凱氏定氮法實(shí)驗(yàn)報(bào)告-山東大學(xué)

微量凱氏定氮法姓名：XXX年級(jí)：2010級(jí)生物基地班學(xué)號(hào)：201000140001同組者：XXX科目：生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2013年6月3日一、【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 掌握凱氏（Kjeldahl）定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法2．掌握微量凱氏定氮法的操作技術(shù)，包括標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨含量的測(cè)定，未知樣品的消化、蒸餾、滴定及其含氮量的計(jì)算等。二、【實(shí)驗(yàn)原理】天然有機(jī)物的含氮量常用微量凱氏定氮法來測(cè)定。生物材料的含氮化合物分析測(cè)定主要是指蛋白質(zhì)，核酸的含量通常是用定磷法或別的方法測(cè)定。蛋白質(zhì)的含氮量幾乎是恒定的，約在15~16%之間。因此只要測(cè)定蛋白氮，乘以6.25，即為粗蛋白質(zhì)含量。凱氏定氮法首先將含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱，經(jīng)一系列的分解、碳化和氧化還原反應(yīng)等復(fù)雜過程，最后有機(jī)氮轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)氮硫酸銨，這一過程稱為有機(jī)物的消化。為了加速和完全有機(jī)物質(zhì)的分解，縮短消化時(shí)間，在消化時(shí)通常加入硫酸鉀、硫酸銅、過氧化氫等試劑，加入硫酸鉀可以提高消化液的沸點(diǎn)而加快有機(jī)物分解，硫酸銅起催化劑的作用。使用時(shí)常加入少量過氧化氫作為氧化劑以加速有機(jī)物氧化。消化完成后，將消化液轉(zhuǎn)入凱氏定氮儀反應(yīng)室，加入過量的濃氫氧化鈉，將NH4+轉(zhuǎn)變成NH3，通過蒸餾把NH3驅(qū)入過量的硼酸溶液接受瓶?jī)?nèi)，硼酸接受氨后，形成四硼酸銨，然后用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定，直到硼酸溶液恢復(fù)原來的氫離子濃度。滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸摩爾數(shù)即為NH3的摩爾數(shù)，通過計(jì)算即可得出總氮量。在滴定過程中，滴定終點(diǎn)采用甲基紅-次甲基藍(lán)混合指示劑顏色變化來判定。測(cè)定出的含氮量是樣品的總氮量，其中包括有機(jī)氮和無機(jī)氮。以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：反應(yīng)（1），（2）在凱氏燒瓶?jī)?nèi)完成，反應(yīng)（3）凱氏蒸餾燒瓶中進(jìn)行（圖1）。蛋白質(zhì)是一類復(fù)雜的含氮化合物，每種蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量（約在14％~18％，平均為16％）。凱氏定氮法測(cè)定出的含氮量，再乘以系數(shù)6.25，即為蛋白質(zhì)含量。三、【試驗(yàn)器材】1. 牛奶2. 凱氏定氮儀3. 電爐4. 消化架5. 錐形瓶100ml（×5）6. 量筒10ml(×1)7. 滴定管（5ml，可讀至0.02ml）8. 凱氏燒瓶（×2）9. 玻璃珠10. 吸耳球11．移液管（2ml，5ml，10ml×1）四、【實(shí)驗(yàn)試劑】1. 牛奶2. 濃硫酸（A.R.）3. 硫酸鉀-硫酸銅混合物：硫酸鉀3份與硫酸銅1份混合研磨成粉末。4. 30%氫氧化鈉溶液：30g氫氧化鈉溶于蒸餾水，稀釋至100ml。5. 2%硼酸溶液：2g硼酸溶于蒸餾水，稀釋至100ml。6. 混合指示劑：0.1%甲基紅乙醇溶液和0.1%甲烯藍(lán)乙醇溶液按體積比4:1混合。7. 0.00963mol/L標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液：用恒沸鹽酸準(zhǔn)確稀釋標(biāo)定。五、【實(shí)驗(yàn)操作】1．樣品的消化將兩個(gè)50mL的凱氏定氮燒瓶編號(hào)（在燒瓶口附近），一只燒瓶?jī)?nèi)加1.0mL蒸餾水，作為空白。另一只燒瓶?jī)?nèi)加入1.0mL樣液（牛奶液）。然后用取樣器各加濃硫酸4mL（取濃硫酸時(shí)勿濺到衣物和皮膚上，也不要灑到實(shí)驗(yàn)桌上），用藥勺加硫酸鉀－硫酸銅混合物約200mg（不必稱重，一點(diǎn)點(diǎn)即可），所有試劑要盡量加到凱氏定氮燒瓶的底部。燒瓶口插上小漏斗（作冷凝用），燒瓶置通風(fēng)櫥內(nèi)的電爐上加熱消化，注意先啟動(dòng)抽風(fēng)機(jī)在消化開始時(shí)，應(yīng)控制火力，不要使沸液沖到瓶頸。待瓶?jī)?nèi)水汽蒸完，硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明藍(lán)綠色為止。消化時(shí)間為2～3h，冷卻，準(zhǔn)備蒸餾。在消化時(shí)可以同時(shí)進(jìn)行第二步。2．定氮儀的洗滌凱氏微量定氮蒸餾裝置1.電爐2.蒸汽發(fā)生燒瓶3.玻璃管4.橡皮管6.反應(yīng)室7.玻璃杯8.氣水分離器9.冷凝管10.錐形瓶11.棒狀玻璃塞12.廢液排出管儀器應(yīng)先經(jīng)一般洗滌，再經(jīng)水蒸氣洗滌。蒸氣發(fā)生器中裝加有H2SO4的蒸餾水和數(shù)粒沸石，加甲基橙指示劑后顯粉紅色。加熱后，產(chǎn)生的蒸汽經(jīng)貯液管、反應(yīng)室至冷凝管，冷凝液體流入接受錐形瓶瓶。每次使用前，需用蒸汽洗滌5分鐘左右（此時(shí)可用一小燒杯承接冷凝水）。將一只盛有5mL2％硼酸液和1~2滴混合指示劑的錐形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液體中，繼續(xù)蒸餾3分鐘，如硼酸液顏色不變，表明儀器已洗凈。若硼酸的顏色變?yōu)榈G色，說明定氮儀內(nèi)有殘留氨，需要進(jìn)一步用蒸汽洗滌。若反應(yīng)室內(nèi)有上次操作剩余的殘夜，可以通過圖1中7向反應(yīng)式加冷的蒸餾水，然后短時(shí)間關(guān)閉4，則殘夜會(huì)倒吸回貯液管，重復(fù)幾次，并用蒸汽洗滌幾分鐘，再用上述方法檢驗(yàn)是否已經(jīng)洗干凈。打開12廢液排出管的夾子可以將廢液放出。3．標(biāo)準(zhǔn)品練習(xí)（標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液，含氮量0.3mg/ml）儀器洗好后，取一100ml錐形瓶，加入5ml硼酸溶液，并使冷凝管下端玻璃管插入硼酸溶液中。取下11（圖1）棒狀玻璃塞，利用2ml移液管準(zhǔn)確向反應(yīng)室加入2ml硫酸銨溶液，然后將玻璃塞放回，向7（圖1）玻璃杯中加入10ml30%NaOH溶液，旋轉(zhuǎn)棒狀玻璃塞，將氫氧化鈉溶液緩慢地放入反應(yīng)室中，并留少量液體作水封。等到錐形瓶?jī)?nèi)的硼酸溶液由紫紅色變?yōu)轷r綠色后開始計(jì)時(shí)，繼續(xù)蒸餾3min,然后移動(dòng)錐形瓶使液面離開冷凝管口約1cm，繼續(xù)蒸餾1min。并用少量蒸餾水洗滌冷凝口外圍，移去錐形瓶。立即用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行滴定，如果用滴定結(jié)果計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨中氮含量接近于0.3mg/ml。則說明整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作正確，可以進(jìn)行下一步。4．樣品測(cè)定儀器洗好后，取一100ml錐形瓶，加入5ml硼酸溶液，并使冷凝管下端玻璃管插入硼酸溶液中。取下11棒狀玻璃塞，利用2ml移液管準(zhǔn)確向反應(yīng)室加入2ml消化好的樣品溶液，然后將玻璃塞放回，向7玻璃杯中加入10ml30%NaOH溶液，旋轉(zhuǎn)棒狀玻璃塞，將氫氧化鈉溶液緩慢地放入反應(yīng)室中，并留少量液體作水封。等到錐形瓶?jī)?nèi)的硼酸溶液由紫紅色變?yōu)轷r綠色后開始計(jì)時(shí)，繼續(xù)蒸餾3min,然后移動(dòng)錐形瓶使液面離開冷凝管口約1cm，繼續(xù)蒸餾1min。并用少量蒸餾水洗滌冷凝口外圍，移去錐形瓶。立即用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行滴定，按上述方法洗滌儀器準(zhǔn)備下一次蒸餾。重復(fù)蒸餾并滴定三次。將2ml消化好的樣品溶液改為2ml消化后的空白對(duì)照溶液，其他操作同上，測(cè)量三組。三組空白測(cè)量中，若錐形瓶中的硼酸溶液不變色，則無需滴定。六、【注意事項(xiàng)】1．凱氏法的優(yōu)點(diǎn)是適用范圍廣，可用于動(dòng)植物的各種組織，器官及食品等成組復(fù)雜樣品的測(cè)定，只要細(xì)心操作都能得到精確的結(jié)果。其缺點(diǎn)是操作比較復(fù)雜，含有大量堿性氨基酸的蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果偏高。2．普通實(shí)驗(yàn)室中的空氣中常含有少量的氨，會(huì)影響結(jié)果，所以操作應(yīng)在單獨(dú)潔凈的房間中進(jìn)行，并盡可能快地對(duì)硼酸吸收液進(jìn)行滴定。3．定氮儀各連接處應(yīng)使玻璃對(duì)玻璃外套橡皮管絕對(duì)不能漏氣。蒸餾時(shí)需控制火力以避免樣液倒吸。4．消化時(shí)，若樣品含糖高或含脂及較多時(shí)，注意控制加熱溫度，以免大量泡沫噴出凱氏燒瓶，造成樣品損失?？杉尤肷倭啃链蓟蛞后w石蠟，或硅消泡劑減少泡沫產(chǎn)生。5．消化時(shí)應(yīng)注意旋轉(zhuǎn)凱氏燒瓶，將附在瓶壁上的碳粒沖下，對(duì)樣品徹底消化。若樣品不易消化至澄清透明，可將凱氏燒瓶中溶液冷卻，加入數(shù)滴過氧化氫后，再繼續(xù)加熱消化至完全。6．蒸餾時(shí)，加入的氫氧化鈉溶液除與硫酸銨作用外，還與消化液中的硫酸和硫酸銅作用。若加入的氫氧化鈉不夠，則溶液呈藍(lán)色，不生成褐色的氫氧化銅沉淀。所以，加入的氫氧化鈉必須過量，并且動(dòng)作還要迅速，以防止氨的流失。7．蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的水裝至2/3體積并且保持酸性（在蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的水中加入稀硫酸，使之呈酸性，內(nèi)加甲基橙指示劑數(shù)滴，水應(yīng)呈橙紅色，如變黃時(shí)，應(yīng)該補(bǔ)加酸），以防止在堿性條件水中游離氨蒸出，使結(jié)果偏大。8．因蒸餾時(shí)反應(yīng)至外層的氣壓大于反應(yīng)室內(nèi)的壓力，而反應(yīng)室的壓力大于大氣壓力，故可將氨帶出。所以，蒸餾時(shí)，蒸氣要均勻、充足，蒸餾中不得?；饠鄽?，否則，會(huì)發(fā)生倒吸。停止蒸餾時(shí)，由于反應(yīng)室外層的壓力突然降低，可使液體倒吸入反應(yīng)室外層，所以，操作時(shí)，應(yīng)先將冷凝管下端提高液面并清洗管口，再蒸1min后關(guān)掉熱源。七、【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】1．結(jié)果表一各組實(shí)驗(yàn)消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸體積（ml）123平均標(biāo)準(zhǔn)品練習(xí)4.40空白10.090.130.110.11樣品32.752.922.862.84C(A-B)C(A-B)×14.008×100Vm=式中m：樣品中的含氮的質(zhì)量，即100ml樣品中含氮量（mg）A：滴定樣品消耗的HCl溶液體積（ml）B：滴定空白消耗的HCl溶液體積（ml）V：相當(dāng)于未稀釋樣品的體積（ml）c：鹽酸物質(zhì)的量濃度（mol/L）14.008：每摩爾氮原子質(zhì)量（g/mol）100：100ml樣品0.00963×0.00963×4.40×14.008×10021.標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨中的N含量：m==0.297mg該結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值的相對(duì)誤差=（0.297—0.3）/0.3×100％=1％，這表示我們整個(gè)的實(shí)驗(yàn)操作正確。0.00963×（2.840.00963×（2.84—0.11）×14.008×1002=18.41mg3．若樣品中含氮物均為蛋白質(zhì)，則蛋清樣品中蛋白質(zhì)的含量為：18.41×6.25=115.063mg八、【實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析】1．在測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨中含氮量時(shí)，我們測(cè)得的結(jié)果為0.297mg/ml，而標(biāo)準(zhǔn)值為0.3mg/ml,相對(duì)誤差為1%，這說明我們組的實(shí)驗(yàn)儀器狀態(tài)良好，而且操作也是正確規(guī)范的。2．在測(cè)定樣品中氮含量時(shí)，我們的測(cè)定結(jié)果為18.41mgN/ml,而且三組測(cè)量數(shù)據(jù)的相對(duì)偏差分別為2.55%，2.23%，0.76%，可見相互之間偏差很小，即實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性較高。由此推出實(shí)驗(yàn)室提供樣品含氮量也應(yīng)該在18.41mgN/ml左右。九、【實(shí)驗(yàn)思考】（一）本實(shí)驗(yàn)中所用各種試劑的作用。1．濃硫酸：氧化劑，分解蛋白質(zhì)成氨氣和其他成分。2．粉末硫酸鉀-硫酸銅混合物（K2SO4:CuSO4·5H2O=3:1）：充當(dāng)催化劑，硫酸鉀可以提高消化液的沸點(diǎn)，硫酸銅作為催化反應(yīng)的主要成分。3．30%NaOH溶液：堿化消化液，使硫酸銨分解釋放出氨氣，用于后續(xù)的滴定顏色反應(yīng)。4．0.010mol/L鹽酸：滴定蒸餾液，定量分析。（二）凱氏定氮法測(cè)定樣品蛋白質(zhì)含量時(shí)誤差的主要來源以及應(yīng)注意的事項(xiàng)。凱氏定氮儀測(cè)定蛋白質(zhì)含量的誤差來源可能是樣品、催化劑種類和用量、消化的時(shí)間、加堿液后的操作、蒸餾加熱、清洗凱氏定氮儀的過程、凱氏定氮儀的氣密性、氨氣是否完全蒸餾出來；硼酸是否封住蒸餾管口、試劑的準(zhǔn)確性、滴定終點(diǎn)的判斷、滴定鹽酸的濃度準(zhǔn)確性等。注意事項(xiàng)：樣品的取用量應(yīng)適中，以免影響后續(xù)反應(yīng)。