青藤堿脂質(zhì)體的制備工藝研究

青藤堿脂質(zhì)體的制備工藝研究

青藤堿是預(yù)防感冒和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的常用藥物。由于其生物半衰期短,大鼠體內(nèi)的t1/2僅為48.50min,因此代謝較快。目前市場(chǎng)上青藤堿的普通制劑,如片劑、注射劑等,需頻繁用藥才能達(dá)到治療效果,在臨床應(yīng)用受到一定的限制。以脂質(zhì)體為載體,將青藤堿制成關(guān)節(jié)局部應(yīng)用的經(jīng)皮給藥制劑,可減少藥物的全身吸收,使藥物集中于皮膚角質(zhì)層,形成藥物貯庫(kù),緩緩向關(guān)節(jié)部位釋藥,從而降低藥物的毒副作用,提高其生物利用度。而且脂質(zhì)體本身的成分一般為體內(nèi)所固有,無(wú)皮膚刺激等毒副作用。脂質(zhì)體經(jīng)皮給藥制劑已成為當(dāng)前局部給藥制劑發(fā)展的一個(gè)趨勢(shì)。本研究采用適合于批量生產(chǎn)的注入法制備青藤堿脂質(zhì)體,并采用混料均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化青藤堿脂質(zhì)體的膜材處方,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行制備工藝研究,為青藤堿經(jīng)皮給藥制劑的研究開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1儀器、試劑與藥品SummitP680型高效液相色譜儀,PDA-100型二極管陣列檢測(cè)器,ASI-100型自動(dòng)進(jìn)樣器(德國(guó)Dionex公司);CQF-50型超聲波清洗器,中船七院七二六所;JEM-2010HR型高分辨透射電子顯微鏡,日本JEOL公司;青藤堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)0774-9904);青藤堿結(jié)晶(自制,制備工藝用);大豆卵磷脂(上海伯奧生物科技有限公司);膽固醇(上海源聚生物科技有限公司);維生素E(廣州萬(wàn)利隆化工有限公司)。均勻設(shè)計(jì)軟件:UD3.0版(中國(guó)數(shù)學(xué)會(huì)均勻設(shè)計(jì)分會(huì))。2方法和結(jié)果2.1脂質(zhì)體包封率的測(cè)定處方以青藤堿、豆磷脂、膽固醇、維生素E(抗氧化劑)組成。以四者在其變量范圍內(nèi)的百分含量作自變量,分別設(shè)為XA,XB,XC,XD,所得脂質(zhì)體的包封率為因變量,進(jìn)行處方優(yōu)化。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定4個(gè)自變量組成范圍,同時(shí)考慮歸一化條件,給出均勻設(shè)計(jì)的約束限制條件:在該限制條件下進(jìn)行4因素的混料均勻設(shè)計(jì),采用U9(94)表,由UD3.0均勻設(shè)計(jì)軟件安排試驗(yàn),因素水平見(jiàn)表1。2.1.2堿、豆酸鈉緩沖液、膽固醇、維生素e采用注入法制備脂質(zhì)體。按表1中的處方比例(總量設(shè)定為1000mg),稱取青藤堿、豆磷脂、膽固醇、維生素E,加乙醚50mL使溶解;另取pH7.4磷酸鹽緩沖液50mL,置燒杯中,加熱至50℃并保持恒溫,在不斷攪拌下勻速注入乙醚溶液,加完后繼續(xù)攪拌1h至乙醚揮盡。超聲處理10min,即得乳白色脂質(zhì)體混懸液。2.1.3青藤堿包封率測(cè)定按照前期建立的方法測(cè)定包封率。精密量取青藤堿脂質(zhì)體混懸液0.5mL,加于SephadexG-50凝膠柱頂部,以pH7.4磷酸鹽緩沖液洗脫,流速1mL·min-1,收集4~11mL洗脫液,用氮?dú)獯抵馏w積約0.5mL,加無(wú)水乙醇定容至10mL,搖勻。精密量取10μL溶液,進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算青藤堿的含量,計(jì)為Mlip;另精密吸取青藤堿脂質(zhì)體混懸液0.5mL,用無(wú)水乙醇定容至10mL,搖勻。精密吸取10μL溶液,同法測(cè)定,計(jì)為Mtot,按下式計(jì)算包封率。各處方下包封率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1,HPLC見(jiàn)圖1。包封率計(jì)算公式:包封率(EN%)=(Mlip/Mtot)×100%Mlip為脂質(zhì)體中包封的青藤堿量;Mtot為脂質(zhì)體混懸液中所含青藤堿總量。2.1.4回歸方程結(jié)果由于XA+XB+XC+XD=100%,如限定其中3個(gè)因素的水平,則另一因素的水平即可確定。本實(shí)驗(yàn)選擇XA,XB,XC含量為回歸自變量,對(duì)因變量包封率作配方回歸,分別用一階和二階規(guī)范多項(xiàng)式建立回歸方程,求出最優(yōu)回歸子集,并求其最優(yōu)解。規(guī)范多項(xiàng)式計(jì)算公式如下:一階回歸結(jié)果:方程Y=73.41-67.94XA–4.70XC,R=0.4907,s=7.3088。方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。查F臨界值表,得F0.05(2,6),F=0.9513,回歸方程無(wú)顯著意義。二階回歸結(jié)果:方程Y=147.83-1171.71XA+1150.17XAXB+1455.91XAXC-119.57XBXC-285.93XCXC,R=0.9909,s=1.5972。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。查F臨界值表,得F0.05(5,3)=9.01,F=32.4951,回歸方程有顯著意義。由回歸處理結(jié)果可見(jiàn),二階回歸復(fù)相關(guān)系數(shù)接近于1,殘差標(biāo)準(zhǔn)差相對(duì)較小,結(jié)果有顯著意義。因此,選用二階方程進(jìn)行模型分析,求出最大解,得出最優(yōu)處方配比為:XA=8.92%,XB=60.35%,XC=28.81%,XD=1.91%。將以上結(jié)果代入回歸方程,求得在此配比條件下的預(yù)測(cè)包封率Y=75.36%。2.2維生素a、g、維生素e制備按脂質(zhì)體膜材的優(yōu)選處方配比,稱取青藤堿89mg,豆磷脂604mg,膽固醇288mg,維生素E19mg,加乙醚50mL使溶解,共制備4份;另分別取磷酸鹽緩沖液25,50,75,100mL,置燒杯中,加熱至50℃并保持恒溫,在不斷攪拌下勻速注入乙2.3包封率的測(cè)定按上述優(yōu)選處方稱取青藤堿、豆磷脂、膽固醇、維生素E,加乙醚50mL使溶解,共制備4份;另取磷酸鹽緩沖液50mL4份,置燒杯中,分別加熱至40,50,60,70℃并保持恒溫,在不斷攪拌下勻速注入乙醚溶液,加完后繼續(xù)攪拌1h至乙醚揮盡,超聲處理10min,得脂質(zhì)體混懸液。分別測(cè)定包封率,結(jié)果見(jiàn)表5?？梢?jiàn)制備溫度為50℃時(shí),所得脂質(zhì)體的包封率最高。2.4超聲處理包封率的測(cè)定按上述優(yōu)選處方稱取青藤堿、豆磷脂、膽固醇、維生素E,共取5份,分別加乙醚50mL使溶解;另取磷酸鹽緩沖液50mL,置燒杯中,加熱至50℃并保持恒溫,在不斷攪拌下勻速注入乙醚溶液,加完后繼續(xù)攪拌1h至乙醚揮盡,分別超聲處理5,10,20,30,40min,得脂質(zhì)體混懸液。分別測(cè)定包封率,結(jié)果見(jiàn)表6?？梢?jiàn)超聲時(shí)間從5~20min間包封率逐漸遞增,而20min后包封率逐漸遞減,因此超聲時(shí)間確定為20min。2.5透射電子顯微鏡psm觀察將青藤堿脂質(zhì)體置透射電鏡下觀察。采用磷鎢染法制樣,取1滴脂質(zhì)體乳液滴于點(diǎn)滴反應(yīng)瓷板的凹槽內(nèi),將噴碳銅網(wǎng)置于試液上(膜面向下),1~2min后取出銅網(wǎng),用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸干多余液體;按上述同樣方法,將該銅網(wǎng)放在染液滴上(4%磷鎢酸溶液,pH6.5)約30s,用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸干多余染液,自然揮干,用透射電子顯微鏡觀察并拍攝照片,見(jiàn)圖2。從照片可以看出,不同粒徑的脂質(zhì)體形態(tài)完整,雙分子膜結(jié)構(gòu)清晰,均屬于單室脂質(zhì)體,經(jīng)激光粒度分析儀測(cè)定,平均粒徑約200nm。3脂質(zhì)體配方均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)本研究前期已對(duì)青藤堿脂質(zhì)體的制備方法進(jìn)行了篩選,比較了薄膜分散法、逆相蒸發(fā)法及乙醚注入法的包封率,結(jié)果確定采用乙醚注入法進(jìn)行制備。本研究進(jìn)一步采用有約束混料設(shè)計(jì)法優(yōu)選注入法制備脂質(zhì)體的配方,并采用單因素考察法優(yōu)選了注入法工藝的制備條件,按優(yōu)化后工藝制備的脂質(zhì)體包封率可達(dá)76.21%。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),外水相的用量也影響脂質(zhì)體的包封率,隨著磷酸鹽緩沖液用量的增大,包封率呈下降趨勢(shì)?？赡苡捎谥|(zhì)體在外水相比例擴(kuò)大后,溶液得到稀釋,脂質(zhì)體內(nèi)被包封的藥物易從內(nèi)向外滲漏。究采用的混料均勻設(shè)計(jì)作為一種處方優(yōu)化試驗(yàn)方法,亦稱為配方均勻設(shè)計(jì),是均勻設(shè)計(jì)中的重要組成部分。試驗(yàn)中,每個(gè)因素的貢獻(xiàn)被表示為其在處方中所占配比,所有因素總和為100%。在此條件下對(duì)各因素變量進(jìn)行邊界約束,并進(jìn)行均勻設(shè)計(jì),通過(guò)試驗(yàn)求出最優(yōu)解,從而計(jì)算和推測(cè)最佳混料比。與傳統(tǒng)的均勻設(shè)計(jì)相比,混料均勻設(shè)計(jì)只需給出期望的實(shí)驗(yàn)次數(shù)以及各因素的水平范圍,不必給出具體水平,所以各試驗(yàn)點(diǎn)的設(shè)置更具代表性和合理性,試驗(yàn)次數(shù)更少,優(yōu)化結(jié)果更加穩(wěn)定和準(zhǔn)確;此外,在制劑處方配比設(shè)計(jì)中,傳統(tǒng)的均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化所確定的組分總用量不恒定,導(dǎo)致制劑的總量也隨之波動(dòng),從而造成總體積或重量的不確定性;而有約束混料均勻設(shè)計(jì)可將處方組分總量設(shè)定為100%,