèi)的腫瘤細胞。因此，在抑制腫瘤細胞增殖與誘導腫瘤細胞凋亡的同時，如何增強其免疫原性，誘導機體對腫瘤的特異性免疫應答，達到徹底清除殘留腫瘤細胞或微小轉(zhuǎn)移病灶是值得探索的課題。熱休克蛋白（HSP）作為分子伴侶與正常的組織細胞肽形成的復合物不引起免疫應答，但可結(jié)合各種突變了的腫瘤抗原肽，且能夠?qū)⑵溆行У倪M行提呈，誘導CD8+CTL、CD4+T細胞以及NK細胞反應，殺傷腫瘤細胞[16，17，18]。最新研究證明，機體可通過非自我天然識別機制（innaterecognitionofnon-self）如補體、CD14等清除凋亡細胞[7]，或通過改變了的自我吞噬識別機制(phagocyterecognitionofaltered-self)如巨噬細胞表面受體CD36和氧化低密度脂蛋白受體吞噬清除凋亡細胞[8]，或通過非分離自我吞噬識別機制(phagocyterecognitionofnon-detachingself)如ICAM3的相互作用吞噬清除凋亡細胞[9]，由此可能誘導反應性T細胞無能而致免疫耐受[10-12]，如以凋亡的腫瘤細胞沖擊DC細胞則能激活腫瘤特異性CD8+T細胞，但凋亡的腫瘤細胞沖擊巨噬細胞無此功能[13]。因此，能否通過HSP有效地增強凋亡腫瘤細胞的免疫原性，主動地誘導特異性T細胞免疫應答，從而增強機體對殘存腫瘤或微小轉(zhuǎn)移病灶的殺傷效應，以及探討其機制具有重大的理論與實際意義。本研究在原有特異性靶向基因、Survivin反義RNA以及HSP-腫瘤抗原肽復合物抗腫瘤實驗研究的基礎(chǔ)上，擬構(gòu)建轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TFR）單鏈抗體-GAL4（TFR-ScFv-GAL4）靶向的pU-Survivin-siRNA/pCMV-HSP-GFP雙基因表達載體，通過鼠U6啟動子調(diào)控siRNA的轉(zhuǎn)錄，由siRNA（干擾性短小RNA）中的反義鏈指導形成沉默復合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC），由RISC介導切割SurvivinmRNA分子中與反義鏈互補的區(qū)域，從而干擾Survivin的轉(zhuǎn)錄和翻譯，促進腫瘤細胞凋亡；另一方面，凋亡的腫瘤細胞作為抗原提呈細胞(APC)或腫瘤抗原肽，通過CMV啟動子調(diào)控表達的HSP作為分子伴侶，與凋亡細胞內(nèi)一系列抗原肽形成復合物，或通過不同機制溶解的凋亡細胞腫瘤肽與HSP形成復合物，且大多數(shù)專職APC細胞表面表達HSP受體,如CD91，可與HSP肽復合物結(jié)合，從而通過內(nèi)源性的或/和外源性的抗原提呈途徑有效地誘導機體對腫瘤的特異性免疫應答；并以GFP作為標記分子，探討HSP作為分子伴侶的抗原提呈過程；擬通過T細胞克隆技術(shù)和荷瘤動物實驗探討其抗瘤效應及其機制。本課題設想：根據(jù)腫瘤細胞高表達survivin為理論基礎(chǔ)，將其作為促進腫瘤細胞凋亡的作用靶點。利用腫瘤細胞表面高表達CD71的特點，將其抗體作為靶向分子，擬通過轉(zhuǎn)染雙基因抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡的同時，以凋亡的腫瘤細胞為APC或抗原肽、HSP作為國家自然科學基金項目申請書分子朋友，引誘機體的特異性抗腫瘤免疫應答、最終達到完全清除腫瘤細胞的目的，并商量HSP的抗原提呈過程，其設計新奇，將為腫瘤的基因免疫治療開辟新的途徑，且可為尋覓腫瘤特異性抗原供給新的思路。國度自然科學基金項目申請書2．項目的研究內(nèi)容、研究目標,以及擬解決的關(guān)鍵問題。研討目標：1.建立TFR-ScFv-GAL4靶向的GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES-pU-siRNA表達載體，分別經(jīng)由過程鼠U6啟動子和CMV調(diào)控siRNA的轉(zhuǎn)錄和HSP-GFP的表達；2.以肝癌為靶細胞，經(jīng)由過程TFR-ScFv-GAL4靶向轉(zhuǎn)移的Survivin-siRNA引誘肝癌細胞凋亡；3.體內(nèi)外經(jīng)由過程TFR-ScFv-GAL4靶向轉(zhuǎn)移的GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES-pU-siRNA表達載體，促進肝癌細胞凋亡的同時，主動地誘導針對轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染基因的肝癌細胞的特異性免疫效應，為如何經(jīng)由過程引誘腫瘤細胞凋亡和特異性免疫應答兩重效應，發(fā)揮針對腫瘤細胞特異性的免疫效應，達到完全清除殘留腫瘤細胞或微小轉(zhuǎn)移病灶，為腫瘤的基因免疫生物治療開辟新的途徑，并為尋找腫瘤特異性抗原提供新的思路；4.以GFP作為標記分子，通過多光子共聚焦顯微鏡動態(tài)觀察HSP的抗原提呈過程，揭示HSP作為分子伴侶的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運過程及細胞外與APC結(jié)合的特征。研究內(nèi)容：1.構(gòu)建TFR-ScFv-GAL4靶向轉(zhuǎn)移的HSP-GFP/siRNA真核表達載體GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES-pU-siRNA。2.體外轉(zhuǎn)染GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES-pU-siRNA的肝癌細胞株凋亡的研討。3.體外轉(zhuǎn)染GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES-pU-siRNA的肝癌細胞株引誘針對肝癌細胞株的特異性T細胞的免疫效應及其機制。4.特異性T細胞克隆的引誘：體外轉(zhuǎn)染GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES-pU-siRNA的肝癌細胞株誘導特異性T細胞克隆，對轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染雙基因的肝癌細胞株的免疫效應。5.建立接納多光子共聚焦顯微術(shù)觀察HSP提呈內(nèi)源性抗原和外源性抗原過程的方法：包孕觀察凋亡細胞內(nèi)HSP-肽復合物抗原提呈過程及APC攝取的腫瘤抗原肽HSP復合物抗原提呈過程。6．誘導細胞凋亡與特異性免疫應答雙重效應的體內(nèi)實驗研究，建立動物模型，觀察置入轉(zhuǎn)染GAL4rec-pU-siRNA-IRES-pCMV-HSP-GFP的肝癌細胞的荷瘤動物生存時間、引誘免疫應答以及對再次置入的肝癌細胞株的特異性免疫應答效應。6.擬解決的樞紐問題：7.靶向轉(zhuǎn)移的真核表達載體系統(tǒng)的建立，通過轉(zhuǎn)染基因增強凋亡腫瘤細胞的免疫原性，并經(jīng)由過程體外細胞培養(yǎng)技術(shù)獲得特異性T細胞克隆，建立接納多光子共聚焦顯微術(shù)觀察HSP提呈內(nèi)源性抗原和外源性抗原過程的方法，以及成功建立動物模型等是本課題順利舉行的前提。8.2．揭示在誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡的同時，主動地誘導針對腫瘤細胞有效的特異性免疫應答，從而完全清除機體內(nèi)的瘤細胞，，為腫瘤的基因免疫生物治療開辟新的途徑，是本課題擬解決的樞紐問題和最終目的。國家自然科學基金項目申請書3．擬采取的研討方案及可行性分析擬采取的研究方案(1)真核表達載體系統(tǒng)的建立：含CMV和U6雙啟動子的siRNA與HSP-GFP真核表達載體系統(tǒng)GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES-pU-siRNA的構(gòu)建1)采用T7RNA連接酶合成與survivin特異性結(jié)合的siRNA，引入酶切位點；2)將已擴增的HSP70-GFP和合成的siRNA分別克隆到含CMV和U6雙啟動子的IRES的表達載體GAL4rec-pEGFP-N1，構(gòu)建含HSP70-GFP和siRNA的GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES-pU-siRNA真核表達載體，轉(zhuǎn)染大腸桿菌，篩選陽性克隆，經(jīng)菌落PCR及酶切鑒定。(2)靶向轉(zhuǎn)移的真核表達載體系統(tǒng)的建立與轉(zhuǎn)染：將已構(gòu)建的靶向轉(zhuǎn)移系統(tǒng)TFR-ScFv-GAL4與真核表達載體系統(tǒng)GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES-pU-siRNA在體外混合，制備成靶向轉(zhuǎn)移的真核表達載體系統(tǒng)TFR-ScFv-GAL4-GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES-pU-siRNA復合物，轉(zhuǎn)染肝癌細胞株，采用RT-PCR、ELISA、共聚焦顯微鏡等技術(shù)從基因及蛋白質(zhì)水平檢測其表達。(3)GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES-pU-siRNA轉(zhuǎn)染的肝癌細胞株凋亡的檢測：采用AnnexinV染色，F(xiàn)ACS、共聚焦顯微術(shù)等技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染目的基因的肝癌細胞和未轉(zhuǎn)染肝癌細胞的凋亡；(4)體外轉(zhuǎn)染GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES-pU-siRNA的肝癌細胞株誘導特異性T細胞免疫效應的檢測：1）接納3H標法、FACS檢測轉(zhuǎn)染基因的肝癌細胞引誘特異性T細胞的增殖回響反映；2）接納免疫學方法及生物學活性方法檢測特異性T細胞細胞因子的排泄程度，如IL-2、IFN-、TNF-、IL-12等；(5)特異性T細胞克隆的誘導與效應檢測：1）通過轉(zhuǎn)染目的基因的肝癌細胞體內(nèi)免疫動物，取其淋巴結(jié)細胞與相應的肝癌細胞共同培養(yǎng)，加入IL-2，誘導特異性針對肝癌細胞的特異性T細胞克隆，并通過細胞表面標志及其功能鑒定特異性T細胞克?。?）接納51Cr釋放試驗及流式細胞術(shù)檢測特異性T細胞克隆對轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染目的基因的肝癌細胞株細胞毒效應。（6）HSP抗原呈遞過程的觀察：1）轉(zhuǎn)染目的基因細胞與特異性T細胞克隆共培養(yǎng)，以HSP-GFP融合卵白中GFP作為標記分子，采用多光子共聚焦顯微鏡觀察凋亡細胞內(nèi)抗原肽-HSP復合物的轉(zhuǎn)運、細胞表面表達過程；2）轉(zhuǎn)染目的基因細胞與APC及特異性T細胞克隆共培養(yǎng)，以HSP-GFP融合蛋白中GFP作為標記分子，接納多光子共聚焦顯微鏡觀察APC對凋亡細胞或抗原肽-HSP-GFP復合物的攝取、轉(zhuǎn)運過程。（7）體內(nèi)研討：1)以小鼠作為動物模型，將轉(zhuǎn)染目的基因的小鼠肝癌細胞注射到鼠體內(nèi)，觀察其對轉(zhuǎn)基因細胞、未轉(zhuǎn)基因細胞的抗瘤效應，包括腫瘤大小、有無轉(zhuǎn)移以及動物存活時間；2)取實驗動物的脾細胞，與轉(zhuǎn)染目的基因和未轉(zhuǎn)染目的基因的肝癌細胞株混合培養(yǎng)，采用凋亡檢測試劑盒檢測肝癌細胞株的凋亡；采用3H標法、FACS檢測T細胞增殖。國家自然科學基金項目申請書可行性分析1、本課題組研究已證明：通過反義RNA技術(shù)抑制Survivin的表達可促進腫瘤細胞凋亡并增加其對化療藥物的敏感性，HSP70結(jié)合腫瘤抗原肽可增強機體特異性的免疫應答，為本課題研討奠定了堅實的實際根蒂根基；本課題設計擬構(gòu)建的表達載體中pCMP啟動子和pU6啟動子可分別調(diào)控HSP-GFP的表達及SiRNA的轉(zhuǎn)錄，可分別實現(xiàn)從蛋白質(zhì)水平和基因水平發(fā)揮效應。因此本課題通過轉(zhuǎn)染目的基因促進腫瘤細胞凋亡的同時誘導特異性免疫效應，并觀察HSP的抗原提呈過程，設計可行；2、本課題組采用多光子共聚焦顯微鏡已動態(tài)觀察細胞凋亡過程，本課題擬利用多光子共聚焦顯微鏡的高空