混料設計優(yōu)化紫菜蛋白降壓肽工藝

混料設計優(yōu)化紫菜蛋白降壓肽工藝

高血壓是一種慢性疾病，通過動脈血管壓增加。這是中國和外國之間的又一場“流行病”。血管緊張素轉換酶(ACE)抑制劑是降血壓藥物中發(fā)展最快的一類,但合成藥物有一些不良反應,如引發(fā)蛋白尿、白細胞減少和停藥綜合癥等。來源于食物蛋白的降壓肽沒有上述副作用,且僅對高血壓患者起降壓作用,對正常人無降壓作用,同時還具有免疫調節(jié)等功能。為此,開發(fā)天然降壓肽產(chǎn)品成為降血壓藥物的研究熱點。自1965年Ferreirra首次從巴西蝮蛇蛇毒中分離出ACE抑制肽以來,人們在許多食品的蛋白質中發(fā)現(xiàn)ACE抑制肽,如牛乳酪蛋白、沙丁魚肉、酸奶、大蒜、大豆、麥胚、玉米等。然而以海藻蛋白為原料進行降壓肽的研究起步較晚。條斑紫菜營養(yǎng)豐富,蛋白質含量高達40%,適于制備降壓肽。長期以來,降壓肽的制備工藝是在單一酶法篩選基礎上進行的,但單一酶作用位點較單一,導致蛋白水解度低且水解時間長等問題。為此,部分學者嘗試物理場促進法,即采用超聲波技術輔助提高酶解效率以及酶組合法,結果表明多種酶協(xié)同作用有一定的優(yōu)勢。該研究僅定性研究多種酶組合因素,未做定量模型優(yōu)化研究。在降壓活性體外模擬檢測方面,紫外分光光度法最為簡單、實用,HPLC法最常用且較為精確,而HPCE法更方便、快速、精確。本文以紫菜蛋白為原料,ACE抑制活性為指標,采用Alcalase堿性蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶、胰蛋白酶進行混料設計,建立數(shù)學模型,優(yōu)化酶的配比。在此基礎上優(yōu)化水解條件,確定最佳工藝。1材料和方法1.1血管緊張素轉換酶Alcalase蛋白酶(50℃,pH9.0)、Neutrase中性蛋白酶(45℃,pH7.0)、胰蛋白酶(pH8.0,50℃),丹麥NOVO公司;血管緊張素轉換酶(ACE),Sigma公司;馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL),Fluka公司;馬尿酸(Hip),中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司;Folin-酚試劑,Sigma公司;其它化學試劑均為國產(chǎn)分析純。條斑紫菜蛋白(紫菜:江蘇省南通市蘭波實業(yè)有限公司)由堿提酸沉法獲得,其主要組分見表1。1.2測試方法1.2.1活性物質的測定方法將紫菜蛋白配制一定質量分數(shù),攪拌,調整pH、溫度,加酶,水解一定時間,95℃保溫10min,離心(5000r/min,20min),收集上清液,測定抑制率。1.2.2降血壓活性測定蛋白質測定:GB/T5009·5-2003;水分測定:GB/T5009·3-2003;脂肪測定:GB/T5009·6-2003;灰分測定:GB/T5009·4-2003;總糖測定:苯酚-硫酸法。HPCE法測定降血壓活性:石英毛細管柱,磷酸緩沖液(50mmol/L,pH8.3),進樣(壓力4.8kPa,時間3s),分離電壓20kV,檢測波長228nm。降血壓體外測定原理見圖1和圖2,通過HHL在ACE的作用下生成馬尿酸及HL模擬體內緊張素反應過程。1.2.3不同酶配比組合的篩選采用混料試驗設計,對紫菜蛋白進行水解研究。固定底物質量分數(shù)5%,酶添加量為紫菜蛋白總量的2%,溫度50℃,pH8.0,水解60min。以抑制率為指標,優(yōu)化3種酶的配比組合。式中,I———樣品對ACE的抑制率;Sa———對照組馬尿酸峰面積;Co———添加樣品后馬尿酸峰面積。1.2.4因素水平正交試驗為確定混合酶最佳水解條件,對混合酶的溫度、底物質量分數(shù)、加酶量、pH值采用四因素三水平L9(34)正交試驗設計。以抑制率為指標做試驗,設計因素水平方案見表2。水解時間由單因素試驗獲得,固定溫度、底物質量分數(shù)、加酶量、pH,時間30~240min,以抑制率為指標。2結果與討論2.1混料設計中的混料比自1958年Scheffe提出單純型格子設計以來,混料設計理論及應用都有了很大的發(fā)展。在混料設計中,每個分量的貢獻都表示成混料的比例。用Y表示試驗指標,X1、X2、…、Xn表示混料系統(tǒng)中n種成分各占的百分比?；炝显O計就是在混料條件或除條件式(2)之外,再加上其它條件的約束,合理地安排試驗,得出關于Y的回歸方程,使得分析方法簡單、準確,便于計算和推測最佳混料比?；炝蠗l件式(2)決定了混料回歸設計中的數(shù)學模型,它不同于一般回歸設計中采用的數(shù)學模型。一般回歸設計中采用的模型是多項式,而混料回歸設計不能采用多項式,否則會因混料條件式(2)的限制而引起信息矩陣退化?；炝匣貧w設計中常采用被稱為Scheffe多項式的數(shù)學模型。表3列出了采用混料設計進行混合酶研究的試驗方案、試驗結果及其預測值。對響應值進行Scheffe多項式(不完全三次式)擬合分析,得回歸模型方程:結果表明,不完全三次回歸模型極顯著(P<0.0001),決定系數(shù)(R-Squared=0.9624)和校正決定系數(shù)[R-Squared(Adj)=0.9373]都在0.9以上,說明模型能夠很好的擬合各指標與混合酶比例。2.2酶配比的確定依據(jù)表3中的試驗結果,利用式(3)的數(shù)學模型,將區(qū)間設定在[-1.414,1.414],同時配比和為1,進行規(guī)劃求解,獲得優(yōu)化酶配比:Alcalase堿性蛋白酶38.1%,Neutrase中性蛋白酶31.9%,胰蛋白酶30.0%。2.3基于回歸模型的混合酶比例計算方法為檢驗模型預測值與試驗值的差異,根據(jù)優(yōu)化條件做試驗,結果表明,抑制率為58.9%,而由式(3)計算的理論值為60.7%,說明回歸模型優(yōu)化的混合酶比例具有實際意義。2.4正交試驗結果混合酶水解條件不同于單一酶,為此,進行正交設計優(yōu)化,試驗設計及結果見表4。從極差R值的大小可以看出各因素對抑制率的影響大小依次為:底物質量分數(shù)、加酶量、pH和溫度。根據(jù)極差分析結果可知,較優(yōu)水平為A1B3C3D2,即底物質量分數(shù)5%、加酶量3%、pH8.5、溫度50℃。時間單因素研究結果如圖3所示。隨時間的延長,抑制率先增加后減小,90min時抑制率達到最高值74.3%。2.5單一酶法分離urase中性蛋白酶5.混合酶制備降壓肽與對照單一酶法(試劑推薦條件:Alcalase堿性蛋白酶50℃,pH9.0;Neutrase中性蛋白酶45℃,pH7.0;胰蛋白酶pH8.0,50℃)的區(qū)別:混合酶法采用優(yōu)化條件,單一酶法除pH和溫度采用酶推薦條件外,其它條件相同,結果如表5所示。對照試驗結果:混合酶比單一酶作用抑制率提高44.33%~86.45%。3最佳酶配比及水解條件確定1)采用混料設計,建立了3酶系比例與抑制率活性之間的數(shù)學模型,并進行配比優(yōu)化,模型預測具有實際意義