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文檔簡(jiǎn)介
基
因
表
達(dá)
的
定
量
檢
測(cè)
分
析基因表達(dá)
的定量檢測(cè)方法1.蛋白表達(dá)水平的檢測(cè):1)定量檢測(cè)分析:westernblotting、ELISA、HPLC2)蛋白質(zhì)功能分析:蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析:
免疫熒光技術(shù)蛋白相互作用研究:
酵母雙雜交、免疫共沉淀(
IP)、
熒光共振能量轉(zhuǎn)移(
FRET
)酶活性檢測(cè):
ELISA、HPLC2.mRNA
表達(dá)水平檢測(cè):1
)
半
定
量RT-PCR2)
Northernblot3)
實(shí)
時(shí)
熒
光
定
量PCR(RealtimePCR)Northernblot
雜交是用來(lái)檢測(cè)真核生物RNA的表達(dá)量和大小,
以估計(jì)其豐度的實(shí)驗(yàn)方法,可以從大量的RNA樣本同時(shí)獲得這些信息。其基本步驟包括:1.完整mRNA的分離2.根據(jù)RN
A
的大小通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA進(jìn)行分離3.將RNA
轉(zhuǎn)移到固相支持物(尼龍膜)上,在轉(zhuǎn)移的過(guò)程中,要保持RNA
在凝膠中的相對(duì)分布4.將RNA固定到支持物上(UV
交聯(lián))5.
固
相RNA與
探
針
分
子
(DNA
或
RNA)雜
交6.除去非特異結(jié)合到固相支持物上的探針?lè)肿?.對(duì)特異結(jié)合的探針?lè)肿拥膱D像進(jìn)行檢測(cè)、捕獲和分析ta
Rn
VS
leCycle
NumberDeltaRn·實(shí)時(shí)熒光定量PCR
技術(shù)于1996
年由美國(guó)AppliedBiosystems公司推出,
由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PC
R從定性到定量的飛躍,而且
與
常
規(guī)PCR
相
比,
它具有特異性
更強(qiáng)、有效
解
決PCR污染問(wèn)題
、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn),
目前已得到廣泛應(yīng)用?!?/p>
實(shí)時(shí)熒光定
量PCR
原
理所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR
技術(shù),是指在PCR
反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR
擴(kuò)增
反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,
通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲
線或內(nèi)參基因的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法?!?/p>
與常規(guī)PCR技
術(shù)比
較:對(duì)PCR擴(kuò)
增反應(yīng)的終點(diǎn)
產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析,無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定
量,
無(wú)
法
對(duì)
擴(kuò)
增
反
應(yīng)
實(shí)時(shí)
檢
測(cè)
。Cycle
(
循
環(huán)
數(shù)
)一般而言,
熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段:熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。R
n
(
熒
光
強(qiáng)
度
)在熒光背景信號(hào)階段,
擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,
我們無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。
PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系,
所以根據(jù)最終的
PCR
產(chǎn)物量不能計(jì)算出起
始DNA拷
貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段,
PCR
產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,
在實(shí)時(shí)熒光定量
PCR
技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念:
熒光閾值和
CT
值。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值,它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上,
但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為
CT
值(threshold
value
)幾個(gè)常用名詞概念1.Ct
值的定義C代表Cycle,t代表threshold
(閾值,臨界值),
Ct
值的含義是:
每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Cycle
(
循
環(huán)
數(shù))Rn
(
熒
光
強(qiáng)
度
)2.熒光域值
(
threshold)
的設(shè)定PCR
反應(yīng)的前15
個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào),
熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍,
即:
threshold
=
10'SDcycle
3-153.Ct值
與
起
始
模
板的
關(guān)系研究表明,
每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多,
Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù),
縱坐標(biāo)代表Ct
值。因此,只要獲得未知樣品的Ct
值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。Cycle
(
循
環(huán)
數(shù)
)前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)
(baseline)熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動(dòng)設(shè)置:
大于熒光背景和陰性對(duì)照的熒光最高值;
進(jìn)入指數(shù)期的最初階段Rn
(
熒光
強(qiáng)
度
)絕對(duì)定量分析:Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系Logof
DNAconcentrationCycle
number目的基因PCR目的基因目的基因克隆目的基因質(zhì)粒質(zhì)粒提取,
OD值定量,
將質(zhì)粒梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品使用質(zhì)
粒
標(biāo)
準(zhǔn)
品
的
制
備基
因
組DNA1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i)+9v稀釋緩沖液,
得標(biāo)準(zhǔn)品iilv標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液,得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii+9v稀釋緩沖液,得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv+9v稀釋緩沖液,
得標(biāo)準(zhǔn)品v拷貝數(shù)的計(jì)算:待測(cè)樣本濃度(ng/ul)=OD26o×40×稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)×324待測(cè)樣本拷貝數(shù)(copies/ul)=待測(cè)樣本濃度/樣本分子量×6×1014倍比梯度稀釋方法:相對(duì)定量分析必須用內(nèi)對(duì)照基因(管家基
因)進(jìn)行校正,進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。β-Actin
GAPDHβ-2-microglobulin管家基因:
維持細(xì)胞基本代謝活動(dòng)所必須的基因,如GAPDH、Actin、HPRT等R
HPRT實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)值相
對(duì)
定
量
分
析雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)對(duì)照樣品、待測(cè)樣品的目的基因及管家
基因進(jìn)行定
量,
然
后
根
據(jù)
計(jì)
算
公
式
求
得
相
對(duì)
值
即
為
相
對(duì)表
達(dá)
量
。公式:
校正值=
果果結(jié)結(jié)量量定定因因基基家的管目待
測(cè)
樣
品
的
校
正
值對(duì)
照
樣
品
的
校
正
值2
-△△Ct法相
對(duì)
值
=2-△△Ct法:假設(shè)
目的基因和參照
基因擴(kuò)
增效
率
都
接
近10
0
%△Ct
(處理
前
)=
1
8
—
1
7
=
1
△Ct(處理后)=16-17.4=
—1.
4△△Ct=△Ct(處理
后)一
△
Ct(
處
理
前
)
=
—
1.4—1=—2.4比
率(處理后/處理前)=2-△△Ct=2-(-24)=5.3修
正
方
法:
如
果
我
們
知
道目
標(biāo)
基因
和
參
照
基因
有
相同的
擴(kuò)
增
效
率,
但
擴(kuò)
增
效
率
不
等
于
2
,
那
么2-△△ct可以修正為:E-△△Ct,
例
如
擴(kuò)
增
效
率
為
1
.
9
5
,
那
么
計(jì)
算
公
式
可
修
正
為
1
.
9
5
-
△
△ctJun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)18161717.42-△△Ct法公
式
:Sample處理前處理后E1.951.95常
用
熒
光
標(biāo)
記
方
法非特異性熒光標(biāo)記SYBR
Green
I特
異
性
熒
光
標(biāo)
記TaqMan
ProbeProbeReporter
QuencherSYBR
Green
I染料法SYBR
Green
I是一種結(jié)合于所有dsDNA
雙螺旋小溝區(qū)域的具
有
綠
色
激發(fā)
波
長(zhǎng)的
染
料
。SYBR
Green
ISYBR
Green
I染料法—
—作用機(jī)理熱
變
性
引物
F
F
F
F
熒光物質(zhì)F延伸反應(yīng)DNA
聚
合
酶
二引
物
退
火FAMTM,VIC?,
NEDTM,
CY5TM&
ROXTMAmplificationPlot
ReportDelta
Rnvs
Cycle1.0e+0001.0e-002Cycle
NumberCy5
FAMVICNED1.0e-001Delta
RnEmissionmaximum(nm)*513517518521538548552552553570582604607615640667707DyeFluoresceinOregon
GreenFAMSYBR
GreenTETJOEVIC@Yakima
YellowWHEXCy°3TAMRACy3.5ROXTexas
RedLightCycler-Red
640(LC640)Cy5Cy5.5Excitationmaximum(nm)490492494494521520538526535552560588587596625643683420
nm>460
nm500
nm540
nm580
nm620
nm660nmEMISSIONCy3Alexa568GFPFITCEXCITATIONDAPICy5Biosearch
BlueTM352
447BHO~-0495CR-430-520mmFAM
495
520TET
521
536CAL
FluorGold
540WIC/TETJDEREPLACENFNT)522
544J0E529555WIC
538
554534
nmBHQ-1
QR=480-580nmTe
579
nmBHQ
-2
OR-559-670
nmBHO-2
dye
is
recommendedfor
Puisar
650,Quasar
670.
and
auasar
705
dyes
dueto
slsc
guencngHEX
535
556CAL
Fluor
Orange
560(WICHECJDEBEPLACEMENT538
559Quasar570(CY3REPLACENENT)548
566CyTM
3
549
566NED546
575TAMRA
557
583CAL
Fluor
Red
590(TAMRAREPLACEMENT)569
591Cy3.5
581
596ROX
586
610CAL
Fluor
Red
610(TEXAS
REDRORFPLACFMENT)590
610Texas
Red
597
616CAL
Fluor
Red
635LC
RED
64個(gè)5REPLACENENT)618
637Pulsar
650
460
650Cy
5
646
669Quasar
670(CY5REPLACEMENT)647
670Cy
5.5
675
694Quasar
705(CYS.5REPLACEMENT]690
705BHU-3672
nmCA-620-730
nmDYE-5'-ToEX
EMFLUOROPHOREBHO
Dye*SYBR
Green
I與雙鏈DNA
進(jìn)行結(jié)合后散發(fā)熒光,因此如
果反應(yīng)體系中有非特異性擴(kuò)增或引物二聚體的產(chǎn)生,也將
同時(shí)被檢測(cè),
從而可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。設(shè)計(jì)合適引物,
防止非特異性擴(kuò)增!融解曲線分析,單一峰
無(wú)非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析,出現(xiàn)雜峰
其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒
光,
因此定量不準(zhǔn)確
SYBRGreenI染料法優(yōu)點(diǎn):價(jià)格便宜,使用方便,
不用設(shè)計(jì)復(fù)雜的探針。缺點(diǎn):無(wú)模板特異性,
對(duì)引物特異性要求比較高,不能進(jìn)行多重定量分析5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R),
如FAM、VIC
等3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q
)探針完整,R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收,無(wú)熒光,
R與Q分開(kāi),發(fā)熒光Taq酶有5′→3’外切核酸酶活性,可水解探針
Taqman
探
針
法Taqman
探
針
法熱
變
性
引
物引
物和探針
與模
板
退火DNA聚
合
酶延
伸
反
應(yīng)G@2報(bào)告基團(tuán)淬滅基團(tuán)探
針探
針RRRMolecular
Beacon淬滅基因2.引物退火/探針雜交Polymerase3.延伸反應(yīng)2.引物退火/探針與模板的雜交Polymerase
B
探針雜交
@Taqman
ProbeMolecularBeacon探針淬滅基因背景熒光更低Primer11
1
」3.延伸反應(yīng)TTT熒光物質(zhì)1.熱變性1.熱變性熒光物質(zhì)Primer雜交TT反應(yīng)優(yōu)化反
應(yīng)
液
組
成
、
體
積■50ul
絕
對(duì)
不
必
要■20ul應(yīng)用廣,但成本高■推薦10ul,
但需要優(yōu)化引物與引物、
引物與探針濃度配比■
4×
4
組
合
,
5
0nm,300nm,600nm,900nm■
探
針
5
0nm,100nm,250nmqPCR一般使用二步PCR
擴(kuò)增,在退火-延伸整合步
驟結(jié)
束
時(shí)
進(jìn)
行
信
號(hào)
檢
測(cè)
。當(dāng)
PC
R反映效率低時(shí)可以使用三步
PCR擴(kuò)增
。
染料法可
以在72
℃延伸結(jié)束時(shí)檢測(cè)。探針?lè)ㄖ?/p>
能在
退
火
結(jié)
束
時(shí)
檢
測(cè)
??蓹z測(cè)的RNA
種類·含小分子RNA的Total
RNA
·小分子RNA(建議使用)RNA
抽
提
方
法·沉淀法抽提總RNA·
離心柱法富集小RNA更適合
一
次R
T
檢
測(cè)
特
異
的m
i
RNA
>
因
使
用
探
針
,
特
異
性
高>
相
對(duì)
來(lái)
講
靈
敏
度
低
于
染
料
法
檢
測(cè)適合
多
個(gè)
樣
本
中
檢
測(cè)
同
一
m
i
R
N
A>
M
G
B
或
L
N
A
探
針
價(jià)
格
較
高>
對(duì)
于
R
T
引
物
的
設(shè)
計(jì)
、
使
用
濃
度及
反
轉(zhuǎn)
錄
條
件
需
有
極
高
的
要
求>AB
I在L
o
o
p
反
轉(zhuǎn)
錄
法
上
開(kāi)
發(fā)
的Mega
plex
TM
Primer
Pools彌補(bǔ)了其高通量的檢測(cè)的弱勢(shì)1
次
R
T
可
檢
測(cè)
所
有
m
i
R
N
A通
用
性育
無(wú)
背
是
泛
沈>
在
mat
u
r
e
-
m
i
R
N
A
低
表
達(dá)
的
情
況下,易被極高豐度的Pre
-
m
i
R
N
A
干
擾
檢
測(cè)
.>
更
適
合
mi
R
N
A
的
高
通
量
檢
測(cè)
>靈
敏
度
高,
但需
用
融
解曲
線來(lái)
進(jìn)
行
特
異
性
判
斷>經(jīng)
濟(jì)
、
方
便
3PolyA
polymerase
AAAAAAAAAA….Annealoligo-dTadaptorandRTreaction-AAAA
AAAAAAVTTTTTTT
T3'
TTTTTTTTTcDNA
templateready
for
qPCRaninOmo-minnaarEnpsinarTTTTTTTTTlmssselAmrmiRNA
RTprimer,1Step
1:StemIaop
RTIITII
IIimmcDNA
t
l-
i
PCRForward
primerR
imTerme:apeeTotal
RNAMaturemiRNA3'PolyadenylationReverse
transcription53cDNAqPCRAssayIaqManPoly
A加尾法Loop反轉(zhuǎn)錄法5*RcR
PC…pro
bemiENA!LISt
l
op
RT11
IIICDNAStep
2:ForwardPrimerTaqMano:eemiRNAmStep
1:
Ip
Step2:Real-timePGRForwardSybrgreen
l
ReverseRTlteIIm-1S>
檢
測(cè)
特
異
性
高
于
染
料
法,
但
靈
敏
度
偏
低需采
用
M
G
B
或
L
N
A
修
飾
探
針,成
本
偏
高>
探
針
的
錨
定
位
置
偏
R
T
引
物
部
分
,
設(shè)
計(jì)
簡(jiǎn)
單>采用染料法,相對(duì)成本偏低.>檢測(cè)特異性高于PolyA加尾法,但
可能反轉(zhuǎn)錄的靈敏度低于PolyA加尾Loop反轉(zhuǎn)錄法探針檢測(cè)
Loop反轉(zhuǎn)錄法染料檢測(cè)Real-time
PCRRT
primerRp
sreprimerIIIIII1
11
HprobeRT1因素建議指標(biāo)效率5
個(gè)
數(shù)
量
級(jí)
梯
度
稀
釋Slope~-3.3R2>0.99精密度至少3個(gè)重復(fù)標(biāo)
準(zhǔn)
差
<
0
.
2
5(0.
5
或
者1
個(gè)
Ct
之內(nèi))靈敏度增
加
低
濃
度
樣
本的
重
復(fù)
數(shù)統(tǒng)計(jì)分析除了這些因素,還必須評(píng)估和驗(yàn)證合適的實(shí)驗(yàn)對(duì)照(如無(wú)模板對(duì)照,
無(wú)
反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)照等)以及模板質(zhì)量。評(píng)價(jià)熒光
PCR
結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)>檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤:一般SG法采用72℃
延伸時(shí)采集,Taqman法則
一
般
在退火
結(jié)
束
時(shí)
或
延
伸
結(jié)
束
采
集
信
號(hào)
。>引物或
探
針降解
:
可
通
過(guò)
PAGE電泳
檢測(cè)
其完
整
性
。>
模
板
量不
足
:
對(duì)未
知濃
度的
樣品
應(yīng)
從系
列
稀
釋
樣本
的
最高
濃
度
做
起
。模板降解:
避
免
樣
品
制
備中雜
質(zhì)
的引
入
及
反復(fù)凍
融
的
情
況
。qPCR可能
出現(xiàn)
的
問(wèn)
題
及
解
決
方
法1.
無(wú)
Ct值
出
現(xiàn)CyeleCyclega
lnes
aradde帆
擴(kuò)增效率低:反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計(jì)更好的引物或探針;改用三步法進(jìn)行反應(yīng);適當(dāng)降低退火溫度;增加鎂離子濃度等。>
PCR
各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。PCR
產(chǎn)物太長(zhǎng):
一般采用80-150bp
的產(chǎn)物長(zhǎng)度。2.
Ct
值出現(xiàn)過(guò)晚
(Ct>38)LogStartingQuantty,copy
number>
加樣存在誤差:
使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度。>標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解:應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融,
或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。>
引物或探針不佳:
重新設(shè)
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