高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法測定嬰幼兒配方乳粉中多殘留

高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法測定嬰幼兒配方乳粉中多殘留

黃曲霉素p1是由于動物攝入黃曲霉素b1，并在體內(nèi)形成羥基化形成的代謝產(chǎn)物。1963年Alleroft首先發(fā)現(xiàn),直到1965年才命名為AFM1,它是一種強致癌物質(zhì),毒性僅次于AFB1,WHO將其列為ⅡB類致癌物。AFM1主要存在于動物的乳、腎臟、肝臟、蛋、肉和尿中,其中以乳中最為常見。氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪和苯甲酸雌二醇因其較大的毒副作用,成為農(nóng)業(yè)部發(fā)布《動物性食品中獸藥最高殘留限量》(農(nóng)業(yè)部235號公告)中不得檢出的藥物。當(dāng)前,我國食品安全形勢依然嚴(yán)峻,2008年發(fā)生的乳粉中三聚氰胺重大食品安全事件充分顯示,必須提高對嬰幼兒食品中危害因素的監(jiān)測、評估能力和預(yù)警水平。衛(wèi)生部指出,要力圖避免因監(jiān)管手段缺失發(fā)生新的嬰幼兒食品安全隱患。因此,尋求準(zhǔn)確、快速、靈敏度高的檢測方法,對嬰幼兒食品中多種常見有毒及禁用物質(zhì)進行高通量的定性定量分析,是食品安全研究的一個重要方面。由于目前還沒有嬰幼兒配方乳粉中氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪和苯甲酸雌二醇多殘留的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法,還不能完成科學(xué)監(jiān)管,保護廣大嬰幼兒的健康和利益。因此,及時尋求簡便、快速、準(zhǔn)確、敏感性高的嬰幼兒配方乳粉中氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇殘留的檢測方法才能保障食用嬰幼兒配方乳粉的衛(wèi)生和安全。目前,測定氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇殘留的文獻比較多,方法主要是酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法和液相-質(zhì)聯(lián)用法等。酶聯(lián)免疫法不能定性,存在假陽性等情況;液相色譜法雖然對儀器要求不高,但檢出限不高,而且不能滿足確證要求;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是近年來新興的檢測技術(shù),由于其準(zhǔn)確、高效和高靈敏度,符合目前食品安全檢測所追求的快速高效的要求。目前還未見液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法用于同時檢測氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇的報道。本文采用堿性乙腈提取目標(biāo)物,采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進行檢測,前處理簡單,靈敏度高,適合于嬰幼兒配方乳粉中氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇殘留的同時快速檢測。1實驗部分1.1方法和儀器甲醇、乙腈:色譜純,德國Fisher公司;氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1、苯甲酸雌二醇:w≥99%,美國Sigma公司;實驗所選用樣品為作者單位檢驗樣品;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。Agilent6410型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀:配Agilent1200型液相色譜儀,美國Agilent公司;RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海市亞榮生化儀器廠;KQ-5200型超聲波清洗儀:昆山市超聲儀器有限公司;TGL-16M型高速臺式冷凍離心機:湘儀離心機儀器有限公司;Milli-Q去離子水發(fā)生器:美國Milli-Q公司。1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液:分別稱取適量的氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品,分別用甲醇配成0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,該溶液在-18℃保存。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成1.0μg/mL?？瞻讟悠诽崛∫?選擇陰性樣品,按1.5操作?；|(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:根據(jù)儀器的靈敏度和線性范圍,吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,用空白樣品提取液配成系列濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。1.3流動相in色譜柱:資生堂MGⅢ-C18柱,1.8μm,2.1mm×150mm。條件:流速0.25mL/min,柱溫25℃,進樣量20μL,流動相:甲醇(A)+10mmol/L乙酸銨緩沖溶液(B);梯度洗脫:0~3min,B保持80%,3~15min,B由80%線性遞減至5%,15~21min,B保持5%,21.0~21.1min,B由5%線性遞增至80%,21.1~25.0min,B保持80%。1.4干燥氣離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正離子掃描;檢測方式:多反應(yīng)檢測;干燥氣:N2;霧化氣壓力:275.8kPa;干燥氣溫度:325℃;干燥氣流速:8L/min;汽化溫度:340℃。1.5乙腈溶液的定容稱取4.0g樣品,精確至0.01g,置于100mL比色管中,加水35mL,充分溶解后超聲提取5min,再用含1%氨水的乙腈溶液定容。超聲波提取20min,上清液經(jīng)濾紙過濾,吸取25mL濾液至100mL蒸發(fā)瓶內(nèi),并將其接至旋轉(zhuǎn)器上,于45℃水浴中減壓蒸餾至1mL,加含2%氨水的甲醇溶液充分溶解后定容至5mL,濾紙過濾后待測(如渾濁嚴(yán)重,以8000r/min高速離心10min,取上清液過濾膜)。2結(jié)果與討論2.1樣品提取溶劑的選擇為了充分提取樣品中氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇殘留,本實驗首先分別選擇乙腈、甲醇、乙酸乙酯等做為樣品提取溶液,實驗結(jié)果均不理想。隨后經(jīng)過反復(fù)實驗,發(fā)現(xiàn)含1%氨水的乙腈能有效地提取樣品中目標(biāo)化合物,同時能有效除去樣品中的蛋白質(zhì),因此,選擇此溶液作為樣品提取液。此外,實驗還發(fā)現(xiàn),只有當(dāng)定容溶液為堿性時,才能充分溶解目標(biāo)化合物,所以本方法選擇含2%氨水的甲醇溶液作為樣品的定容溶液。2.2色譜柱及流動相的選擇色譜柱的選擇:為了有利于色譜峰的分離及峰形的改善,本方法分別采用資生堂MGⅢ-C18色譜柱(150mm×2.1mm,1.8μm)、ZORBAXEclipseXDB-C18色譜柱和ZORBAXSB-Aq色譜柱(150mm×2.1mm,3.5μm)進行分離實驗,發(fā)現(xiàn)資生堂MGⅢ-C18色譜柱(150mm×2.1mm,1.8μm)效果較好。流動相的選擇:實驗發(fā)現(xiàn)用水作水相流動相時,雙酚A色譜峰易展寬,因此本方法采用10mmol/L乙酸銨溶液-甲醇為流動相,利用梯度洗脫的方法提高分離及檢測效果。測試開始時,流動相中10mmol/L乙酸銨溶液-甲醇的比例為80:20,然后在0~3min保持此比例,這一部分主要是洗脫測定液中極性較強的雜質(zhì);3~15min內(nèi)將改變二者的比例為5:95,這一部分主要是洗脫測定液中的中等極性雜質(zhì);15~21min保持此比例,這一部分主要是洗脫測定液中氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇。通過上述兩步梯度,在25min內(nèi),可以較好地分離測定液中氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇(結(jié)果見圖1)。2.3質(zhì)譜條件確定采用直接進樣方式將濃度為100ng/mL的氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇注入離子源中,在正離子檢測方式下進行母離子全掃描,得到氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇的分子離子峰。根據(jù)歐盟2002/657/EC指令規(guī)定對于質(zhì)譜確證方法必須達到4個確證點的要求,低分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測應(yīng)在確定母離子的基礎(chǔ)上選擇2個以上的子離子。以該離子峰為母離子,進行二級質(zhì)譜掃描,最后采集全掃描的二級質(zhì)譜圖,得到碎片離子信息,然后再對得到的二級質(zhì)譜參數(shù)如破碎電壓、碰撞能量等進行優(yōu)化,使定性離子與定量離子產(chǎn)生的離子對強度比例達到最大時為最佳。得到氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇的最佳質(zhì)譜參數(shù)(結(jié)果見表1)。2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限用空白樣品提取溶液逐級稀釋的標(biāo)準(zhǔn)工作液,分別進樣20μL,測定結(jié)果經(jīng)線性回歸(y為峰面積,Counts;x為濃度,μg/L),同時用空白樣品進行加標(biāo)實驗,在信噪比均大于3的條件下能檢出,將此添加量定為檢出限。結(jié)果見表2。2.5加標(biāo)回收率試驗每組準(zhǔn)確稱取空白樣品6份,每份4.0g,共3組,分別定量加入目標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),第一組添加水平:醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1均為0.5μg/kg,苯甲酸雌二醇、氯丙嗪均為5.0μg/kg;第二組添加水平:醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1均為5μg/kg,苯甲酸雌二醇、氯丙嗪均為25.0μg/kg;第三組添加水平:醋酸甲孕酮、黃曲霉毒素M1均為25μg/kg,氯丙嗪、塞拉嗪、苯甲酸雌二醇均為250.0μg/kg。按供試品溶液制備方法制備后進行測定,結(jié)果見表3。從表3中可看出,不同濃度平均加標(biāo)回收率76.7%~102.1%,平