無(wú)酶標(biāo)記h-igg電流型免疫傳感器的研究

無(wú)酶標(biāo)記h-igg電流型免疫傳感器的研究

免疫傳感器是一種結(jié)合高靈敏傳感器和高靈敏傳感器的新生物傳感器。它被用來(lái)分析和研究痕跡免疫原因。在各種免疫傳感器的研究中，由于其高靈敏度和簡(jiǎn)單的設(shè)備，許多國(guó)內(nèi)外科學(xué)家對(duì)其感興趣。然而，由于它們的高靈敏度和簡(jiǎn)單設(shè)備，它們通常需要酶標(biāo)記抗感染或轉(zhuǎn)化信號(hào)，提高傳感器的檢測(cè)靈敏度。該傳感器有以下缺點(diǎn)：一些特殊的酶標(biāo)記很難獲得。需要一個(gè)電子媒體。檢測(cè)過(guò)程中的加工方法相對(duì)復(fù)雜。因此，基于新技術(shù)、低標(biāo)記或電子手段的革命性免疫傳感器，以及快速、靈敏的檢測(cè)方法，對(duì)醫(yī)學(xué)研究和臨床檢測(cè)具有重要意義。近年來(lái)，一些中國(guó)科學(xué)家在不到應(yīng)用標(biāo)記或不到電子手段的情況下對(duì)沒(méi)有酶標(biāo)記或電子手段的電流免疫傳感器進(jìn)行了一些研究。例如，西南大學(xué)袁若群在電沉積物、電聚合和層壓結(jié)構(gòu)上制作了一系列無(wú)酶免疫傳感器。該免疫傳感器是一種無(wú)酶免疫傳感器，需要專(zhuān)門(mén)的電子顯微鏡技術(shù)和電子顯微鏡。大學(xué)蔡培祥教授將實(shí)驗(yàn)與金融石縮技術(shù)相結(jié)合，檢測(cè)乙肝蛋白酸鈉。上述研究簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟，但存在電子媒體泄漏、抗性固定量低、無(wú)酶指數(shù)、靈敏度和穩(wěn)定性等問(wèn)題。此外，目前的利率免疫傳感器主要是通過(guò)檢測(cè)生物體和抗逆反應(yīng)前后電極上的循環(huán)伏安電流或即時(shí)電流來(lái)達(dá)到檢測(cè)目標(biāo)的新方法。然而，關(guān)于不規(guī)則脈沖伏安免疫傳感器的研究很少。對(duì)于不規(guī)則脈沖伏安免疫傳感器沒(méi)有報(bào)道，關(guān)于不規(guī)則脈沖伏安免疫傳感器的研究很少。本文采用自組裝技術(shù),以一種容易獲得、可在金電極表面自主裝的L-半胱氨酸化合物為基底結(jié)合Nano-Au,并固定羊抗人免疫球蛋白抗體(anti-h-IgG),利用差分脈沖伏安法檢測(cè)免疫反應(yīng)前后L-半胱氨酸對(duì)多巴胺催化電流的變化,制備了無(wú)酶標(biāo)記且無(wú)電子媒介體的h-IgG電流型免疫傳感器.其創(chuàng)新點(diǎn)如下:①該傳感器制備及反應(yīng)過(guò)程中沒(méi)引入電子媒介體,故無(wú)電子媒介體滲漏、富集等不良問(wèn)題,進(jìn)一步提高了電極穩(wěn)定性;②該電極在反應(yīng)過(guò)程中沒(méi)引入酶,而是利用L-半胱氨酸對(duì)多巴胺很強(qiáng)的直接電催化作用放大電信號(hào),因此抗體占據(jù)了電極上幾乎所有的活性位點(diǎn),增大抗原與抗體結(jié)合的機(jī)會(huì);③通過(guò)Nano-Au固定在電極上的抗體可以保持良好的生物活性,從而提高了電極的靈敏度;④每次免疫反應(yīng)發(fā)生后,電極轉(zhuǎn)入含多巴胺的PBS溶液中用差分脈沖伏安法測(cè)定電流變化,避免了樣品中干擾物的干擾.1實(shí)驗(yàn)部分1.1氨基酸l-半胱氨酸羊抗人IgG抗體(anti-h-IgG,上海生物制品研究所,效價(jià)1∶140),人血漿免疫球蛋白(h-IgG,成都生物制品研究所);L-半胱氨酸(上?？颠_(dá)氨基酸試劑廠);牛血清白蛋白(BSA)、多巴胺(Sigma公司);其余試劑均為分析純,購(gòu)自四川化學(xué)試劑廠.實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水.CHI660A型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司).三電極系統(tǒng):anti-h-IgG抗體修飾電極為工作電極,飽和甘汞電極為參比電極,鉑絲電極為對(duì)電極,以含0.35mmol/L多巴胺的0.25mol/LPBS溶液(pH=6.5)為測(cè)試底液.1.2納米金設(shè)備納米金(Nano-Au)的制備參照文獻(xiàn).1.3nano-au/4.2戊二醛/3.5%戊二醛電極的制備將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的金電極(?=4.0mm)插入20mmol/LL-半胱氨酸(pH=6.5)溶液中浸泡2h后,分別在Nano-Au(4℃,4h)或1%戊二醛(常溫1h)溶液中浸泡,然后將電極浸泡在anti-h-IgG溶液中(4℃,1.5h),最后以1%BSA封閉電極上非特異性結(jié)合位點(diǎn),取出,水洗后置于4℃冰箱中保存待用.1.4dpv的測(cè)定除非特殊說(shuō)明,每次檢測(cè)前,電極在0.25mol/LPBS(pH=6.5)含不同抗原濃度的溶液中孵育10min,然后轉(zhuǎn)入含0.35mmol/L多巴胺的PBS(pH=6.5)溶液中,利用DPV檢測(cè)其電流變化,然后以ΔI=I0-I計(jì)算,其中,I0代表修飾電極與抗原反應(yīng)前在測(cè)試底液中的電流,I代表修飾電極與待測(cè)抗原反應(yīng)后在測(cè)試底液中的電流.2結(jié)果與討論2.1修飾電極的穩(wěn)定性以不同修飾狀態(tài)的電極為工作電極,于含0.35mmol/L多巴胺的0.25mol/LPBS(pH=6.5)測(cè)試底液中,在-0.2～0.6V范圍內(nèi)進(jìn)行DPV測(cè)定,所得DPV曲線(xiàn)如圖1所示.圖1曲線(xiàn)a是L-半胱氨酸修飾裸金電極后的DPV曲線(xiàn),可見(jiàn)有一明顯的峰電流曲線(xiàn),這是因?yàn)長(zhǎng)-半胱氨酸對(duì)多巴胺有強(qiáng)的催化作用.當(dāng)該L-半胱氨酸電極吸附Nano-Au后,峰電流值增大(圖1曲線(xiàn)b),這是因?yàn)榧{米金具有導(dǎo)電性,能促進(jìn)電子的傳遞.Nano-Au組裝了無(wú)電活性的anti-h-IgG后,因?yàn)閍nti-h-IgG占據(jù)并堵塞了部分孔徑通道,使多巴胺向L-半胱氨酸及Nano-Au擴(kuò)散的有效表面積減小,阻礙了L-半胱氨酸對(duì)多巴胺的催化,也降低Nano-Au的導(dǎo)電性能,從而使峰電流值減小(圖1曲線(xiàn)c),這是當(dāng)用BSA封閉電極上非特異性結(jié)合位點(diǎn)后,峰電流值進(jìn)一步減小(圖1曲線(xiàn)d).該修飾好的免疫電極在20ng/mL的h-IgG溶液中培育10min后于測(cè)試底液中得到的DPV曲線(xiàn)(圖1曲線(xiàn)e),由于h-IgG與anti-h-IgG的專(zhuān)一性免疫反應(yīng),生成的復(fù)合物堵塞了更多的孔徑通道,使多巴胺向L-半胱氨酸擴(kuò)散的有效表面積再減小,再次阻礙了L-半胱氨酸對(duì)多巴胺的催化,從而使響應(yīng)電流進(jìn)一步下降,即Ie<Id.交流阻抗譜圖進(jìn)一步證明anti-h-IgG在金電極表面的固定.圖2是不同修飾狀態(tài)的電極在Fe(CN)64-/3-溶液中的交流阻抗譜圖.從圖可以看出,隨著電極表面的逐層修飾,阻抗隨之發(fā)生變化,并且半圓的直徑約為電子傳遞的阻抗(Ret).當(dāng)裸金電極被L-半胱氨酸修飾后,出現(xiàn)了高頻Ret阻抗(250兆)(圖2a),當(dāng)L-半胱氨酸修飾金電極吸附Nano-Au后(圖2b),其交流阻抗略小于L-半胱氨酸的阻抗,原因是納米尺寸的金溶膠有增強(qiáng)電子傳遞的能力.當(dāng)抗體(圖2c)和牛血清白蛋白(圖2d)分別固定在電極上后,堵塞了修飾電極表面更多孔徑通道,致使電極表面擴(kuò)散的有效截面積進(jìn)一步變小,進(jìn)一步增大了Fe(CN)63-到電極表面參加反應(yīng)的阻力,故膜本體阻抗依次增大,其阻抗均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Nano-Au/L-半胱氨酸/電極.2.2免疫電極的選擇性?xún)煞N不同抗體固定方法的免疫響應(yīng)見(jiàn)圖3.由圖可知由戊二醛做交聯(lián)劑固定抗體制備的免疫傳感器(圖3曲線(xiàn)b),電極的電流響應(yīng)比由Nano-Au固定抗體制備的免疫傳感器的電流響應(yīng)低(圖3曲線(xiàn)a),這是因?yàn)椴捎梦於┕矁r(jià)鍵合固定抗體可能使抗體分子的部分活性位點(diǎn)被鍵合失活,不利于免疫反應(yīng)的進(jìn)行,導(dǎo)致靈敏度低,而Nano-Au能促進(jìn)電子的傳遞,其大的比表面積增加了抗體的固定量,且固定后的抗體能保持良好的生物活性,從而提高了電極的靈敏度.圖4是免疫電極與20ng/mLh-IgG反應(yīng)后,在0.25mol/LPBS(pH=6.5)中不同多巴胺濃度對(duì)電流響應(yīng)的影響.由圖可見(jiàn),當(dāng)多巴胺濃度超過(guò)0.35mmol/L,傳感器的電流響應(yīng)不再增加,故0.35mmol/L多巴胺濃度為最佳濃度.圖5為該免疫傳感器對(duì)h-IgG的動(dòng)力學(xué)響應(yīng)曲線(xiàn).由圖可見(jiàn),至10min左右,響應(yīng)電流基本達(dá)到平穩(wěn),故實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選用的最佳培育時(shí)間是10min.該免疫電極與20ng/mLh-IgG反應(yīng)后,在0.25mol/LPBS(pH=6.5)中含0.35mmol/L多巴胺的不同pH溶液中測(cè)定其電流響應(yīng).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在pH=6.5時(shí)電流響應(yīng)達(dá)到最大值.故本實(shí)驗(yàn)選擇測(cè)試底液的pH為6.5.2.3傳感器的電流響應(yīng)值.在最優(yōu)條件下將該免疫傳感器與不同濃度待測(cè)溶液反應(yīng)后,測(cè)定其電流響應(yīng)值.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該傳感器在0.80～90ng/mL的范圍內(nèi)保持良好的線(xiàn)性關(guān)系(圖3a),y=0.0478x+0.4215,R2=0.9966.2.4h-igg重現(xiàn)性檢測(cè)抗壞血酸、硝基酚、腎上腺素等對(duì)該傳感器的測(cè)定均有較大影響,由于每次免疫反應(yīng)發(fā)生后,電極轉(zhuǎn)入無(wú)上述干擾物的含多巴胺的PBS中測(cè)定,由此避開(kāi)了h-IgG樣品中的干擾物.取濃度為40ng/mL的4份h-IgG進(jìn)行重現(xiàn)性檢測(cè),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差為6.1%.將此傳感器對(duì)5份不同濃度的h-IgG樣品進(jìn)行檢測(cè),樣品的回收率為98.6%～103.5%.用鹽酸-氨基酸對(duì)傳感器進(jìn)行9次再生后,該傳感器的電流響應(yīng)值仍可保持原電流響應(yīng)值91.0%.3nano-au免疫傳感器以L(fǎng)-半胱氨酸為基底結(jié)合納米金,然后固定抗體,利用L-半胱氨酸對(duì)多巴胺的直接電催化作用制備了無(wú)酶標(biāo)記且無(wú)電子