分子診斷克隆2013

分子克隆

目錄Molecularcloning

分子克隆相關(guān)概念

來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖?？寺?clone)克隆化(cloning)

技術(shù)水平分子克隆DNA克隆

細(xì)胞克隆組織、器官克隆個(gè)體克隆按照人的意愿，在體外將制備的DNA片段與載體重組，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增，以獲得該DNA分子的大量拷貝，此過程稱為分子克隆，也稱基因克隆或DNA克隆或重組DNA(binantDNA)。分子克隆(geneticengineering)上游技術(shù)下游技術(shù)上游技術(shù):分子克隆目的：分離獲得某一感興趣的基因或DNA

下游技術(shù):基因表達(dá)目的：獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程Toolenzyme第一節(jié)工具酶工具酶（ToolEnzyme）

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉(zhuǎn)錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶一、限制性核酸內(nèi)切酶RE是一類能識別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸內(nèi)切水解酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠrestrictionendonuclease,RE限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型分類特點(diǎn)屬名種名株系EscherichiacoliRY13EcoRⅠ

酶的來源酶的名稱命名Ⅱ類酶識別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

GGATCCCCTAGG識別序列長度4～8

個(gè)堿基對

BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口切口：平端切口、粘端切口5′3′5′3′5′來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶(isoschizomer)。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功異源酶識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，這樣的酶稱為同尾酶(isocaudarner)。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA同尾酶GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGGBamHⅠGGATCCCCTAGGDNA連接酶(DNAligase)大腸桿菌DNA連接酶T4DNA

連接酶DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端35000（?。?6000（大）5′→3′外切酶5′→3′聚合酶3′

→5′外切酶5′→3′聚合酶3′

→5′外切酶枯草桿菌蛋白酶DNA聚合酶ⅠKlenow片段Klenow片段cDNA第二鏈合成雙鏈DNA3末端標(biāo)記填補(bǔ)3′末端逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）是多功能酶，具有三種酶的活性作用：合成cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶的活性末端脫氧核糖核苷酰轉(zhuǎn)移酶

催化脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈DNA分子的3′末端的-OH上。1.在載體或目的基因3′末端加上互補(bǔ)的同質(zhì)多聚尾，形成人工粘性末端。2.用于DNA3′末端的同位素探針標(biāo)記。terminaldeoxynucleotidyltransferase(TdT)作用末端轉(zhuǎn)移酶的催化作用堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）作用：催化核酸的5′末端脫去磷酸基團(tuán)。堿性磷酸酶的活性T4多核苷酸激酶功能：催化γ-磷酸從ATP分子轉(zhuǎn)移給DNA的5`-OH末端（圖）。T4polynucleotidekinaseT4多核苷酸激酶的活性（前向反應(yīng)）DNA/RNA（單鏈或雙鏈）T4多核苷酸激酶的交換反應(yīng)

用途：（1）標(biāo)記DNA的5`-末端；（2）使缺失5`-P末端的DNA發(fā)生磷酸化作用。核酸酶S1

核酸酶S1可水解雙鏈DNA，RNA或DNA-RNA雜交分子中的單鏈部分，其作用是除去雙鏈DNA的黏性末端以產(chǎn)生平末端，除去cDNA合成時(shí)形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。S1核酸酶的活性酶主要用途限制性核酸內(nèi)切酶識別DNA特定序列，切割DNA分子DNA連接酶連接兩個(gè)DNA分子或片段大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ或Klenow酶1制作DNA探針；2合成cDNA第二鏈；3填補(bǔ)雙鏈DNA3`凹端；4DNA測序。TaqDNA聚合酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸5`-OH磷酸化，制末端標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶使3`-末端加同聚物尾S1核酸酶降解單鏈DNA或RNA逆轉(zhuǎn)錄酶補(bǔ)平反應(yīng)，合成cDNA或制探針磷酸酶切除核酸末端磷酸基SUMMARY第二節(jié)載體

Vector能攜帶外源DNA片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具，其化學(xué)本質(zhì)為DNA分子。質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA載體常用載體載體的分類克隆載體（cloningvector）表達(dá)載體（expressionvector）載體應(yīng)具備的條件：1.能自我復(fù)制；2.有適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c(diǎn)，便于外源基因的插入。多克隆位點(diǎn)（MultipleCloningSites,MCS）:載體上多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)(即在載體的其他部位沒有這些酶的相同切點(diǎn))。多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)。載體應(yīng)具備的條件：3.有適宜的分子量，具有較高的拷貝數(shù)。4.具有合適的篩選標(biāo)記。5.與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的表達(dá)調(diào)控元件。

克隆載體（cloningvector）能將外源基因在受體細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增并產(chǎn)生足夠量目的基因的載體稱為克隆載體。（一）質(zhì)粒載體質(zhì)粒

(plasmid)

質(zhì)粒載體的類型pBR322質(zhì)粒載體組成特點(diǎn)1.含有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)（Ori）。

2.含有四環(huán)素抗性(Tetr)基因和氨芐青霉素抗性(Ampr)基因。3.

含有多個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一酶切位點(diǎn)，用于插入外源DNA片段。4.外源基因插入抗性基因，導(dǎo)致標(biāo)志基因失活。目錄pUC系列質(zhì)粒載體組成特點(diǎn)1.分子量小、高拷貝數(shù);2.來自pBR322質(zhì)粒的Ori和氨芐青霉素抗性基因(Ampr);

pUC系列質(zhì)粒載體組成特點(diǎn)3.加入了E.colilac操縱子的部分結(jié)構(gòu)：啟動子（P）、操縱序列（O）、lacZ′基因。乳糖操縱子(lacoperon)的結(jié)構(gòu)

調(diào)控區(qū)CAP結(jié)合位點(diǎn)啟動序列操縱序列

結(jié)構(gòu)基因Z：β-半乳糖苷酶Y：透酶A：乙?；D(zhuǎn)移酶ZYAOPDNApUC系列質(zhì)粒載體組成特點(diǎn)5.來自Wild-M13phage的MCS。4.有l(wèi)acI（調(diào)節(jié)基因I）。mRNA阻遏蛋白IDNAZYAOPpol調(diào)節(jié)基因IPTGlacIlacI（二）噬菌體載體λ-噬菌體M13噬菌體1.λ-噬菌體(phage)

5′5′3′3′cos位點(diǎn)（EMBL4）插入型載體（λgt噬菌體10和λgt噬菌體11）置換型載體M13噬菌體DNA改造的M13mp載體系列（含lacZ基因）2.M13

噬菌體(phage)

+感染型+-復(fù)制型（三）黏粒載體粘性質(zhì)粒(cosmid)是λ噬菌體和質(zhì)粒的雜種，其優(yōu)點(diǎn)是可以用來插入較大的DNA片段。Ori（四）酵母細(xì)胞中克隆基因常用載體酵母人工染色體yeastartificialchromosome,YAC來源：【酵母染色體DNA+pBR322質(zhì)?！款愋徒湍刚闲唾|(zhì)粒（yeastintegratedplasmid,YIP）酵母復(fù)制型質(zhì)粒（yeastreplicatingplasmid,YRP）類型酵母附加型質(zhì)粒（yeastepisomeplasmid,YEP）酵母著絲粒質(zhì)粒（yeastcentromereplasmid,YCP）YRP+著絲粒區(qū)YIP和YCP載體能穩(wěn)定遺傳，但是為單拷貝轉(zhuǎn)化率低，多用于遺傳分析。YRP和YEP載體穩(wěn)定性差，但是對酵母具有較高的轉(zhuǎn)化活性，拷貝數(shù)高，YEP被用于基因克隆中的常用載體。

注4.含有適合的限制酶切位點(diǎn)，以便插入外源基因。YAC載體的特點(diǎn):1.可插入約1000kb的外源DNA。2.能在大腸桿菌中復(fù)制，具有較高拷貝數(shù)。3.含有在酵母細(xì)胞中便于選擇的遺傳標(biāo)記。(五)動物細(xì)胞基因克隆的載體類型:猿猴空泡病毒40(SV40)載體、腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。二、表達(dá)載體（expressionvector）表達(dá)載體能將外源基因在受體細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄和正確翻譯的載體。（一）原核細(xì)胞表達(dá)載體原核細(xì)胞的表達(dá)載體主要是大腸桿菌表達(dá)載體。

expressionvectorofprokaryotes大腸桿菌表達(dá)載體在克隆載體的基礎(chǔ)上，還應(yīng)具備表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控元件啟動子核糖體結(jié)合位點(diǎn)克隆位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止信號啟動子promoterσ因子大腸桿菌中常用的啟動子乳糖啟動子Lac色氨酸啟動子Trp大腸桿菌中常用的啟動子人工構(gòu)建的Tac(trp-lac)啟動子，受Lac阻遏蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)，可被IPTG誘導(dǎo)。λ噬菌體PL

、PR啟動子核糖體結(jié)合位點(diǎn)Ribosomebindingsite,RBSSDShine-DalgarnosequencemRNAAGGAAUGUAA終止子Terminator轉(zhuǎn)錄終止序列多由一段富含A/T區(qū)域和富含G/C的回文結(jié)構(gòu)組成。5`．．．

GGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`

RNA5

．．．GGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT...3

DNA

UUUU...…

莖環(huán)(stem-loop)/發(fā)夾(hairpin)結(jié)構(gòu)5′pppG53

35RNA-polpKK223-3質(zhì)粒載體的物理圖譜外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)載體可以分成三種類型3.融合蛋白表達(dá)載體1.非融合型表達(dá)載體2.分泌型表達(dá)載體目錄

（二）哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體如果在原核宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)真核生物的基因，目的基因必須是cDNA。注真核生物的表達(dá)載體主要有酵母昆蟲哺乳動物細(xì)胞

哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體的DNA序列原核DNA序列能在大腸桿菌中自我復(fù)制的復(fù)制子和抗藥基因的篩選標(biāo)記。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體的DNA序列啟動子

增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)TATA盒CAAT盒GC盒

增強(qiáng)子AATAAA切離加尾轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)修飾點(diǎn)外顯子翻譯起始點(diǎn)內(nèi)含子OCT-1OCT-1：ATTTGCAT八聚體5------AAUAAA-5

------AAUAAA--核酸酶-GUGUGUGRNA-polAATAAAGTGTGTG轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)5

5

3

33加尾AAAAAAA······3mRNA終止子和加PolyA信號二、穿梭載體（shuttlevector）

人工構(gòu)建的既帶有原核細(xì)胞的復(fù)制元件、又帶有真核細(xì)胞的復(fù)制元件，既能在原核細(xì)胞中復(fù)制、又能在真核細(xì)胞中復(fù)制，在原核和真核細(xì)胞分子克隆中均能應(yīng)用的載體，稱為穿梭載體（shuttlevector）。定義穿梭黏粒載體酵母穿梭質(zhì)粒載體第三節(jié)分子克隆的基本步驟BasicProcedure分子克隆的基本步驟目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌目的基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程目錄（一）目的基因的獲?。╥solation）1.化學(xué)合成法2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)5.反轉(zhuǎn)錄合成cDNA6.

（一）目的基因的獲?。╥solation）1.從基因文庫中獲取基因組文庫(genomiclibrary，G-文庫)cDNA文庫(cDNAlibrary，C-文庫)組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的一個(gè)物種的所有基因組DNA片段的集合。*從基因組DNA文庫獲取目的基因目錄限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫目錄mRNA

cDNA

雙鏈cDNA

重組DNA分子cDNA文庫

反轉(zhuǎn)錄酶

載體

受體菌

復(fù)制*從cDNA文庫獲取目的基因

逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目錄2.逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA3.

化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列4.直接從染色體DNA中分離二、克隆載體的選擇和構(gòu)建Digestion三、目的基因與載體的連接LigationBamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接目錄不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)Bg

lⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。目錄2.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄3.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目錄4.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)四、重組DNA導(dǎo)入受體菌（transfer）