備課素材：線粒體自噬的機(jī)理 高一上學(xué)期生物人教版必修1

線粒體自噬的機(jī)理先看一道試題：細(xì)胞內(nèi)受損后的線粒體釋放的信號(hào)蛋白，會(huì)引發(fā)細(xì)胞非正常死亡．如圖表示細(xì)胞通過“自噬作用”及時(shí)清除受損線粒體及其釋放的信號(hào)蛋白的過程，請(qǐng)據(jù)圖回答：

（1）吞噬泡的吞噬過程體現(xiàn)了生物膜在結(jié)構(gòu)上具有

的特點(diǎn)．圖中自噬體由層磷脂分子構(gòu)成（不考慮自噬體內(nèi)的線粒體）．（2）受損線粒體的功能逐漸退化，會(huì)直接影響有氧呼吸的第階段．細(xì)胞及時(shí)清除受損的線粒體及信號(hào)蛋白的意義是．（3）（3）研究發(fā)現(xiàn)人體細(xì)胞溶酶體內(nèi)的pH在5.0左右，由此可知細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的H+進(jìn)入溶酶體的運(yùn)輸方式是．（4）圖中水解酶的合成場(chǎng)所是．自噬體內(nèi)的物質(zhì)被水解后，其產(chǎn)物的去向是．由此推測(cè)，當(dāng)細(xì)胞養(yǎng)分不足時(shí)，細(xì)胞“自噬作用”會(huì)（增強(qiáng)/減弱/不變）．解析：閱讀題干和題圖可知，本題以線粒體的“自噬作用”為材料考查溶酶體在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的過程中所起的作用，先分析題圖了解線粒體“自噬作用”的過程和涉及的相關(guān)知識(shí)，然后結(jié)合問題的具體要求綜合解答．由題圖可知，吞噬泡的吞噬過程存在膜的變化，體現(xiàn)了生物膜在結(jié)構(gòu)上具有一定的流動(dòng)性；圖中自噬體是兩層膜包裹著線粒體，若不考慮自噬體內(nèi)的線粒體，自噬體由4層磷脂分子組成．（2）線粒體是有氧呼吸的主要場(chǎng)所，在線粒體中進(jìn)行有氧呼吸的第二、三階段，所以受損線粒體的功能逐漸退化，會(huì)直接影響有氧呼吸的第二、三階段；由題意可知，細(xì)胞內(nèi)受損后的線粒體釋放的信號(hào)蛋白，會(huì)引發(fā)細(xì)胞非正常死亡，細(xì)胞及時(shí)清除受損的線粒體及信號(hào)蛋白的意義是維持細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，避免細(xì)胞非正常死亡．（3）由題意可知，H+從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)進(jìn)入溶酶體是逆濃度梯度運(yùn)輸，因此屬于主動(dòng)運(yùn)輸．（4）水解酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所是核糖體，自噬體內(nèi)的物質(zhì)被水解后，形成產(chǎn)物的對(duì)細(xì)胞有用的物質(zhì)又被細(xì)胞利用，對(duì)細(xì)胞無用甚至有害的物質(zhì)被排出細(xì)胞外；當(dāng)細(xì)胞養(yǎng)分不足時(shí)，細(xì)胞“自噬作用”會(huì)增強(qiáng)，以為細(xì)胞提供更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)．答案：（1）流動(dòng)性

4（2）二、三

避免細(xì)胞非正常死亡（維持細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定）（3）主動(dòng)運(yùn)輸（4）核糖體

排出細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)利用

增強(qiáng)這道試題以線粒體與細(xì)胞“自噬作用”為素材考查細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。那么，線粒體與細(xì)胞“自噬作用”的機(jī)理是怎樣的？線粒體通過氧化磷酸化以ATP的形式產(chǎn)生能量。由于氧化磷酸化的缺陷會(huì)產(chǎn)生有害的活性氧，因此通過一種稱為線粒體自噬的選擇性自噬形式有效去除受損的線粒體是很重要的。由于細(xì)胞生物學(xué)、結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法的結(jié)合，我們開始了解泛素依賴性信號(hào)標(biāo)記受損線粒體進(jìn)行線粒體自噬的機(jī)制。這篇綜述討論了通過PTEN誘導(dǎo)的推定激酶1（PINK1）和E3泛素蛋白連接酶parkin促進(jìn)泛素與受損線粒體結(jié)合的生化步驟和調(diào)節(jié)機(jī)制，以及泛素鏈如何促進(jìn)自噬體捕獲。最近發(fā)現(xiàn)的parkin和PINK1在抑制線粒體抗原呈遞中的作用為該途徑如何促進(jìn)神經(jīng)元存活提供了替代模型。對(duì)這些過程的更深入理解對(duì)神經(jīng)退行性疾病有重要意義，包括帕金森病，在帕金森病中，線粒體自噬和其他形式的選擇性自噬缺陷突出。

Figure1.Parkin依賴的線粒體自噬概況

線粒體在細(xì)胞和生物體的生活中發(fā)揮著核心作用，通過氧化磷酸化以ATP的形式作為能量產(chǎn)生中心，并通過組織代謝機(jī)制，如檸檬酸循環(huán)，驅(qū)動(dòng)許多細(xì)胞功能。線粒體的空間組織是其功能的關(guān)鍵，其中氧化磷酸化通過線粒體內(nèi)膜中的呼吸鏈發(fā)生，其他代謝反應(yīng)在線粒體基質(zhì)中組織。線粒體蛋白質(zhì)由細(xì)胞核和線粒體基因組編碼，需要通過線粒體外膜和內(nèi)膜精確協(xié)調(diào)蛋白質(zhì)輸入，折疊和組裝成蛋白質(zhì)復(fù)合物，最終形成功能性的空間組織細(xì)胞器。這些過程中的錯(cuò)誤會(huì)導(dǎo)致線粒體受損，對(duì)細(xì)胞生理學(xué)有害。例如，呼吸鏈功能的缺陷會(huì)促進(jìn)破壞性活性氧的產(chǎn)生和對(duì)線粒體功能至關(guān)重要的膜電位的喪失。此外，基質(zhì)中蛋白質(zhì)折疊的缺陷促進(jìn)線粒體未折疊蛋白反應(yīng)（mitochondrialunfoldedproteinresponse，mtUPR），后者控制線粒體基質(zhì)中的蛋白質(zhì)合成和線粒體伴侶蛋白的產(chǎn)生。盡管當(dāng)損傷比較短暫時(shí)，mtUPR等穩(wěn)態(tài)機(jī)制可能足以修復(fù)線粒體，但長(zhǎng)期或不可修復(fù)的損傷可以通過線粒體自噬過程導(dǎo)致線粒體的消除。線粒體自噬是一種選擇性自噬形式，在此過程中，線粒體被聚泛素鏈修飾，被自噬體吞噬，并在溶酶體融合后降解（Figure1）。線粒體自噬最初是在培養(yǎng)細(xì)胞的電子顯微照片中觀察到的，過去二十年的工作揭示了線粒體通過泛素依賴和泛素非依賴途徑靶向自噬系統(tǒng)的基本生化步驟。作者對(duì)泛素依賴性線粒體自噬的理解主要是通過分析兩個(gè)在家族性帕金森病中被發(fā)現(xiàn)突變的基因來推動(dòng)的——E3泛素蛋白連接酶parkin（PRKN）及其活化激酶PTEN誘導(dǎo)的推定激酶1（PTEN-inducedputativekinase1，PINK1），該激酶存在于受損的線粒體上。對(duì)黑腹果蠅的早期研究揭示了PINK1在parkin上游發(fā)揮作用的遺傳學(xué)途徑，parkin的過度表達(dá)可以繞過PINK1的缺陷?，F(xiàn)在知道，這些蛋白質(zhì)以一種共同的途徑運(yùn)作，催化線粒體外膜（mitochondrialoutermembrane，MOM）蛋白上泛素鏈的組裝。這些泛素鏈結(jié)合自噬貨物受體，如視神經(jīng)磷酸酶（optineurin，OPTN）和螯合體1（sequestosome1，SQSTM1，也稱為p62），它們與一般的自噬機(jī)制協(xié)同作用，捕獲自噬體雙膜中受損的線粒體（Figure1）。與溶酶體融合并通過溶酶體水解酶促進(jìn)線粒體的降解。最近發(fā)現(xiàn)，OPTN和SQSTM1，以及它們相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶TBK1，在基因上與肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophiclateralsclerosis，ALS）的散發(fā)和家族形式有關(guān)。這種遺傳聯(lián)系有兩個(gè)主要含義：第一，它表明選擇性形式的自噬是特定形式ALS的基礎(chǔ)，第二，它表明了解標(biāo)記自噬貨物（包括線粒體）連同泛素及其被貨物受體捕獲的生化機(jī)制，可能為神經(jīng)退行性疾病的治療干預(yù)開辟新的途徑。除了這些對(duì)疾病的影響外，最近的研究表明，某些形式的parkin介導(dǎo)的線粒體自噬清除了明顯健康的線粒體，這對(duì)幾個(gè)生理過程很重要，例如血管生成素1受體（TIE2）陽性造血干細(xì)胞的自我更新，以及受精過程中父親的線粒體清除（BOX1）。此外，parkin與結(jié)核分枝桿菌的異種吞噬清除有關(guān)，這可能與線粒體自噬相似，但其潛在機(jī)制尚不清楚。在這篇綜述中，作者重點(diǎn)關(guān)注驅(qū)動(dòng)泛素鏈在受損線粒體上組裝的生化機(jī)制，以及泛素化是如何被自噬機(jī)制解碼以捕獲受損細(xì)胞器的。鑒于線粒體不斷參與融合-分裂循環(huán)，可能會(huì)混合健康和受損的細(xì)胞器，線粒體自噬途徑在選擇性標(biāo)記和降解受損細(xì)胞器的能力方面快速而穩(wěn)健是很重要的。這種選擇性是通過使用兩個(gè)不同的、順序的前饋環(huán)來實(shí)現(xiàn)的，這兩個(gè)前饋環(huán)由線粒體表面的激酶PINK1和泛素ubiquitin驅(qū)動(dòng)，預(yù)計(jì)它們會(huì)產(chǎn)生開關(guān)樣行為，僅用于檢測(cè)和捕獲受損的細(xì)胞器。作者描述了泛素依賴形式的線粒體自噬的可推廣框架，并討論了對(duì)這些關(guān)鍵途徑的理解中存在的實(shí)質(zhì)性差距。發(fā)育過程中的線粒體自噬和通過parkin非依賴機(jī)制人們?cè)絹碓秸J(rèn)識(shí)到，除了去除有缺陷的線粒體外，在發(fā)育和正常生理過程中發(fā)生的特定細(xì)胞轉(zhuǎn)變過程中，線粒體豐度的大幅改變也是必要的（見下圖）。在秀麗隱桿線蟲、黑腹果蠅和脊椎動(dòng)物的受精過程中，父系線粒體DNA的丟失是通過線粒體自噬過程發(fā)生的。在小鼠中，E3泛素蛋白連接酶parkin和線粒體泛素連接酶激活因子NFKB1（mitochondrialubiquitinligaseactivatorofNFKB

1，MUL1）與螯合體1（sequestosome1，SQSTM1）和PTEN誘導(dǎo)的推定激酶1（PTEN-inducedputativekinase1，PINK1）聯(lián)合發(fā)揮冗余功能，表明在這種情況下使用了已建立的PINK1-parkin途徑的一些元素。相比之下，黑腹果蠅的類似過程需要自噬機(jī)制和SQSTM1，但不需要parkin直系同源物。為了在網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟過程中去除線粒體，捕獲線粒體的自噬體組裝由位于線粒體外膜（MOM）上的一種名為BCL2/腺病毒E1B19kDa蛋白相互作用蛋白3樣（BCL2/adenovirusE1B19kDaprotein-interacting

protein3like，NIX；也稱為BNIP3L）的自噬受體協(xié)調(diào)，含有用于與ATG8蛋白相關(guān)的LC3相互作用區(qū)（LC3interactingregion，LIR）基序，是線粒體有效清除所必需的。最近的數(shù)據(jù)表明，LIR基序附近NIX的磷酸化增加了與ATG8的結(jié)合，并增加了線粒體的自噬體募集。其他含有LIR基序的MOM蛋白，包括肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶FKBP8和含有FUN14結(jié)構(gòu)域的蛋白1（FUN14domain-containingprotein1，F(xiàn)UNDC1），與ATG8蛋白的直接相互作用有關(guān)，以促進(jìn)線粒體自噬。在缺乏parkin的情況下，F(xiàn)KBP8和ATG8蛋白LC3A的過表達(dá)可以促進(jìn)線粒體自噬，盡管這種形式的線粒體自噬的生理環(huán)境尚不清楚。類似地，F(xiàn)UNDC1的過表達(dá)可以通過E3泛素蛋白連接酶MARCH5調(diào)節(jié)的方式促進(jìn)對(duì)缺氧的線粒體自噬。了解ATG8募集用于促進(jìn)直接線粒體自噬的生理環(huán)境仍然是未來研究的目標(biāo)。

PINK1-parkin通路綜述普遍認(rèn)為，線粒體上泛素鏈的組裝對(duì)于這種自噬機(jī)制的補(bǔ)充和線粒體自噬清除受損的線粒體是必要的。在最簡(jiǎn)單的形式中，泛素鏈組裝途徑可以描述為包含三個(gè)積極作用的元件：線粒體損傷傳感器（PINK1）、信號(hào)放大器（parkin）和信號(hào)效應(yīng)器（泛素鏈），其決定哪些線粒體應(yīng)該被自噬機(jī)制捕獲（Figure1）。PINK1包含一個(gè)N末端線粒體靶向序列，并與外膜轉(zhuǎn)位酶（translocaseoftheoutermembrane，TOM）復(fù)合物結(jié)合。當(dāng)PINK1的線粒體靶向序列和跨膜片段到達(dá)內(nèi)膜轉(zhuǎn)位酶（translocaseoftheinnermembrane，TIM）復(fù)合物并橫向轉(zhuǎn)移到內(nèi)膜時(shí)，跨膜片段被內(nèi)膜定位蛋白酶PARL（早老素相關(guān)菱形樣蛋白，presenilins-associatedrhomboid-likeprotein，線粒體）蛋白水解切割。切割產(chǎn)生含有激酶結(jié)構(gòu)域的52kDa蛋白質(zhì)片段，該激酶結(jié)構(gòu)域可能仍與TOM復(fù)合物相關(guān)聯(lián)。當(dāng)線粒體健康時(shí)，這一52kDa的PINK1片段被釋放到胞質(zhì)溶膠中，并被N端規(guī)則泛素連接酶（Nendruleubiquitinligase）快速泛素化，該連接酶將其靶向蛋白酶體降解。因此，在具有健康線粒體的細(xì)胞中PINK1水平較低。然而，當(dāng)線粒體受損時(shí)，PINK1易位和加工被阻斷，導(dǎo)致活性PINK1在MOM上積累，它可以通過多步前饋機(jī)制激活parkin的E3泛素連接酶活性，詳見后面所述。組裝在MOM上的parkin依賴性泛素鏈隨即促進(jìn)泛素結(jié)合線粒體自噬受體的募集，以促進(jìn)自噬體的捕獲（Figure1）。與大多數(shù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑一樣，負(fù)調(diào)節(jié)因子有助于確保損傷信號(hào)足夠強(qiáng)，從而使健康的線粒體不會(huì)被不適當(dāng)?shù)亟到?。在這種線粒體自噬途徑中，去泛素化酶（deubiquitinatingenzymes，DUBs），包括線粒體定位的泛素羧基末端水解酶30（ubiquitincarboxyl-terminalhydrolase30，USP30），似乎通過從線粒體中去除泛素鏈來拮抗該途徑，直到parkin激活足以超過USP30對(duì)泛素鏈的去除。闡明決定parkin激活狀態(tài)的生化機(jī)制一直是該研究領(lǐng)域的主要焦點(diǎn)。

PINK1激活parkin的機(jī)制在線粒體健康的細(xì)胞中，parkin以自身抑制的形式廣泛定位在細(xì)胞質(zhì)中。然而，在線粒體損傷和PINK1在MOM上穩(wěn)定后，parkin可以經(jīng)歷PINK1引發(fā)的一系列修飾（包括磷酸化、多種構(gòu)象變化以及與Ser65磷酸化泛素（Ser65phosphorylatedubiquitin，pSer65Ub）的結(jié)合），促進(jìn)其與MOM的穩(wěn)定結(jié)合及其E3泛素連接酶活性的激活。為了簡(jiǎn)單起見，分別描述了parkin激活的兩個(gè)主要步驟——通過parkin-泛素樣（parkinubiquitinlike，UBL）結(jié)構(gòu)域磷酸化的直接激活和通過與pSer65-Ub結(jié)合的激活——然后描述了這些事件如何在MOM上協(xié)同作用，以產(chǎn)生促進(jìn)線粒體自噬的前饋泛素化過程。應(yīng)該注意的是，在下文描述的許多研究中，實(shí)驗(yàn)方法是在模型細(xì)胞系統(tǒng)中過表達(dá)parkin或PINK1，考慮到反饋回路的參與，這可能具有未知的影響，并且結(jié)果可能更難解釋。

Figure2.parkin和pSer65Ub的結(jié)構(gòu)解剖

通過PINK1依賴性UBL磷酸化激活內(nèi)在的parkin。泛素系統(tǒng)采用了一系列泛素裝載和轉(zhuǎn)移事件，最終導(dǎo)致泛素的C端Gly76殘基轉(zhuǎn)移到底物上的賴氨酸殘基（初級(jí)泛素化），或泛素本身的賴氨酸殘基以延伸泛素鏈。泛素在ATP存在下被E1泛素激活酶激活，并轉(zhuǎn)移到幾種E2泛素綴合酶之一的活性位點(diǎn)的半胱氨酸殘基上以形成硫酯鍵。這種E2酶與E3泛素連接酶中的RINGfinger或HECT結(jié)構(gòu)域相互作用，以促進(jìn)泛素向底物的轉(zhuǎn)移。Parkin是RING-between-RING（RBR）E3泛素連接酶；它包含N末端UBL結(jié)構(gòu)域、結(jié)合E2酶的中心RING1結(jié)構(gòu)域、一個(gè)inbetweenRING

（IBR）結(jié)構(gòu)域和含有催化半胱氨酸殘基的C末端RING2結(jié)構(gòu)域（Figure2a）。RBRE3s類似于含有HECT結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，利用其RING1結(jié)構(gòu)域催化泛素從帶電的E2酶轉(zhuǎn)移到RING2中的催化半胱氨酸殘基。與HECTE3s一樣，這種泛素硫酯隨后被釋放到底物賴氨酸殘基上（Figure

2a，左圖）。三種機(jī)制涉及parkin自動(dòng)抑制，必須克服它們才能將parkin轉(zhuǎn)化為活性酶（Figure2a，右圖）。首先，parkin的UBL結(jié)構(gòu)域靠在RING1內(nèi)的兩個(gè)核心α螺旋元件之一上，阻斷E2的進(jìn)入（Figure2b）。第二，抑制性（repressive，REP）元件與UBL域和RING1二者對(duì)接，進(jìn)一步阻止E2接入（Figure2b）。第三，RING2中的催化Cys431殘基被位于UBL結(jié)構(gòu)域和RING1之間的獨(dú)特的parkin結(jié)構(gòu)域（uniqueparkindomain，UPD；也稱為RING0）屏蔽，從而阻斷泛素從帶電荷的E2轉(zhuǎn)移到parkin的催化半胱氨酸殘基（Figure2b）。因此，多重構(gòu)象變化是必要的，以消除這些自動(dòng)抑制的限制。自從發(fā)現(xiàn)PINK1在parkin上游發(fā)揮作用以來，人們一直致力于了解PINK1如何直接調(diào)節(jié)parkin活性。一項(xiàng)早期研究發(fā)現(xiàn)，PINK1磷酸化了人SHSY5Y細(xì)胞中的parkin，并且PINK1依賴性磷酸化促進(jìn)了parkin形成Lys63連接的泛素鏈的能力。然而，parkin的磷酸化位點(diǎn)及其激活機(jī)制尚未報(bào)道。對(duì)parkin激活的關(guān)鍵見解來自于PINK1磷酸化parkin的UBL結(jié)構(gòu)域中的Ser65，并且在Ser65處的parkin磷酸化（pSer65-parkin）促進(jìn)體外parkin的泛素鏈組裝。隨后的研究使用Ser65化學(xué)計(jì)量磷酸化的parkin，結(jié)合質(zhì)譜法對(duì)泛素鏈形成的定量測(cè)量，表明pSer65-parkin在體外將鏈組裝活性提高了約2400倍。因此，parkin在其UBL結(jié)構(gòu)域上的磷酸化顯著激活了其內(nèi)在的泛素連接酶活性。Ser65處的UBL結(jié)構(gòu)域磷酸化破壞了UBL–RING1相互作用，并被認(rèn)為允許UBL結(jié)構(gòu)域通過其系鏈移動(dòng)到UPD

（Figure

2b–d）。有趣的是，UBL結(jié)構(gòu)域的釋放是由parkin

（Trp403Ala）的突變模擬的，該突變被認(rèn)為從RING1部分釋放REP元件以促進(jìn)E2的結(jié)合（Figure2b–d）。該模型與分子動(dòng)力學(xué)模擬一致，分子動(dòng)力學(xué)模擬表明，UBL磷酸化從其與RING1的緊密相互作用中釋放出UBL結(jié)構(gòu)域，并導(dǎo)致REP元件構(gòu)象的微小變化，為帶電的E2進(jìn)入RING1提供了途徑。從parkin核心釋放UBL結(jié)構(gòu)域提供了已知對(duì)PINK1磷酸化重要的UBL結(jié)構(gòu)域的疏水性Ile44殘基的通路，這在一定程度上解釋了在磷酸化之前釋放UBL域的需要。隨后的結(jié)構(gòu)改變傳播到RING2結(jié)構(gòu)域，如催化Cys431殘基的反應(yīng)性增加所示（BOX2）。

PINK1磷酸化泛素可促進(jìn)parkin活化和線粒體保留。當(dāng)發(fā)現(xiàn)泛素和泛素鏈?zhǔn)荘INK1底物，并且pSer65-Ub鏈與線粒體上的parkin激活和保留有關(guān)時(shí)，確定了PINK1對(duì)受損線粒體的第二種作用模式。parkin的UBL結(jié)構(gòu)域在氨基酸序列上與泛素約有30%相同（約50%相似），包括含有Ile44的表面的基本保守性，其接近Ser65（Figure2e，f）。重要的是，發(fā)現(xiàn)parkinUBL結(jié)構(gòu)域中的Ser65在泛素中是保守的，這導(dǎo)致PINK1可以直接磷酸化Ser65上的泛素。線粒體自噬誘導(dǎo)過程中的定量磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)、候選PINK1底物的無偏鑒定以及泛素存在下PINK1對(duì)parkin的生物化學(xué)激活研究也都分別將泛素鑒定為PINK1靶標(biāo)。初步的生化研究表明，單體pSer65-Ub不僅與parkin物理結(jié)合，而且可以部分激活其泛素鏈組裝活性，而不依賴于parkin上的Ser65磷酸化。盡管體內(nèi)parkin似乎以線粒體上泛素鏈的形式與pSer65-Ub結(jié)合（如下所述），但單體pSer65-Ub已成為理解parkin在MOM上激活和保留的生化和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的有用工具。pSer65-Ub可以在體外與未磷酸化的parkin和pSer65-parkin結(jié)合，但與pSer65-parkin的結(jié)合強(qiáng)度增強(qiáng)約為20倍。此外，雖然pSer65Ub與未磷酸化的parkin的化學(xué)計(jì)量結(jié)合激活鏈合成約1000倍，但pSer65‐parkin和pSer65?Ub的復(fù)合物顯示出比未磷酸化parkin高約4400倍的鏈合成活性。最近，對(duì)通過納米體穩(wěn)定的PINK1-泛素復(fù)合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，深入了解了PINK1如何特異性識(shí)別泛素。PINK1在蛋白激酶中是獨(dú)特的，因?yàn)樗腘端葉包含三段氨基酸序列，稱為插入，這是其他蛋白激酶所沒有的。該結(jié)構(gòu)表明，這些插入物通過PINK1中Ser202和Ser204的自動(dòng)磷酸化而穩(wěn)定，從而產(chǎn)生嵌合體物3的獨(dú)特構(gòu)象，從而能夠識(shí)別泛素作為底物。此外，泛素在與PINK1結(jié)合時(shí)處于獨(dú)特的C末端收縮構(gòu)象（泛素-CR），這將其Ser65殘基置于PINK1催化中心附近的延伸環(huán)中。泛素-CR構(gòu)象被認(rèn)為是pSer65-Ub54所特有的，但最近有報(bào)道稱，在未修飾的泛素中發(fā)現(xiàn)了低豐度的泛素-CR，并與泛素的傳統(tǒng)構(gòu)象快速交換。缺乏嵌合體3的PINK1的結(jié)構(gòu)最近也被描述。這些研究解釋了PINK1的關(guān)鍵特征，包括為什么PINK1對(duì)泛素和parkin-UBL結(jié)構(gòu)域作為底物具有高度選擇性，以及在帕金森病患者中發(fā)現(xiàn)的PINK1突變中有多少破壞了催化活性或底物識(shí)別。結(jié)構(gòu)和功能研究表明，通過在parkin內(nèi)實(shí)現(xiàn)重要接觸，pSer65-Ub促進(jìn)連接RING1和IBR結(jié)構(gòu)域的中心α螺旋（H3）的形成（Figure2a，d），從而從parkin核心釋放UBL結(jié)構(gòu)域（Figure2d）。parkin–pSer65-Ub共復(fù)合物中的關(guān)鍵是parkin中的一簇帶正電荷的殘基（Lys151和His302），它們與pSer65-Ub中的磷酸鹽結(jié)合，其突變消除了與pSer65-Ub的結(jié)合以及pSer65-Ub在體外激活parkin。pSer65-Ub與UBL結(jié)構(gòu)域連接子缺失59個(gè)殘基的parkin形式結(jié)合的晶體學(xué)分析（Figure2a）導(dǎo)致了涉及parkin二聚體的活化的替代模型，其中pSer65-Ub結(jié)合打開IBR結(jié)構(gòu)域上的表面，然后與帶電荷的泛素~E2硫酯的供體泛素相互作用（其中~表示硫酯鍵），E2本身與相鄰的parkin分子的RING1結(jié)合。這一模型得到了以下發(fā)現(xiàn)的支持，即IBR殘基中被預(yù)測(cè)與供體泛素直接相互作用的突變?cè)隗w外減少了parkin的鏈合成，盡管這些突變體沒有在體內(nèi)進(jìn)行測(cè)試。對(duì)活性全長(zhǎng)pSer65-parkin與pSer65-Ub復(fù)合物的生物物理分析揭示了單體1:1復(fù)合物。雖然可以想象，在催化過程中，pSer65-parkin二聚體會(huì)短暫組裝，但pSer65-parkin中的UBL結(jié)構(gòu)域似乎無法促進(jìn)二聚體的形成，至少在不存在用于生物物理測(cè)量的帶電UBCH7的情況下是如此。生物物理和分子動(dòng)力學(xué)測(cè)量也表明，缺乏UBL結(jié)構(gòu)域的parkin與泛素~E2的結(jié)合觸發(fā)了RING2結(jié)構(gòu)域向RING1的大規(guī)模擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，從而促進(jìn)泛素轉(zhuǎn)移到位于RING2中的Cys431。需要分析處于轉(zhuǎn)移前狀態(tài)和含有泛素荷電的RING2狀態(tài)的全長(zhǎng)pSer65-parkin–pSer65-Ub–泛素~E2–底物復(fù)合物，以確認(rèn)這些模型中哪一個(gè)是正確的。同樣值得注意的是，涉及變構(gòu)UBL結(jié)構(gòu)域的激活機(jī)制已被描述用于其他RBRE3，暗示了RBRE3的激活機(jī)制的保守元件。

線粒體表面泛素化在線粒體損傷的幾分鐘內(nèi)，parkin在MOM上被募集和激活，并啟動(dòng)局部底物的泛素化。許多工作都集中在識(shí)別響應(yīng)線粒體損傷的parkin底物上。早期研究確定了幾種不同功能的靶標(biāo)，包括線粒體融合蛋白1（mitofusin1，MFN1）、MFN2、電壓依賴性陰離子選擇通道（voltage-dependentanion-selectivechannel，VDAC）蛋白、線粒體分裂1蛋白（fission1protein，F(xiàn)IS1）、線粒體導(dǎo)入受體亞基TOM20同源物（mitochondrialimportreceptorsubunitTOM20homologue，TOMM20）和CDGSH鐵硫結(jié)構(gòu)域含蛋白1（CDGSHiron-sulfurdomain-containingprotein1，CISD1），它們都位于MOM上。為了鑒定parkin靶點(diǎn)和初級(jí)泛素化位點(diǎn)，進(jìn)行了線粒體去極化后的定量diGLY捕獲蛋白質(zhì)組學(xué)。在許多MOM蛋白的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域上以及在響應(yīng)parkin激活而被募集到線粒體的幾種細(xì)胞質(zhì)蛋白上發(fā)現(xiàn)了泛素化位點(diǎn)（見下文）。在過表達(dá)parkin的HeLa細(xì)胞中，線粒體的泛素化分為兩個(gè)階段：初始階段（前兩小時(shí)），在此期間主要底物是MOM蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，然后是第二階段，在此期間，定位在線粒體內(nèi)的一組蛋白成為泛素化的靶點(diǎn)。在存在過表達(dá)的parkin的情況下，線粒體去極化可導(dǎo)致MOM斷裂，從而可能使內(nèi)膜蛋白暴露于parkin或其他E3的作用下。然而，目前尚不清楚MOM斷裂是否發(fā)生在神經(jīng)元的內(nèi)源性parkin水平，以及它是否在線粒體自噬中發(fā)揮特定作用。MOM上parkin底物的多樣性和parkin內(nèi)缺乏明顯的底物識(shí)別元件表明parkin缺乏固有的底物特異性。因此，MOM上底物的身份可能不如組裝在指定線粒體自噬底物上的泛素鏈的密度重要。事實(shí)上，如下所述，線粒體自噬受體具有與線粒體上特定類型的泛素鏈結(jié)合的能力。泛素鏈可以通過泛素上七個(gè)賴氨酸殘基（Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48和Lys63）中每一個(gè)的ε-氨基以及其N末端甲硫氨酸殘基的α-氨基組裝，并且鏈可以是直鏈、支鏈或混合的。不同類型的鏈連接可以通過特定的泛素結(jié)合域（ubiquitinbindingdomains，UBDs）來區(qū)分，例如在線粒體自噬受體中發(fā)現(xiàn)的那些。我們現(xiàn)在知道，在內(nèi)源性泛素背景下過表達(dá)parkin的細(xì)胞中，線粒體去極化導(dǎo)致MOM上形成Lys6、Lys11、Lys48和Lys63鏈連接，并且parkin可以在體外催化這些相同連接的形成，但尚不清楚這些鏈?zhǔn)侨绾畏植荚诓煌木€粒體底物上的，在每種類型的底物上構(gòu)建的鏈有多長(zhǎng)，或者可能存在具有混合或支鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的鏈的程度。雖然與單泛素化相反，多泛素化被認(rèn)為對(duì)線粒體自噬受體的募集至關(guān)重要，但單泛素化也可能通過作為PINK1磷酸化的靶標(biāo)而發(fā)揮重要作用。

Figure3.

線粒體去極化反應(yīng)中parkin活化的前饋機(jī)制

線粒體上parkin活化的模型上述泛素和parkin磷酸化的機(jī)制導(dǎo)致了一種模型，其中線粒體損傷促進(jìn)了快速的泛素鏈聚合，這是兩種平行作用的機(jī)制的結(jié)果，這兩種機(jī)制共同產(chǎn)生了正反饋回路（Figure3）。一方面，由于PINK1磷酸化預(yù)先存在的泛素分子或由parkin構(gòu)建的鏈，pSer65-Ub在線粒體上的積累通過與pSer65-Ub的直接相互作用促進(jìn)了胞漿未磷酸化的parkin的募集（Figure3Ba）。HeLa細(xì)胞中受損線粒體上多達(dá)20%的泛素分子在存在催化活性parkin的情況下，在線粒體去極化時(shí)以PINK1依賴的方式被磷酸化。parkin–pSer65-Ub相互作用有兩個(gè)主要后果：它部分激活parkin的泛素連接酶活性約達(dá)1000倍，從而促進(jìn)MOM上的泛素鏈組裝；并且它大大增加了PINK1磷酸化parkin-UBL結(jié)構(gòu)域的速率。使用熒光泛素探針獲得了類似的結(jié)果，這也表明添加線粒體Rho-GTPase（mitochondrialRhoGTPase，MIRO）作為parkin底物可以進(jìn)一步提高泛素轉(zhuǎn)移和鏈聚合的速率。pSer65-Ub與pSer65-parkin的結(jié)合比未磷酸化的parkin強(qiáng)約20倍，因此有利于在受損MOM上保留完全活性的pSer65-Parkin。此外，由于與pSer65-Ub結(jié)合的pSer65-parkin具有最佳活性（約4400倍活化），其在MOM上的保留促進(jìn)了泛素鏈的進(jìn)一步組裝，并為PINK1的磷酸化提供了額外的泛素分子，從而產(chǎn)生了前饋機(jī)制（Figure3）。另一方面，parkin可以被MOM上的PINK1直接磷酸化和激活（獨(dú)立于其與pSer65-Ub的初始相遇），以局部產(chǎn)生泛素鏈（Figure3Bb），泛素鏈成為PINK1將更多pSer65-parkin募集到MOM的底物，從而用作初始擴(kuò)增步驟。泛素鏈磷酸化在前饋過程中的重要性通過觀察到表達(dá)不能磷酸化的泛素突變形式（泛素Ser65Ala）的細(xì)胞在MOM蛋白上表現(xiàn)出泛素鏈合成減少、parkin向MOM的募集顯著減少、線粒體自噬率降低而得到強(qiáng)調(diào)。當(dāng)parkin在其PINK1磷酸化位點(diǎn)（parkinSer65Ala）發(fā)生突變時(shí)，泛素結(jié)合進(jìn)一步減少，這與parkin最活躍的形式在其UBL結(jié)構(gòu)域上被磷酸化并與pSer65-Ub結(jié)合的發(fā)現(xiàn)一致。泛素磷酸化對(duì)parkin募集的重要性也通過過表達(dá)的Ser65類磷酸化線性四聚泛素鏈在缺乏PINK1的情況下促進(jìn)parkin招募的能力得以證明。對(duì)前饋回路有貢獻(xiàn)的兩種機(jī)制的相對(duì)重要性尚不清楚。不能結(jié)合pSer65-Ub的Parkin突變體未能被募集到線粒體并促進(jìn)泛素鏈組裝，盡管在被UBL結(jié)構(gòu)域磷酸化激活時(shí)仍保持催化活性。這一發(fā)現(xiàn)表明，募集和完全的parkin激活需要PINK1磷酸化線粒體上預(yù)先存在的泛素（Figure3）。然而，催化缺陷的parkinCys431Ser突變體不能被檢測(cè)到募集到去極化的線粒體中，這表明parkin的泛素鏈合成對(duì)于足夠的pSer65-Ub在線粒體上積累并將parkin募集到可檢測(cè)的水平是必要的，至少在所使用的HeLa細(xì)胞模型系統(tǒng)中是如此。雖然很明顯，parkin與pSer65-Ub的結(jié)合加速了其UBL結(jié)構(gòu)域的PINK1依賴性磷酸化，但在線粒體去極化后，與pSer65Ub結(jié)合弱了約270倍的parkinHis302Ala突變體仍可以在細(xì)胞中的UBL結(jié)構(gòu)區(qū)被磷酸化。此外，從帕金森病患者中分離出的幾種沒有穩(wěn)定募集到去極化線粒體的parkin突變體，仍然可以被PINK1磷酸化到與野生型parkin相同的程度，這表明PINK1依賴性磷酸化可以在沒有與線粒體穩(wěn)定結(jié)合的情況下發(fā)生。考慮到所有這些數(shù)據(jù)，最簡(jiǎn)單的模型是，極少量的pSer65-Ub——由損傷前已經(jīng)存在于線粒體上的泛素產(chǎn)生，或由pSer65-parkin局部合成的泛素鏈產(chǎn)生——對(duì)于啟動(dòng)前饋機(jī)制是必要的，但不足以完全激活parkin。鑒于前饋過程的機(jī)制基礎(chǔ)，parkin或PINK1過表達(dá)可能有助于該途徑的人工激活。在使用parkinSer65Ala的實(shí)驗(yàn)中似乎是這樣，因?yàn)楠?dú)立研究報(bào)告了不同水平的線粒體募集，可能反映了表達(dá)水平的差異。由于parkin-Ser65Ala可以在體外與pSer65-Ub結(jié)合并被其激活，高水平的parkin-sel65Ala表達(dá)和低水平的pSer65-Ub可以人工促進(jìn)前饋反應(yīng)。鑒于線粒體泛素鏈在促進(jìn)PINK1依賴性parkin激活中的基本作用，通過DUBs進(jìn)行的泛素鏈分解可以減少啟動(dòng)前饋過程的可用線粒體泛素，這并不奇怪（Box3）。最近的研究已經(jīng)確定了E3泛素蛋白連接酶HUWE1在線粒體上形成Lys6泛素鏈中的作用，并且TOMM20上的這些類型的鏈被線粒體DUBUSP30去除（Box3）。因此，HUWE1可以控制線粒體上的基礎(chǔ)泛素水平，該基礎(chǔ)泛素可以參與parkin激活（Figure3Ba）。未來的一個(gè)關(guān)鍵問題是如何在空間上控制線粒體自噬。對(duì)這個(gè)問題的見解來自最近的一項(xiàng)研究，該研究揭示了攜帶錯(cuò)誤折疊基質(zhì)蛋白的線粒體的“亞結(jié)構(gòu)域”通過PINK1激活和parkin募集到受損亞結(jié)構(gòu)域來啟動(dòng)零碎的線粒體自噬。有趣的是，在這種情況下阻斷線粒體分裂增加了線粒體自噬，同時(shí)降低了對(duì)受損“結(jié)構(gòu)域”的選擇性，這表明了一種新的模型，即分裂可保護(hù)健康的線粒體區(qū)域免受未經(jīng)檢查的PINK1–parkin活性的影響。

帕金森病患者的基因突變通過對(duì)患者基因組進(jìn)行測(cè)序，在PRKN基因中發(fā)現(xiàn)了許多突變，這些突變跨越了蛋白質(zhì)的所有結(jié)構(gòu)域。這一parkin突變蛋白的功能分析為這種形式的帕金森病背后的缺陷細(xì)胞機(jī)制提供了重要的見解，結(jié)果與多種結(jié)構(gòu)元素有助于parkin活性的假設(shè)一致。也許parkin突變體最顯著的特征是，大多數(shù)突變體在線粒體的募集方面存在缺陷。鑒于parkin依賴性泛素鏈組裝對(duì)于parkin向線粒體的穩(wěn)定募集是必要的，單個(gè)parkin突變體無法被募集可能是由于缺乏催化活性或無法保留在MOM上，例如通過與pSer65-Ub結(jié)合的缺陷。例如，parkin-Lys161Asn和parkin-Lys211Asn突變體在Ser65磷酸化、pSer65-Ub依賴性激活和募集到受損線粒體的內(nèi)在激活方面存在嚴(yán)重缺陷，盡管它們能夠在體外與Lys63連接的pSer65-Ub鏈結(jié)合。因此，在患者中鑒定的這些和其他parkin突變體可能主要在支持前饋機(jī)制的步驟中存在缺陷。這一醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)主要問題是，是否有可能設(shè)計(jì)出針對(duì)突變parkin蛋白的小分子，并通過將其鎖定在活性構(gòu)象中來恢復(fù)其催化活性。parkin在活化過程中經(jīng)歷多種構(gòu)象變化的發(fā)現(xiàn)（Figure2）為鑒定結(jié)合并穩(wěn)定一種或多種活性形式的小分子提供了幾個(gè)機(jī)會(huì)。穩(wěn)定PINK1下游野生型parkin活性形式的小分子也有可能促進(jìn)帕金森病中受損線粒體的去除，這些線粒體在遺傳上與parkin和PINK1無關(guān)。

Figure4.

線粒體自噬受體募集和激活的原理

解碼有絲分裂的泛素鏈parkin在受損線粒體上組裝泛素鏈啟動(dòng)了泛素鏈結(jié)合自噬受體的解碼過程（Figure4）。這些受體包括SQSTM1、BRCA1基因1蛋白（BRCA1gene1protein，NBR1）、OPTN、鈣結(jié)合和含有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的蛋白2（calcium-bindingandcoiled-coildomain-containingprotein2，CALOCO2；也稱為NDP52）和Tax1結(jié)合蛋白1（Tax1bindingprotein1，TAX1BP1），含有C末端UBD和短疏水序列（稱為L(zhǎng)C3相互作用區(qū)（LC3interactingregion，LIR））（Figure4a），其可以與ATG8蛋白結(jié)合，從而通過典型的自噬機(jī)制潛在地促進(jìn)自噬體膜的募集（Figure1,4b）。SQSTM1以parkin依賴的方式被募集到去極化的線粒體，但在迄今為止檢測(cè)的大多數(shù)細(xì)胞系中，它不是線粒體自噬所必需的。相反，線粒體聚類需要SQSTM1。缺乏OPTN、CALCOO2和TAX1BP1但仍表達(dá)SQSTM1和NBR1的HeLa細(xì)胞在線粒體自噬中存在缺陷，其中最顯著的缺陷表現(xiàn)在缺乏OPTN的細(xì)胞中。這些數(shù)據(jù)表明受體之間存在一定程度的功能冗余，個(gè)體在個(gè)體細(xì)胞類型中的相對(duì)貢獻(xiàn)，而不是本質(zhì)上不同的活性。事實(shí)上，幾種受體的表達(dá)是組織特異性的，這對(duì)疾病有影響，因?yàn)樗鼈兛赡苤辉谔囟ǖ募?xì)胞譜系中發(fā)揮作用并影響特定的細(xì)胞。例如，有明確證據(jù)表明，SQSTM1在體內(nèi)小鼠巨噬細(xì)胞和由于高水平的氧化磷酸化而進(jìn)行線粒體自噬的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中的parkin依賴性線粒體自噬中發(fā)揮重要作用。研究的主要焦點(diǎn)是了解哪些類型的泛素鏈被自噬受體識(shí)別。用精氨酸取代泛素中的Lys6或Lys63，精氨酸不能與泛素結(jié)合，與僅導(dǎo)致輕微減少的Lys11取代相比，降低了線粒體自噬率。Lys6Arg或Lys48Arg和Lys63Arg泛素突變體的過表達(dá)也抑制線粒體自噬。此外，在測(cè)試的突變體中，泛素-Lys11Arg的過表達(dá)最大程度地減少了線粒體自噬（減少約50%）。這種差異的原因尚不清楚，但可能反映了泛素-Lys11Arg對(duì)parkin合成泛素鏈的間接影響，這一假設(shè)尚未得到驗(yàn)證。在體外，SQSTM1、OPTN和CALOCO2與Lys63鏈的結(jié)合比與Lys48鏈的結(jié)合更有效，這與Lys43鏈在線粒體自噬中的作用一致，盡管其他鏈類型尚未進(jìn)行系統(tǒng)測(cè)試。在過表達(dá)parkin的HeLa細(xì)胞中，線粒體上約20%的泛素分子在去極化時(shí)被磷酸化，這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)了這種修飾是否在線粒體自噬受體的募集中發(fā)揮直接作用的問題。事實(shí)上，人工靶向線粒體的PINK1過表達(dá)在沒有parkin的情況下促進(jìn)了OPTN的募集和線粒體自噬，盡管與存在parkin活性時(shí)相比具有廣泛的延遲和較低的效率。盡管這些觀察結(jié)果得出結(jié)論，pSer65-Ub是OPTN和其他自噬受體的受體，但其他數(shù)據(jù)表明，線粒體上未磷酸化形式的泛素偶聯(lián)物具有募集自噬受體功能（Figure4c，d）。特別是，體外實(shí)驗(yàn)表明，OPTN、CALOCO2和SQSTM1與未磷酸化的Lys63（而不是Lys48）泛素鏈有效結(jié)合，并且這些鏈在Ser65上的磷酸化（化學(xué)計(jì)量約為0.7）在很大程度上消除了自噬受體和泛素鏈之間的直接相互作用。這些發(fā)現(xiàn)與pSer65-Ub直接參與泛素偶聯(lián)物的解碼以促進(jìn)線粒體自噬不一致。此外，定量蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，在野生型PINK1和parkin存在的情況下，內(nèi)源性O(shè)PTN、SQSTM1、TAX1BP1和CALOCO2募集到受損的線粒體中，但在PINK1?/?HeLa細(xì)胞或表達(dá)parkinSer65Ala的細(xì)胞中沒有募集（其未能在線粒體上構(gòu)建泛素鏈，但表達(dá)活性PINK1）。鑒于PINK1應(yīng)磷酸化存在于線粒體表面的泛素分子以促進(jìn)OPTN募集，這些數(shù)據(jù)表明，在缺乏泛素鏈組裝的情況下，內(nèi)源性PINK1水平不足以進(jìn)行受體募集。此外，成像研究表明，pSer65-Ub信號(hào)均勻地覆蓋受損的線粒體，而線粒體自噬受體被募集到僅覆蓋線粒體表面積一小部分的高度局灶性點(diǎn)狀，表明與線粒體結(jié)合的pSer65-Ub不足以直接募集自噬受體，而需要額外的信號(hào)將受體引導(dǎo)到這些焦點(diǎn)。需要進(jìn)一步的研究來確定使線粒體自噬受體能夠解碼泛素鏈的信號(hào)。根據(jù)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，Lys63鏈中至少有兩個(gè)泛素分子是與OPTN中發(fā)現(xiàn)的ABIN和NEMO模塊的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ubiquitinbindingdomaininABINsandNEMO，UBAN）結(jié)合所必需的。如何優(yōu)化泛素鏈長(zhǎng)度，為parkin募集到pSer65-Ub提供足夠的位點(diǎn)，以及兩個(gè)或多個(gè)泛素分子的足夠偶聯(lián)物，以支持自噬受體募集，目前尚不清楚。

TBK1促進(jìn)線粒體自噬自噬受體的一個(gè)共同特征是它們與激酶TBK1相互作用的能力。通過異種吞噬檢測(cè)腸道沙門氏菌轉(zhuǎn)化的早期研究表明，TBK1可以磷酸化OPTN中LIR基序附近的絲氨酸殘基，并且這種磷酸化促進(jìn)OPTN與ATG8蛋白的結(jié)合以增加異種吞噬。目前已知，TBK1是依賴泛素結(jié)合自噬受體的多種類型的選擇性自噬所必需的，當(dāng)過表達(dá)時(shí)，它可以磷酸化OPTN、TAX1BP1、CALCOO2和SQSTM1。TBK1最清楚的作用是在線粒體自噬和異種自噬過程中調(diào)節(jié)OPTN。TBK1磷酸化OPTN中UBAN基序內(nèi)部和附近的殘基，以增加其對(duì)未磷酸化的Met1、Lys48和Lys63鏈的親和力（Figure4c-e）。有趣的是，正反饋機(jī)制控制OPTN的TBK1依賴性磷酸化（Figure4e）。TBK1響應(yīng)線粒體去極化磷酸化OPTN的能力取決于OPTN與泛素鏈的結(jié)合（Figure4c，e）。小分子抑制劑對(duì)TBK1活性的抑制或TBK1的缺失減少了OPTN向受損線粒體的募集，表明TBK1活性是OPTN與泛素鏈結(jié)合所必需的。重要的是，被TBK1磷酸化的OPTN中絲氨酸殘基的突變減少了其與受損線粒體和TBK1依賴性激活的關(guān)聯(lián)，從而延遲了線粒體自噬。反過來，OPTN與泛素鏈的結(jié)合是TBK1在Ser172上磷酸化所必需的，從而激活其激酶活性。這些發(fā)現(xiàn)揭示了通過線粒體自噬有效清除缺陷線粒體所需的另一個(gè)關(guān)鍵前饋回路（Figure4e）。要充分理解這一途徑，還有幾個(gè)問題需要解決。首先，響應(yīng)OPTN與線粒體泛素鏈的結(jié)合，TBK1是通過什么機(jī)制激活的？阻止反式自身激活的TBK1小分子抑制劑未能通過Ser172上的磷酸化阻斷其激活，這表明可能涉及一種或多種額外的激酶。其次，目前尚不清楚TBK1對(duì)自噬受體CALCOO2或TAX1BP1的磷酸化是否也增加了它們對(duì)泛素鏈的親和力。OPTN和SQSTM1的UBDs上的磷酸化增加了它們對(duì)泛素鏈的親和力，這表明類似的機(jī)制調(diào)節(jié)其他受體。第三，目前尚不清楚TBK1除了受體磷酸化之外是否還有其他功能。在這方面，研究表明，缺乏C端自噬受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的TBK1與來自O(shè)PTN的UBD和其他蛋白質(zhì)的融合可以挽救TBK1缺失細(xì)胞中腸道沙門氏菌的清除。然而，TBK1激酶活性在沙門氏菌感染細(xì)胞中的作用仍然未知，可能涉及泛素結(jié)合貨物受體以外的蛋白質(zhì)的磷酸化。最后，在ALS和額顳葉癡呆患者中，TBK1和OPTN（而不是parkin或PINK1）可能發(fā)生突變，這些突變會(huì)影響TBK1-OPTN的相互作用。這表明，TBK1–OPTN驅(qū)動(dòng)的選擇性自噬形式，可能涉及受損線粒體以外的貨物，可能對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和可能的其他神經(jīng)元細(xì)胞類型的健康很重要。

ATG8蛋白在線粒體自噬中的進(jìn)化作用線粒體自噬的典型模型假設(shè)，自噬受體向泛素化線粒體的募集導(dǎo)致自噬體膜前體向線粒體表面的募集，并隨后被自噬體吞噬受損的線粒體（Figure1，4b）。這種募集預(yù)計(jì)通過OPTN或CALCOO2中的LIR元件與生長(zhǎng)中的自噬體內(nèi)的ATG8蛋白的結(jié)合而發(fā)生。然而，ATG8受體識(shí)別的經(jīng)典模型并不能解釋最近的研究報(bào)告，即缺乏所有六種ATG8蛋白的人類細(xì)胞仍然能夠在受損的線粒體周圍構(gòu)建自噬體。因此，這種形式的選擇性自噬似乎不需要自噬受體中LIR序列與ATG8蛋白的典型結(jié)合（Figure4b）。此外，缺乏ATG8結(jié)合系統(tǒng)的細(xì)胞仍然支持饑餓誘導(dǎo)的大量自噬的顯著（約30%）通量，自噬體閉合頻率降低，與溶酶體融合后自噬體內(nèi)膜破裂率降低。因此，某些類型的自噬貨物的捕獲可能獨(dú)立于ATG8–LIR相互作用。這種ATG8偶聯(lián)無關(guān)形式的選擇性自噬可能涉及自噬受體或相關(guān)TBK1中不同序列與自噬體機(jī)制的相互作用（Figure4b）。然而，ATG8蛋白和ATG8脂質(zhì)化機(jī)制是線粒體自噬流所必需的，它們的缺失與溶酶體與自噬體融合的缺陷有關(guān)。最近的研究提出了抑制蛋白2（prohibitin2）的作用，它是一種鮮為人知的線粒體內(nèi)膜蛋白，是線粒體的自噬受體，通過與ATG8蛋白直接相互作用發(fā)揮作用。鑒于所提出的與ATG8的直接結(jié)合，目前尚不清楚prohibitin2是否在誘導(dǎo)線粒體自噬中發(fā)揮獨(dú)立于泛素結(jié)合途徑的作用。此外，如果prohibitin2是所提出的直接自噬受體，那么缺乏OPTN、CALOCO2和TAX1BP1的細(xì)胞為什么不能進(jìn)行自噬尚不清楚。需要進(jìn)一步的研究來了解何時(shí)需要LIR–ATG8相互作用，并了解泛素結(jié)合線粒體自噬受體和prohibitin2之間的任何相互作用。在這方面，多個(gè)prohibitin2泛素化位點(diǎn)以parkin依賴性和PINK1依賴性的方式檢測(cè)到，并且相對(duì)于大多數(shù)主要的parkin靶標(biāo)以動(dòng)力學(xué)延遲的方式檢測(cè)，這與MOM斷裂后發(fā)生的泛素化一致。

parkin功能與抗原遞呈的耦合雖然了解parkin和PINK1在疾病中的作用的大部分努力都集中在通過線粒體自噬去除線粒體上，但parkin也可以抑制線粒體衍生抗原的呈遞，這表明parkin和PINK1突變患者的帕金森病有一種新的自身免疫機(jī)制。在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞中，parkin通過泛素依賴性分選nexin9（SNX9）的周轉(zhuǎn)抑制熱應(yīng)激和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）依賴性線粒體抗原的產(chǎn)生，該蛋白是parkin非依賴性產(chǎn)生線粒體衍生囊泡（mitochondrial-derivedvesicles，MDVs）所需的蛋白質(zhì)。在缺乏parkin的情況下，MDVs將線粒體內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到內(nèi)體中，肽最終出現(xiàn)在主要的組織相容性復(fù)合體I類分子上。這導(dǎo)致T細(xì)胞靶向抗原呈遞細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明，一種可能導(dǎo)致帕金森病的非細(xì)胞自主機(jī)制，即細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元的喪失。有趣的是，LPS在Prkn?/?小鼠中誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的選擇性損失，增加了年齡依賴性神經(jīng)炎癥可能是人類神經(jīng)元損失的基礎(chǔ)的可能性。對(duì)該系統(tǒng)以及parkin選擇性降解SNX9以促進(jìn)其蛋白酶體周轉(zhuǎn)以阻斷MDVs產(chǎn)生的途徑的進(jìn)一步探索可能為parkin功能提供一種新的范式。

結(jié)論和未來問題Parkin依賴性線粒體自噬為理解泛素鏈合成與自噬受體募集的分子機(jī)制提供了一種范式，自噬受體是誘導(dǎo)線粒體自噬和可能的其他類型的細(xì)胞器自噬所必需的。Par