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文檔簡(jiǎn)介

達(dá)

測(cè)

析基因表達(dá)

的定量檢測(cè)方法1.蛋白表達(dá)水平的檢測(cè):1)定量檢測(cè)分析:westernblotting、ELISA、HPLC2)蛋白質(zhì)功能分析:蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析:

免疫熒光技術(shù)蛋白相互作用研究:

酵母雙雜交、免疫共沉淀(

IP)、

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(

FRET

)酶活性檢測(cè):

ELISA、HPLC2.mRNA

表達(dá)水平檢測(cè):1

)

量RT-PCR2)

Northernblot3)

實(shí)

時(shí)

量PCR(RealtimePCR)Northernblot

雜交是用來(lái)檢測(cè)真核生物RNA的表達(dá)量和大小,

以估計(jì)其豐度的實(shí)驗(yàn)方法,可以從大量的RNA樣本同時(shí)獲得這些信息。其基本步驟包括:1.完整mRNA的分離2.根據(jù)RN

A

的大小通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA進(jìn)行分離3.將RNA

轉(zhuǎn)移到固相支持物(尼龍膜)上,在轉(zhuǎn)移的過(guò)程中,要保持RNA

在凝膠中的相對(duì)分布4.將RNA固定到支持物上(UV

交聯(lián))5.

相RNA與

(DNA

RNA)雜

交6.除去非特異結(jié)合到固相支持物上的探針?lè)肿?.對(duì)特異結(jié)合的探針?lè)肿拥膱D像進(jìn)行檢測(cè)、捕獲和分析ta

Rn

VS

leCycle

NumberDeltaRn·實(shí)時(shí)熒光定量PCR

技術(shù)于1996

年由美國(guó)AppliedBiosystems公司推出,

由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PC

R從定性到定量的飛躍,而且

規(guī)PCR

比,

它具有特異性

更強(qiáng)、有效

決PCR污染問(wèn)題

、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn),

目前已得到廣泛應(yīng)用?!?/p>

實(shí)時(shí)熒光定

量PCR

理所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR

技術(shù),是指在PCR

反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR

擴(kuò)增

反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,

通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲

線或內(nèi)參基因的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法?!?/p>

與常規(guī)PCR技

術(shù)比

較:對(duì)PCR擴(kuò)

增反應(yīng)的終點(diǎn)

產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析,無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定

量,

無(wú)

對(duì)

擴(kuò)

應(yīng)

實(shí)時(shí)

測(cè)

。Cycle

(

環(huán)

數(shù)

)一般而言,

熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段:熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。R

n

(

強(qiáng)

)在熒光背景信號(hào)階段,

擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,

我們無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。

PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系,

所以根據(jù)最終的

PCR

產(chǎn)物量不能計(jì)算出起

始DNA拷

貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段,

PCR

產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,

在實(shí)時(shí)熒光定量

PCR

技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念:

熒光閾值和

CT

值。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值,它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上,

但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為

CT

值(threshold

value

)幾個(gè)常用名詞概念1.Ct

值的定義C代表Cycle,t代表threshold

(閾值,臨界值),

Ct

值的含義是:

每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Cycle

(

環(huán)

數(shù))Rn

(

強(qiáng)

)2.熒光域值

(

threshold)

的設(shè)定PCR

反應(yīng)的前15

個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào),

熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍,

即:

threshold

=

10'SDcycle

3-153.Ct值

板的

關(guān)系研究表明,

每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多,

Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù),

縱坐標(biāo)代表Ct

值。因此,只要獲得未知樣品的Ct

值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。Cycle

(

環(huán)

數(shù)

)前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)

(baseline)熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動(dòng)設(shè)置:

大于熒光背景和陰性對(duì)照的熒光最高值;

進(jìn)入指數(shù)期的最初階段Rn

(

熒光

強(qiáng)

)絕對(duì)定量分析:Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系Logof

DNAconcentrationCycle

number目的基因PCR目的基因目的基因克隆目的基因質(zhì)粒質(zhì)粒提取,

OD值定量,

將質(zhì)粒梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品使用質(zhì)

標(biāo)

準(zhǔn)

備基

組DNA1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i)+9v稀釋緩沖液,

得標(biāo)準(zhǔn)品iilv標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液,得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii+9v稀釋緩沖液,得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv+9v稀釋緩沖液,

得標(biāo)準(zhǔn)品v拷貝數(shù)的計(jì)算:待測(cè)樣本濃度(ng/ul)=OD26o×40×稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)×324待測(cè)樣本拷貝數(shù)(copies/ul)=待測(cè)樣本濃度/樣本分子量×6×1014倍比梯度稀釋方法:相對(duì)定量分析必須用內(nèi)對(duì)照基因(管家基

因)進(jìn)行校正,進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。β-Actin

GAPDHβ-2-microglobulin管家基因:

維持細(xì)胞基本代謝活動(dòng)所必須的基因,如GAPDH、Actin、HPRT等R

HPRT實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)值相

對(duì)

析雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)對(duì)照樣品、待測(cè)樣品的目的基因及管家

基因進(jìn)行定

量,

據(jù)

計(jì)

對(duì)

對(duì)表

達(dá)

。公式:

校正值=

果果結(jié)結(jié)量量定定因因基基家的管目待

測(cè)

值對(duì)

值2

-△△Ct法相

對(duì)

=2-△△Ct法:假設(shè)

目的基因和參照

基因擴(kuò)

增效

近10

0

%△Ct

(處理

)=

1

8

1

7

=

1

△Ct(處理后)=16-17.4=

—1.

4△△Ct=△Ct(處理

后)一

Ct(

)

=

1.4—1=—2.4比

率(處理后/處理前)=2-△△Ct=2-(-24)=5.3修

法:

道目

標(biāo)

基因

基因

相同的

擴(kuò)

率,

擴(kuò)

2

,

么2-△△ct可以修正為:E-△△Ct,

擴(kuò)

1

.

9

5

,

計(jì)

1

.

9

5

-

△ctJun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)18161717.42-△△Ct法公

:Sample處理前處理后E1.951.95常

標(biāo)

法非特異性熒光標(biāo)記SYBR

Green

I特

標(biāo)

記TaqMan

ProbeProbeReporter

QuencherSYBR

Green

I染料法SYBR

Green

I是一種結(jié)合于所有dsDNA

雙螺旋小溝區(qū)域的具

激發(fā)

長(zhǎng)的

。SYBR

Green

ISYBR

Green

I染料法—

—作用機(jī)理熱

引物

F

F

F

F

熒光物質(zhì)F延伸反應(yīng)DNA

二引

退

火FAMTM,VIC?,

NEDTM,

CY5TM&

ROXTMAmplificationPlot

ReportDelta

Rnvs

Cycle1.0e+0001.0e-002Cycle

NumberCy5

FAMVICNED1.0e-001Delta

RnEmissionmaximum(nm)*513517518521538548552552553570582604607615640667707DyeFluoresceinOregon

GreenFAMSYBR

GreenTETJOEVIC@Yakima

YellowWHEXCy°3TAMRACy3.5ROXTexas

RedLightCycler-Red

640(LC640)Cy5Cy5.5Excitationmaximum(nm)490492494494521520538526535552560588587596625643683420

nm>460

nm500

nm540

nm580

nm620

nm660nmEMISSIONCy3Alexa568GFPFITCEXCITATIONDAPICy5Biosearch

BlueTM352

447BHO~-0495CR-430-520mmFAM

495

520TET

521

536CAL

FluorGold

540WIC/TETJDEREPLACENFNT)522

544J0E529555WIC

538

554534

nmBHQ-1

QR=480-580nmTe

579

nmBHQ

-2

OR-559-670

nmBHO-2

dye

is

recommendedfor

Puisar

650,Quasar

670.

and

auasar

705

dyes

dueto

slsc

guencngHEX

535

556CAL

Fluor

Orange

560(WICHECJDEBEPLACEMENT538

559Quasar570(CY3REPLACENENT)548

566CyTM

3

549

566NED546

575TAMRA

557

583CAL

Fluor

Red

590(TAMRAREPLACEMENT)569

591Cy3.5

581

596ROX

586

610CAL

Fluor

Red

610(TEXAS

REDRORFPLACFMENT)590

610Texas

Red

597

616CAL

Fluor

Red

635LC

RED

64個(gè)5REPLACENENT)618

637Pulsar

650

460

650Cy

5

646

669Quasar

670(CY5REPLACEMENT)647

670Cy

5.5

675

694Quasar

705(CYS.5REPLACEMENT]690

705BHU-3672

nmCA-620-730

nmDYE-5'-ToEX

EMFLUOROPHOREBHO

Dye*SYBR

Green

I與雙鏈DNA

進(jìn)行結(jié)合后散發(fā)熒光,因此如

果反應(yīng)體系中有非特異性擴(kuò)增或引物二聚體的產(chǎn)生,也將

同時(shí)被檢測(cè),

從而可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。設(shè)計(jì)合適引物,

防止非特異性擴(kuò)增!融解曲線分析,單一峰

無(wú)非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析,出現(xiàn)雜峰

其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒

光,

因此定量不準(zhǔn)確

SYBRGreenI染料法優(yōu)點(diǎn):價(jià)格便宜,使用方便,

不用設(shè)計(jì)復(fù)雜的探針。缺點(diǎn):無(wú)模板特異性,

對(duì)引物特異性要求比較高,不能進(jìn)行多重定量分析5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R),

如FAM、VIC

等3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q

)探針完整,R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收,無(wú)熒光,

R與Q分開(kāi),發(fā)熒光Taq酶有5′→3’外切核酸酶活性,可水解探針

Taqman

法Taqman

法熱

物引

物和探針

與模

退火DNA聚

酶延

應(yīng)G@2報(bào)告基團(tuán)淬滅基團(tuán)探

針探

針RRRMolecular

Beacon淬滅基因2.引物退火/探針雜交Polymerase3.延伸反應(yīng)2.引物退火/探針與模板的雜交Polymerase

B

探針雜交

@Taqman

ProbeMolecularBeacon探針淬滅基因背景熒光更低Primer11

1

」3.延伸反應(yīng)TTT熒光物質(zhì)1.熱變性1.熱變性熒光物質(zhì)Primer雜交TT反應(yīng)優(yōu)化反

應(yīng)

、

積■50ul

對(duì)

要■20ul應(yīng)用廣,但成本高■推薦10ul,

但需要優(yōu)化引物與引物、

引物與探針濃度配比■

4

,

5

0nm,300nm,600nm,900nm■

5

0nm,100nm,250nmqPCR一般使用二步PCR

擴(kuò)增,在退火-延伸整合步

驟結(jié)

時(shí)

進(jìn)

號(hào)

測(cè)

。當(dāng)

PC

R反映效率低時(shí)可以使用三步

PCR擴(kuò)增

。

染料法可

以在72

℃延伸結(jié)束時(shí)檢測(cè)。探針?lè)ㄖ?/p>

能在

退

結(jié)

時(shí)

測(cè)

??蓹z測(cè)的RNA

種類·含小分子RNA的Total

RNA

·小分子RNA(建議使用)RNA

法·沉淀法抽提總RNA·

離心柱法富集小RNA更適合

次R

T

測(cè)

的m

i

RNA

>

使

,

高>

對(duì)

來(lái)

測(cè)適合

個(gè)

測(cè)

m

i

R

N

A>

M

G

B

L

N

A

價(jià)

高>

對(duì)

R

T

設(shè)

計(jì)

使

度及

轉(zhuǎn)

求>AB

I在L

o

o

p

轉(zhuǎn)

開(kāi)

發(fā)

的Mega

plex

TM

Primer

Pools彌補(bǔ)了其高通量的檢測(cè)的弱勢(shì)1

R

T

測(cè)

m

i

R

N

A通

性育

無(wú)

沈>

mat

u

r

e

-

m

i

R

N

A

達(dá)

況下,易被極高豐度的Pre

-

m

i

R

N

A

測(cè)

.>

mi

R

N

A

測(cè)

>靈

高,

但需

解曲

線來(lái)

進(jìn)

斷>經(jīng)

濟(jì)

、

便

3PolyA

polymerase

AAAAAAAAAA….Annealoligo-dTadaptorandRTreaction-AAAA

AAAAAAVTTTTTTT

T3'

TTTTTTTTTcDNA

templateready

for

qPCRaninOmo-minnaarEnpsinarTTTTTTTTTlmssselAmrmiRNA

RTprimer,1Step

1:StemIaop

RTIITII

IIimmcDNA

t

l-

i

PCRForward

primerR

imTerme:apeeTotal

RNAMaturemiRNA3'PolyadenylationReverse

transcription53cDNAqPCRAssayIaqManPoly

A加尾法Loop反轉(zhuǎn)錄法5*RcR

PC…pro

bemiENA!LISt

l

op

RT11

IIICDNAStep

2:ForwardPrimerTaqMano:eemiRNAmStep

1:

Ip

Step2:Real-timePGRForwardSybrgreen

l

ReverseRTlteIIm-1S>

測(cè)

法,

低需采

M

G

B

L

N

A

針,成

高>

R

T

,

設(shè)

計(jì)

簡(jiǎn)

單>采用染料法,相對(duì)成本偏低.>檢測(cè)特異性高于PolyA加尾法,但

可能反轉(zhuǎn)錄的靈敏度低于PolyA加尾Loop反轉(zhuǎn)錄法探針檢測(cè)

Loop反轉(zhuǎn)錄法染料檢測(cè)Real-time

PCRRT

primerRp

sreprimerIIIIII1

11

HprobeRT1因素建議指標(biāo)效率5

個(gè)

數(shù)

級(jí)

釋Slope~-3.3R2>0.99精密度至少3個(gè)重復(fù)標(biāo)

準(zhǔn)

<

0

.

2

5(0.

5

者1

個(gè)

Ct

之內(nèi))靈敏度增

本的

復(fù)

數(shù)統(tǒng)計(jì)分析除了這些因素,還必須評(píng)估和驗(yàn)證合適的實(shí)驗(yàn)對(duì)照(如無(wú)模板對(duì)照,

無(wú)

反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)照等)以及模板質(zhì)量。評(píng)價(jià)熒光

PCR

結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)>檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤:一般SG法采用72℃

延伸時(shí)采集,Taqman法則

在退火

結(jié)

時(shí)

結(jié)

號(hào)

。>引物或

針降解

過(guò)

PAGE電泳

檢測(cè)

其完

。>

量不

對(duì)未

知濃

度的

樣品

應(yīng)

從系

樣本

最高

。模板降解:

備中雜

質(zhì)

的引

反復(fù)凍

。qPCR可能

出現(xiàn)

問(wèn)

法1.

無(wú)

Ct值

現(xiàn)CyeleCyclega

lnes

aradde帆

擴(kuò)增效率低:反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計(jì)更好的引物或探針;改用三步法進(jìn)行反應(yīng);適當(dāng)降低退火溫度;增加鎂離子濃度等。>

PCR

各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。PCR

產(chǎn)物太長(zhǎng):

一般采用80-150bp

的產(chǎn)物長(zhǎng)度。2.

Ct

值出現(xiàn)過(guò)晚

(Ct>38)LogStartingQuantty,copy

number>

加樣存在誤差:

使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度。>標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解:應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融,

或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。>

引物或探針不佳:

重新設(shè)

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