富血小板血漿的濃度測(cè)定及分析

富血小板血漿的濃度測(cè)定及分析

自20世紀(jì)90年代出版自強(qiáng)化血漿（prp）技術(shù)以來(lái)，科學(xué)家們對(duì)其制造技術(shù)和設(shè)備進(jìn)行了大量研究，并取得了顯著的成果。目前,美國(guó)FDA認(rèn)證并商業(yè)化生產(chǎn)的PRP制備系統(tǒng)有9種,其中部分制備系統(tǒng)能快速穩(wěn)定地獲得PRP,但獲得的PRP在血小板回收率及濃度方面存在較大差異,如Sequire系統(tǒng)血小板回收率僅為31%±15%,AutoloGel和Sequire系統(tǒng)制備的PRP血小板濃度分別是生理濃度的1倍和1.6倍,均未達(dá)到PRP發(fā)揮作用的“治療濃度”。此外,這些PRP制備系統(tǒng)價(jià)格較昂貴,不利于PRP技術(shù)在臨床的廣泛應(yīng)用。在國(guó)內(nèi),雖然目前PRP已應(yīng)用于骨科、整形外科、口腔外科等多個(gè)領(lǐng)域,但尚無(wú)專(zhuān)業(yè)的PRP制備系統(tǒng),多采用開(kāi)放式二次離心法制備,存在PRP易受外界污染、血小板回收率相對(duì)較低、易受操作因素影響、制備方法不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。山東威高集團(tuán)醫(yī)用高分子制品股份有限公司根據(jù)PRP在臨床應(yīng)用的特點(diǎn)設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了一套PRP制備套裝,該套裝已通過(guò)了國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局的認(rèn)證。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析采用此套裝獲得的PRP中血小板、白細(xì)胞和生長(zhǎng)因子的濃度,計(jì)算相關(guān)回收率和富集系數(shù),并進(jìn)行相關(guān)性分析,以檢驗(yàn)此套裝的實(shí)用性和穩(wěn)定性,從而為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1納入和排除標(biāo)準(zhǔn)取30例成年健康自愿者捐獻(xiàn)的外周血,男女各15例;年齡24~76歲,平均47歲。自愿者納入標(biāo)準(zhǔn):①符合《中華人民共和國(guó)獻(xiàn)血法》和衛(wèi)生部頒布的《獻(xiàn)血體格檢查標(biāo)準(zhǔn)》,血紅蛋白>11g/L,血小板>1.5×109/L。②采血前5d內(nèi)未服用影響血小板功能和凝血系統(tǒng)的藥物。③無(wú)傳染性疾病、相關(guān)血液疾病、嚴(yán)重心血管疾病及感染。1.2試劑、儀器和儀器枸櫞酸鈉注射液(天津金耀氨基酸有限公司);凝血酶凍干粉(常州千紅生化制藥股份有限公司);氯化鈣注射液(上海信誼金朱藥業(yè)有限公司);PDGF、TGF-β、VEGFELISA試劑盒(R&DSystems公司,美國(guó))。PRP制備套裝(山東威高集團(tuán)醫(yī)用高分子制品股份有限公司);TDL-5臺(tái)式多管架懸擺離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);KX-21全自動(dòng)血液分析儀(SYSMEX公司,日本);酶標(biāo)儀(ThermoScientific公司,美國(guó))。1.3prp的制備用預(yù)先裝有5mL枸櫞酸鈉注射液的50mL一次性注射器以18G針頭于每例志愿者肘前靜脈取血40mL。搖勻后,取1mL作血細(xì)胞分析,4mL作生長(zhǎng)因子濃度測(cè)定;剩余40mL注入PRP制備套裝離心管中,于嚴(yán)格無(wú)菌狀態(tài)下制備PRP。根據(jù)血液中各組分的沉降系數(shù)不同,以離心半徑15cm、2000r/min離心10min后,全血分為3層,上層為上清液,下層為紅細(xì)胞,兩層交界處一淺黃色層即PRP層。打開(kāi)離心管最左側(cè)通氣孔,20mL注射器連接離心管中間吸管孔,吸取下層紅細(xì)胞約16mL。將剩余血液同上法離心后,可見(jiàn)在底部紅細(xì)胞表面有白膜樣物質(zhì),即為血小板和白細(xì)胞沉積層;其上部為透明的血漿層。再次打開(kāi)通氣孔,20mL注射器連接無(wú)菌吸引管,經(jīng)離心管右側(cè)吸引孔吸取上部大部分血漿,保留離心管中約4mL血漿。靜置片刻后振蕩離心管約5min,使血小板充分重懸于剩余血漿中,即得到PRP。1.4測(cè)試指標(biāo)1.4.1回收率及富集系數(shù)測(cè)定分別將1mL抗凝靜脈血和制備的PRP采用全自動(dòng)血液分析儀進(jìn)行血常規(guī)分析,測(cè)定血小板及白細(xì)胞濃度,并計(jì)算PRP中血小板和白細(xì)胞濃度變異系數(shù)。計(jì)算PRP中血小板或白細(xì)胞回收率和富集系數(shù),回收率=PRP中血小板或白細(xì)胞總數(shù)/全血中血小板或白細(xì)胞總數(shù)×100%,富集系數(shù)=PRP中血小板或白細(xì)胞濃度/全血中血小板或白細(xì)胞濃度。分別測(cè)定男、女自愿者PRP血小板及白細(xì)胞濃度。1.4.2生長(zhǎng)因子的制備于4mL抗凝靜脈血中加入0.4mL凝血酶和氯化鈣混合物(2000U凝血酶中加入5mL5%氯化鈣溶液),3min后血液凝聚成凍膠狀,常溫下靜置1h后,同上法離心10min,吸取上清液轉(zhuǎn)移到凍存管中。將制備的PRP采用相同方法制備得到富含生長(zhǎng)因子的上清液。取制備的全血及PRP上清液,按照ELISA試劑盒說(shuō)明測(cè)定PDGF、TGF-β及VEGF濃度。1.5血小板及聯(lián)合用藥的相關(guān)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,對(duì)全血和PRP中血小板和白細(xì)胞濃度、PRP中血小板和白細(xì)胞的回收率和富集系數(shù)、PRP中生長(zhǎng)因子濃度采用Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)分析;全血和PRP中血小板及白細(xì)胞濃度比較、男女組間血小板和白細(xì)胞濃度比較采用t檢驗(yàn);檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。2結(jié)果2.1prp檢測(cè)血小板回收率和富集系數(shù)全血和PRP中血小板濃度分別為(131.40±29.44)×109/L和(819.47±136.32)×109/L,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=—27.020,P=0.000);PRP中血小板回收率為60.85%±8.97%,富集系數(shù)為6.40±1.06。全血和PRP中白細(xì)胞濃度分別為(5.57±1.91)×1012/L和(32.20±10.42)×1012/L,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=—13.780,P=0.000);PRP中白細(xì)胞回收率為58.30%±19.24%,富集系數(shù)為6.10±1.93。PRP中血小板濃度和白細(xì)胞濃度分別與全血中血小板濃度(r=0.652,P=0.000)和白細(xì)胞濃度(r=0.460,P=0.011)成正相關(guān)。PRP中血小板(r=0.743,P=0.000)和白細(xì)胞(r=0.945,P=0.000)的回收率和富集系數(shù)間成正相關(guān)。另外,分析PRP回收率和富集系數(shù)數(shù)據(jù)顯示均為正態(tài)分布(P值分別為0.671和0.706),且標(biāo)準(zhǔn)差分別為1.06和8.97。PRP中血小板和白細(xì)胞的濃度變異系數(shù)分別為16.64%和32.36%。男性組和女性組PRP中血小板濃度分別為(792.07±161.05)×109/L和(846.87±104.63)×109/L,比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=—1.110,P=0.279);兩組PRP中白細(xì)胞濃度分別為(29.91±10.13)×1012/L和(34.5±10.53)×1012/L,比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=—1.220,P=0.234)。2.2全血評(píng)分gc/ml全血中PDGF、TGF-β、VEGF濃度分別為(126.10±7.89)、(100.14±10.53)、(185.58±16.83)ng/mL;PRP中分別為(698.15±64.48)、(681.36±65.90)、(1071.55±106.04)ng/mL,是全血的(5.67±1.18)、(6.99±0.61)、(5.74±0.83)倍。PRP中PDGF濃度(r=0.832,P=0.020)、TGF-β濃度(r=0.835,P=0.019)、VEGF濃度(r=0.824,P=0.023)均與PRP中血小板濃度成正相關(guān)。3討論3.1影響因素分析3.1.1中小型血小板患者受外源性刺激而被激活的影響PRP的血小板計(jì)數(shù)在一定程度上影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)論的客觀性和可比性,但血小板計(jì)數(shù)受很多因素的影響,包括體內(nèi)和體外兩方面。在體內(nèi),除受多種藥物影響外,血小板本身還存在生理性波動(dòng),不同年齡、不同季節(jié)、一天中不同時(shí)間的血小板濃度呈規(guī)律性變化;此外,從不同部位、不同體位或運(yùn)動(dòng)前后取血進(jìn)行檢測(cè),血小板計(jì)數(shù)也呈顯著性差異。在體外,血小板易受外源性刺激而被破壞或者激活,如動(dòng)作粗暴、抽血時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、針頭過(guò)小、止血帶運(yùn)用不當(dāng)、不適當(dāng)?shù)目鼓齽┖蛢?chǔ)血器、搖勻程度、放置時(shí)間等均會(huì)人為造成血小板活化和破壞,影響計(jì)數(shù)。Woodell-May等發(fā)現(xiàn),PRP血小板計(jì)數(shù)與震蕩時(shí)間有關(guān),他們建議PRP在振蕩器上振蕩應(yīng)不少于5min才可能得到較準(zhǔn)確的血小板計(jì)數(shù)。本實(shí)驗(yàn)為保證樣本的同質(zhì)性,所有抽血、離心和血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析均由同一組醫(yī)務(wù)人員進(jìn)行,全程操作輕柔;盡量讓自愿者在相同狀態(tài)下快速順利一次性取血;計(jì)數(shù)前充分震蕩混勻PRP;所有樣本均在采血后1h內(nèi)檢測(cè)完。但我們認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)中仍存在影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可能因素,比如第1次離心后吸取底層紅細(xì)胞的量是通過(guò)注射器刻度和個(gè)人經(jīng)驗(yàn)來(lái)判斷,存在一定誤差,直接影響了第2次離心后剩余PRP的量,因?yàn)樵黾映槿〉难毫亢蜏p少第1次離心后底層紅細(xì)胞量,均會(huì)增加PRP中血小板和白細(xì)胞濃度。此外,考慮到部分自愿者年齡偏大,靜脈穿刺較難,有10名自愿者在止血帶幫助下抽取靜脈血,這也可能造成PRP批內(nèi)差異較大。3.1.2離心次數(shù)和離心穩(wěn)定性對(duì)血小板濃度的影響目前已上市的PRP制備系統(tǒng)設(shè)計(jì)原理基本相同,但不同研究結(jié)果仍存在較大差異,這可能與實(shí)際操作時(shí)的不穩(wěn)定因素有關(guān),比如離心力和離心時(shí)間的選擇,離心管的管徑、長(zhǎng)度,操作者的熟練程度等。不同離心方法對(duì)應(yīng)了不同的離心力和離心時(shí)間,其制備的PRP中血小板濃度和活性也各不相同。目前制備PRP的方法包括Anitua法、Petrungaro法、Landesberg法及Aghaloo法等,大多學(xué)者首選二次離心法。一般認(rèn)為,PRP中的血小板在體外較脆弱且容易被激活,過(guò)高的離心速度會(huì)使血小板膜破裂,降低其生物活性,因此離心時(shí)速度不宜過(guò)快。Sonnleitner等發(fā)現(xiàn)第1次離心時(shí)采用160×g離心20min后,交界面以下6mm的血小板濃度最高;第2次離心以400×g離心15min后,試管底部血小板濃度超過(guò)2×107/uL,約達(dá)正常血小板濃度的10倍。Marx則認(rèn)為離心力(g)與離心時(shí)間(min)的乘積超過(guò)11000g.min時(shí),血小板將被大量破壞,造成生長(zhǎng)因子流失。經(jīng)比較研究證實(shí),Landesberg法(兩次離心均為200×g、離心10min)制備的PRP中血小板濃度高,活化率小。但也有學(xué)者認(rèn)為采用第1次以200×g離心10min,第2次以1200×g離心10min的方法制備的PRP中血小板濃度和回收率高。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)抽血量低于20mL,離心力約為200×g時(shí),用此套裝可以制備出PRP,但按照本實(shí)驗(yàn)之前的設(shè)計(jì),取血量為40mL時(shí),則不能成功制備出PRP。分析原因可能有兩方面:第一,取血量少時(shí),對(duì)離心力要求低,但考慮到臨床對(duì)PRP中血小板濃度的要求,必須有較大的離心血量,而較多的血量對(duì)離心力要求較高。第二,若離心試管直徑小,則血液成分容易分層,所需離心力小。而該套裝為了滿(mǎn)足對(duì)血量的需求,離心管直徑大,所以需要更大的離心力。因此,實(shí)驗(yàn)中我們以離心半徑15cm、2000r/min離心10min的條件離心2次后成功制備PRP。本實(shí)驗(yàn)PRP富集系數(shù)和回收率均為正態(tài)分布(P值分別為0.671和0.706),且標(biāo)準(zhǔn)差分別為1.06和8.97,表明采用此套裝可以較穩(wěn)定地獲得高濃度血小板。另外通過(guò)計(jì)算濃度變異系數(shù)來(lái)比較批內(nèi)各次制備PRP中血小板和白細(xì)胞的濃度差異大小,也可在一定程度上反映出此套裝制備PRP的穩(wěn)定性。PRP中血小板和白細(xì)胞的濃度變異系數(shù)分別為16.64%和32.36%,可以認(rèn)為PRP中制備得到的血小板較白細(xì)胞更穩(wěn)定。3.1.3性別因素對(duì)prp的影響本實(shí)驗(yàn)中,PRP中血小板和白細(xì)胞濃度男女組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示用此套裝制備的PRP不受性別因素影響。但本組30例自愿者中有2例(分別為男73歲,女65歲)在第1次離心后出現(xiàn)溶血現(xiàn)象,我們認(rèn)為可能與自愿者年齡偏大,紅細(xì)胞脆性增加有關(guān)。3.1.4生長(zhǎng)因子濃度與血小板濃度的關(guān)系由于PRP主要通過(guò)高濃度血小板釋放出的生長(zhǎng)因子來(lái)發(fā)揮其修復(fù)作用,因此理論上講,生長(zhǎng)因子的濃度應(yīng)該與血小板濃度成正相關(guān),但對(duì)此尚未達(dá)成共識(shí)。我們的實(shí)驗(yàn)測(cè)定的PRP中生長(zhǎng)因子濃度與PRP中血小板濃度成正相關(guān),這與多項(xiàng)研究結(jié)論相同。3.2非凝膠狀態(tài)的富白領(lǐng)prp的應(yīng)用由于制備方法和步驟有很大差異,目前將PRP大致分為兩種:貧白細(xì)胞PRP(即只含有高濃度的血小板)和富白細(xì)胞PRP(含有高濃度的PRP和白細(xì)胞)。研究認(rèn)為,富白細(xì)胞PRP相比貧白細(xì)胞PRP能更持久地釋放生長(zhǎng)因子和纖維膠原等成分,因此更適合應(yīng)用于損傷組織修復(fù)和再生。隨著對(duì)制備技術(shù)的不斷研究,越來(lái)越多的設(shè)備能夠制備出非凝膠狀態(tài)的富白細(xì)胞PRP以滿(mǎn)足臨床應(yīng)用。非凝膠狀態(tài)的PRP因?yàn)榭扇藶樵O(shè)定凝血酶或氯化鈣的添加時(shí)間,適合于注射或者局部創(chuàng)面等運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域;而凝膠狀態(tài)PRP則很難進(jìn)行注射等操作,但由于其良好的組織構(gòu)架和強(qiáng)度,可用于口腔頜面外科。正是基于貧白細(xì)胞和富白細(xì)胞PRP各自的特點(diǎn)和本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)目的,我們?cè)谌屑尤肟鼓齽┑耐瑫r(shí),在第2次離心后提取白細(xì)胞和血小板。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,應(yīng)用此套裝能成功提取出高濃度和高回收率的富白細(xì)胞PRP,白細(xì)胞回收率為58.30%±19.24%,白細(xì)胞富集系數(shù)為6.10±1.93。3.3血小板富集及回收率目前,美國(guó)FDA認(rèn)證并商業(yè)化生產(chǎn)的9種PRP制備系統(tǒng)均對(duì)應(yīng)著不同的制備技術(shù),但制備PRP的基本方法均為離心法。9種系統(tǒng)平均制備時(shí)間為17.67min,平均血小板富集系數(shù)為4.24,平均血小板回收率為60.2%,制備套裝的平均價(jià)格為533.89美元。其中AutoloGel系統(tǒng)用時(shí)最少,但其