實驗講義分光光度法測量溶液中色素含量

分光光度法測量溶液中色素含量引言（實驗背景）在物質(zhì)檢測分析領(lǐng)域，對樣品測試時往往直接采用化學(xué)辦法，或先采用化學(xué)辦法預(yù)解決后再采用物理辦法進行測試分析，這樣都要采用化學(xué)試劑，對環(huán)境造成二次污染。而純物理辦法在整個測量過程沒有化學(xué)反映，更多依賴于物理手段和數(shù)學(xué)解決來解決問題，符合環(huán)境和諧型社會的發(fā)展需求，受到國家的重視和社會各界的歡迎。隨著測試辦法的轉(zhuǎn)變，人才需求也隨之發(fā)生轉(zhuǎn)變。以往運用化學(xué)分析辦法進行物質(zhì)檢測分析，需要大批量化學(xué)、生物有關(guān)專業(yè)人才。而隨著物理測試辦法的廣泛采用，光學(xué)、光電專業(yè)人才需求越來越大。為了順應(yīng)社會需求，適應(yīng)形勢變化，光學(xué)、光電專業(yè)學(xué)生不僅要掌握制造分光光度計的技術(shù)，還要創(chuàng)新使用辦法，通過實驗訓(xùn)練積累知識和經(jīng)驗，方便達成社會人才需求原則，為推動社會的技術(shù)進步和發(fā)展作奉獻。實驗?zāi)康呐c內(nèi)容食品中常添加色素使外觀好看而吸引消費者，特別是食品飲料中經(jīng)常使用人工色素配制成多個顏色。而毒理學(xué)證明化學(xué)合成色素有不同程度的毒性，有的甚至可致癌。各國相繼制訂了法規(guī)，對食品中合成色素的使用做了限量規(guī)定。本實驗?zāi)康木褪且捎霉鈱W(xué)辦法測出溶液中慣用的色素含量。溶液中常使用三種色素顯示黃色、橙色或紅色：檸檬黃、日落黃和胭脂紅，本實驗規(guī)定：實驗前一周進行預(yù)習(xí)查資料，設(shè)計出使用分光光度計同時測出溶液中檸檬黃、日落黃和胭脂紅的含量的實驗方案，實驗方案涉及：1）實驗所需條件，涉及儀器設(shè)備、材料試劑、工具器材等；2）配制哪些溶液？測量哪些數(shù)據(jù)？并設(shè)計好統(tǒng)計數(shù)據(jù)的表格以及重要實驗環(huán)節(jié)（注：分光光度計輸出的數(shù)據(jù)量較大，每個樣品的測量成果以文獻形式保存，請先擬好文獻名，填入表格，以免搞錯）；3）由實驗數(shù)據(jù)計算檸檬黃、日落黃和胭脂紅的含量的辦法，并闡明所需使用的軟件或擬編寫的程序。實驗設(shè)計方案最少提前一天（需要特殊材料的方案須提前一周）交給任課老師審視，通過審視后方可進行實驗。實驗時，按照所設(shè)計實驗方案，配制所需溶液，并使用分光光度計測出對應(yīng)的光譜數(shù)據(jù)；數(shù)據(jù)統(tǒng)計單須交老師審查簽字。實驗結(jié)束后按數(shù)據(jù)解決規(guī)定進行數(shù)據(jù)解決，一周內(nèi)上交實驗報告，實驗報告涉及實驗方案、實驗原始數(shù)據(jù)、數(shù)據(jù)解決結(jié)論及誤差分析、思考題。實驗原理分光光度法是根據(jù)物質(zhì)對不同波長的單色光的吸取程度不同而對物質(zhì)進行定性和定量分析的辦法，常采用吸取光譜曲線來進行分析。所謂吸取光譜曲線，即將不同波長的光依次通過某一固定濃度和厚度的有色溶液，分別測出它們對多個波長光的吸取程度（用吸光度A表達），以波長為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作圖所畫出曲線。由于溶液對不同波長的光的吸取程度是不同，不同溶液的吸取曲線，其形狀和最大吸取波長都各不相似，如圖1所示，能夠作為定性分析的基礎(chǔ)。圖1不同溶液的光譜吸取曲線1760年，朗伯通過研究后指出：如果溶液的濃度一定，則光對物質(zhì)的吸取程度與它通過的溶液厚度成正比(1)A為吸光度；I0為入射光強度；I為透射光強度；b為液層厚度；K0為比例常數(shù)。 1852年，比耳(Beer)提出光的吸取和光所碰到的吸取物質(zhì)數(shù)量有關(guān)；即當(dāng)單色光通過液層厚度一定的有色溶液時，溶液的吸光度與溶液濃度成正比。(2)A為吸光度；I0為入射光強度；I為透射光強度；C為溶液的濃度；K1為比例常數(shù)。 將朗伯(Lambert)定律和比耳(Beer)定律合并，則為朗伯-比耳(Lambert-Beer)定律(3)式中：A為吸光度；T為透射率；b為液層厚度(光程長度)，普通以cm為單位；C為溶液的濃度，普通為物質(zhì)的摩爾濃度，單位為mol·L-1；ε為摩爾吸光系數(shù)，單位L·mol-1·cm-1；（注意：吸光系數(shù)有三種表達方式：摩爾吸光系數(shù)，單位L·mol-1·cm-1，對應(yīng)濃度單位為mol/L；吸光系數(shù)，單位L·g–1·cm-1，對應(yīng)濃度單位為g/L；比吸光系數(shù)，單位100mL·g–1·cm-1，對應(yīng)濃度單位為g/100mL。）需要闡明的是，（3）式中的比例系數(shù)ε對不同波長的光，其值是不同的，因此吸光度A隨波長呈變化的曲線。同一溶液，不同濃度，其吸取曲線的形狀相似，最大吸取波長也同樣，根據(jù)朗伯-比耳定律，其吸光度與溶液濃度成正比，如圖2所示，可運用吸取曲線結(jié)合吸光度對溶液物質(zhì)含量進行定量分析。圖2同溶液不同濃度光譜吸取曲線 因此，對于單組分溶液，根據(jù)最大吸取峰處的吸光度，即可算出溶液中該物質(zhì)的濃度。具體辦法是：先配制已知濃度的溶液，測出吸光度，根據(jù)（3）式計算出吸光系數(shù)；而后再測待測樣品的吸光度，由（3）式計算樣品的濃度。 對于多組分溶液，如果各組分之間無互相作用，其吸光度含有加和性，根據(jù)朗伯-比耳定律有：(4)如各組分光譜有疊加，則通過解聯(lián)立方程組能夠擬定各組分的濃度。以三組分混合液為例，先用混合液繪制出吸取光譜，再分別用其中的每單一組分繪制出各自的吸取光譜，而后根據(jù)所測三條吸取譜線選擇三個適宜的波長，在這三個波優(yōu)點對混合物樣品進行測定，其方程式以下：(5)(6)(7)應(yīng)用行列式克萊姆法則，則可計算獲得C1、C2、C3。同一物質(zhì)，不同的測試波長有不同的摩爾吸取系數(shù)，即有不同的敏捷度，由于實際實驗有誤差，吸光度較小處相對誤差較大，而最大吸取波優(yōu)點的摩爾吸光系數(shù)最大，分析測試的敏捷度最高，且最大吸取波優(yōu)點吸光度絕對誤差變化最小，因此三個波長分別選在三種物質(zhì)的吸取峰處較適宜。當(dāng)用分光光度計進行測量時，普通會對波長進行掃描，即同時給出許多波長下的測量值，這時為了充足運用現(xiàn)有數(shù)據(jù)減小誤差，可采用最小二乘法對數(shù)據(jù)進行解決（參考附錄3）。普通狀況下，采用分光光度法對某種物質(zhì)進行測量時，物質(zhì)的吸光系數(shù)是未知的，為了獲取物質(zhì)的吸光系數(shù)，慣用下列辦法：絕對法：選擇待測物質(zhì)的吸取峰波長，通過書刊、手冊查閱待測物質(zhì)在吸取峰波優(yōu)點吸光系數(shù)，運用實驗所得的吸光度或透射率或反射率計算獲得待測物質(zhì)濃度。原則對照法：在同樣的條件下配制原則溶液及試樣溶液，在所選波優(yōu)點分別測量吸光度，獲得原則溶液及試樣溶液的A標(biāo)及A樣，通過獲得樣品濃度。原則曲線法：配制一系列已知含有不同濃度的原則溶液，分別在選定波優(yōu)點測其吸光度A，然后以原則溶液的濃度C為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制A-C關(guān)系圖，獲得原則曲線和原則關(guān)系方程。在相似條件下測量樣品溶液的吸光度，根據(jù)原則曲線和原則關(guān)系方程即可獲得樣品溶液濃度。原則加入法：在樣品溶液中加入已知含有不同濃度的原則溶液，分別在選定波優(yōu)點測量其吸光度，根據(jù)吸光度變化量和所加已知含有不同濃度的原則溶液濃度變化量的關(guān)系，進而獲得樣品待測物含量。分光光度計?是運用分光光度法對物質(zhì)進行定量定性分析的儀器，它重要由光源、單色器、吸取池、檢測器、信息顯示系統(tǒng)構(gòu)成。分光光度計構(gòu)造構(gòu)成框圖如圖3所示。光源光源單色器吸取池檢測器信號顯示及儀器控制圖3分光光度計構(gòu)造框圖光源重要提供符合規(guī)定的入射光，較慣用氘燈(165-375nm)和鎢燈(320-2500nm)。單色器是將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成持續(xù)光譜并可從中選出任一波長單色光的光學(xué)系統(tǒng)，重要由狹縫、色散元件（棱鏡、光柵）和透鏡系統(tǒng)構(gòu)成。吸取池又叫比色皿，是用于盛放待測溶液和決定透光液層厚度的器件，重要有石英吸取池和玻璃吸取池兩種。檢測器是運用光電效應(yīng)將透過吸取池的光信號變成可測的電信號的器件，慣用的有硒光電池、光電管、光電倍增管等。實驗儀器和試劑儀器：UV-4501S紫外可見分光光度計，TU1901紫外可見分光光度計（帶兩個1cm石英比色皿）；基本操作環(huán)節(jié)見附錄1。電子天平；容量瓶、移液管、燒杯等玻璃儀器。試劑：檸檬黃、日落黃、胭脂紅（試劑闡明見附錄2）；乙酸銨；光學(xué)純水；思考題分光光度計有哪些類型？分別有什么特點？測定過程中產(chǎn)生誤差的因素有哪些，并簡要進行分析？注意事項：在配制所需濃度溶液過程中，天平讀數(shù)要精確；玻璃儀器要輕拿輕放，配制完后，清洗干凈放回原處。所配制溶液濃度在最大吸取波優(yōu)點吸光度最佳范疇為0.2~0.8，相稱于本實驗所用溶液濃度范疇為20~200μg/mL。濃度高低也能夠用一定體積（與使用的容量瓶有關(guān)，如100mL）中含儲藏液多少來表達（如1mL，3mL等），可稱“體積濃度”。等數(shù)據(jù)解決完畢后，再將它轉(zhuǎn)換成原則濃度單位。在一次測量完畢后，比色皿須經(jīng)光學(xué)純水清洗，待測濃度溶液清洗后，再加入待測溶液進行測試。分光光度計測量經(jīng)常涉及數(shù)十個甚至上千個波長數(shù)據(jù)，要想運用好這些數(shù)據(jù)，就可能要解數(shù)目巨大的方程組，因此僅靠手工計算是不可能的，需要編程計算或運用軟件計算。本實驗提供VB編寫的計算軟件程序或自行采用MATLAB軟件或其它軟件進行計算。附錄1：光譜儀基本操作環(huán)節(jié)(1)開機，儀器參數(shù)設(shè)立：打開分光光度計電源開關(guān)，預(yù)熱約20min；在Windows操作系統(tǒng)下啟動光譜儀程序，待計算機與光譜儀通訊成功，可進入主工作程序；選擇附屬功效-狹縫設(shè)立設(shè)定狹縫寬度。狹縫寬度過大時，入射光的單色光減少，校準(zhǔn)曲線偏離比耳定律，敏捷度減少；狹縫寬度過窄時，光強變?nèi)酰瑑x器的增益提高，儀器噪聲增大，于測量不利。選擇附屬功效-波長設(shè)立設(shè)定波長范疇，波長范疇太大，測試時間太長，并增加數(shù)據(jù)解決量，增加誤差；波長范疇太小，不能完全覆蓋物質(zhì)的吸取光譜寬度，測試數(shù)據(jù)不全，增加測量誤差；因而選擇適宜的波長范疇，能夠有效減少誤差。選擇測試-波長掃描進入波長掃描界面-模式選擇吸光度或透射率；選擇測試-波長掃描進入波長掃描界面-參數(shù)設(shè)立對掃描次數(shù)、掃描速度、起止波長、坐標(biāo)上下限進行設(shè)定；在參考通道與物光通道分別插入裝有蒸餾水的石英比色皿，蓋好防塵蓋，選擇附屬功效-建立基線進行基線掃描。(2)關(guān)機測量工作結(jié)束后，退出系統(tǒng)。先關(guān)閉系統(tǒng)軟件，再關(guān)閉分光光度計。取出分光光度計內(nèi)參考通道和物光通道比色皿分別清洗干凈后交老師收存。拷貝好實驗數(shù)據(jù)后，退出Windows操作系統(tǒng)，關(guān)閉電源。附錄2試劑闡明(1)檸檬黃(酒石黃，Tartrazine)檸檬黃是3-羧基-5-羧基-1-(對磺苯基)-4-(對磺苯基偶氮)鄰氮茂的三鈉鹽，屬單偶氮類色素，構(gòu)造式以下：檸檬黃外觀為橙黃色粉末，易溶于水、甘油、丙二醇、微溶于乙醇，不溶于油脂，對熱、酸、光及鹽均穩(wěn)定，耐氧性差，遇堿變紅色，還原時褪色。最大使用量0.1g/kg，最大吸取波長426nm(2)日落黃(SunsetYellow)日落黃是1-(對磺酸苯基偶氮)-2-萘酚-6-磺酸二鈉鹽，屬單偶氮類色素，構(gòu)造式以下：其外觀為橙紅色粉末，易溶于水、甘油、丙二醇，微溶于乙醇，不溶于油脂。最大使用量0.1g/kg，最大吸取波長482nm(3)胭脂紅(麗春紅4R，Ponceau4R)胭脂紅是1-(4’-磺基-1’-萘偶氮)-2-萘酚-6,8-其外觀為紅色粉末，易溶于水、甘油，微溶于乙醇和乙二醇一乙醚混合溶液。最大使用量0.05g/kg檸檬黃、日落黃和胭脂紅的光譜吸取曲線如圖4所示圖4檸檬黃、日落黃和胭脂紅的光譜吸取曲線附錄3最小二乘法當(dāng)在實驗中測得自變量x與因變量y的n個對應(yīng)，，…,時，要找出已知類型的函數(shù)關(guān)系，使（稱為殘差）的平方和最小，即：，這種求的辦法，稱為最小二乘法。 設(shè)函數(shù)殘差為S，則所得的殘差線性方程組如（1）式所示：(1)根據(jù)數(shù)學(xué)分析知，欲使殘差的平方和S取值最小，要滿足的條件是，，…，且其二階導(dǎo)數(shù)不不大于0。經(jīng)整頓得：(2)對(1)式中各方程求二階偏導(dǎo)數(shù)恒為正，因而(1)式中各方程求得的極值為最小值，滿足最小二乘條件，則有：(3)式稱為最小二乘法預(yù)計的正規(guī)方程。將正規(guī)方程寫成矩陣形式，可表達為：(4)整頓(4)式有(5)