蘋毛麗金龜引誘劑的觸角電位和嗅覺反應(yīng)

蘋毛麗金龜引誘劑的觸角電位和嗅覺反應(yīng)

蘋毛利金龜（faldermann，1973）是一種非點(diǎn)源性昆蟲。有幾種寄主植物，但不同的寄主數(shù)量上存在很大差異。個(gè)別寄主植物表現(xiàn)出特殊的選擇偏好（李子等，1973）。金龜甲在求偶、覓食、聚集等活動(dòng)中常常借助化學(xué)氣味物質(zhì)傳遞信息,許多植食性金龜子的感覺細(xì)胞對(duì)綠葉揮發(fā)物及花的揮發(fā)物敏感(Renwick,1989)。以麗金龜科和花金龜科為例,取食和求偶都在花上,花的揮發(fā)物為其營養(yǎng)和繁殖提供必要的資源信息,因此可利用這些花的揮發(fā)物來誘集金龜子,進(jìn)行預(yù)測預(yù)報(bào)和防治工作(Leal,1998;王廣利和孫凡,2005)。研究表明,蒲公英花揮發(fā)物中的順-3-己烯醇乙酸酯、苯甲醛、苯乙醛、苯乙醇、苯甲酸苯酯可導(dǎo)致扁綠異麗金龜Anomalaoctiescostata的強(qiáng)烈趨向行為(Lealetal.,1994)。從玫瑰花中提取的誘集物對(duì)我國北方白星花潛金龜Potosiabrevitarsis(Lewis)和小青花金龜Oxycetoniajucunda(Faldermann)顯示出了較強(qiáng)的誘集力(李仲秀等,1995)。花的揮發(fā)物香葉醇、丁子香酚、鄰氨基苯甲酸甲酯和(Z)-3-己烯-1-醇對(duì)分布在歐洲大部分區(qū)域的植食性金龜子Phylloperthahorticola有誘集作用,其中雄蟲對(duì)(Z)-3-己烯-1-醇的反應(yīng)尤為強(qiáng)烈,黃色的誘捕器比灰色誘捕器能顯著增加誘集數(shù)量(Ruther,2004)。丙酸苯乙酯、丁子香酚和香葉醇(3∶7∶3)的混合物對(duì)日本麗金龜?shù)囊T最為有效,目前已被廣泛應(yīng)用于誘殺與監(jiān)測(Leal,1998)。這些篩選出來的兩性引誘劑成分,都是結(jié)構(gòu)比較簡單的天然化合物,由一些飽和的和不飽和的醛、醇和酯類物質(zhì)構(gòu)成,因此,這些物質(zhì)可以看作是植物釋放的利他素(kairomones),對(duì)金龜子取食、交配、產(chǎn)卵、棲息等行為起誘導(dǎo)作用(Visser,1986)。陳松筆等(2001)報(bào)道,采用日本金龜子誘劑組成物香葉醇、丁香酚和丙酸苯乙酯(3∶7∶3)以及日本金龜子性誘片組成的誘集物能夠誘集到蘋毛麗金龜成蟲,單日最大誘集量達(dá)12頭,但3種人工合成的單個(gè)植物揮發(fā)物對(duì)蘋毛麗金龜誘集能力還不清楚。本研究選擇了一些文獻(xiàn)報(bào)道的金龜子誘劑化合物成分,這其中的一些化合物對(duì)多種金龜甲都有引誘作用,有些成分單獨(dú)使用雖無引誘作用,但與其他化合物復(fù)合應(yīng)用,能提高誘集能力(Imaietal.,1997;Rutheretal.,2001,2002,2004;Imraietal.,2002;Reineckeetal.,2002),測定這些化合物EAG和嗅覺反應(yīng),旨在為開發(fā)相關(guān)引誘劑奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1培養(yǎng)梨花的溫度和光照供試蘋毛麗金龜于成蟲2009年4月8日采自秦皇島市昌黎縣城郊果園,置于溫度25±0.5℃;光照L∶D=16∶8,人工氣候箱中,用新鮮的梨樹花喂養(yǎng)。2009年4月9-11日用于觸角電位(electroantennograph,EAG)和嗅覺反應(yīng)測試。1.2配成、貯藏化合物的編號(hào)、名稱、純度和來源見表1。用色譜純正己烷(天津福晨化學(xué)試劑廠,下同)作溶劑,分別將每種化合物配成10μg/μL的溶液,貯藏于-20℃冰箱中備用。EAG測試時(shí)取各樣品溶液濃度為1μg/μL,劑量反應(yīng)測試時(shí),將樣品配成0.01,0.1,1和10μg/μL的溶液。1.3蘋毛麗金龜?shù)臇|南角位點(diǎn)研究在開始測定蘋毛麗金龜觸角EAG之前,作者進(jìn)行了預(yù)備試驗(yàn)。如圖1所示,將觸角鰓片用昆蟲針分離,將觸角M1尖端切除(1/10)與不切除測得的EAG反應(yīng)值無顯著性差異。因此采用觸角尖端不切除進(jìn)行蘋毛麗金龜觸角點(diǎn)位研究,將會(huì)節(jié)省很多測試工作的工作量。實(shí)際測定的EAG值看,如果不用昆蟲針分離觸角鰓片,測得的反應(yīng)值極弱,這是由于感受植物揮發(fā)物的嗅感器都分布在觸角鰓葉內(nèi)側(cè)面,3片鰓葉不分離的情況下,阻礙了嗅感器無法與揮發(fā)物接觸(路常寬和王曉勤,2009)。1.4活性物質(zhì)的檢測觸角電位儀(Syntech公司)包括多用EAG探頭、DAC-232雙通道數(shù)據(jù)采集控制器、MP-15微動(dòng)操作臺(tái)、CS-55刺激氣流控制器、雙目實(shí)體顯微鏡、EAG2000記錄分析軟件等,連續(xù)氣體流量為120mL/min,刺激氣體流量為20mL/min。向玻璃電極內(nèi)灌注0.9%NaCl電極液(Zhangetal.,1997),電極通過銀-氯化銀絲與SyntechUN-06交直流放大器連接,放大器信號(hào)輸出端與微機(jī)相連,用Spike軟件(Syntech公司)采集和分析數(shù)據(jù)。在解剖鏡下用眼科剪將昆蟲觸角從基部剪斷(圖1),觸角鰓片用昆蟲針分離,首先將鞭節(jié)F(約1/2)插入玻璃電極中,然后調(diào)節(jié)微動(dòng)旋鈕,使得觸角鰓片M1尖端(約1/5)插入另一端玻璃電極液內(nèi)。在此操作過程中,在向玻璃電極吸入電極液時(shí),注意防止產(chǎn)生氣泡,而影響測試效果。11種植物揮發(fā)物EAG測定方法:取10μL待測試樣品溶液滴加于濾紙條上(5mm×50mm),樣品濃度為1μg/μL。立即將濾紙條塞進(jìn)巴斯德管內(nèi),管口兩端用Parafilm膜封上直至用于刺激(加樣后1h以內(nèi))。同法取10μL色譜純正己烷滴加于濾紙條上作為對(duì)照。測試時(shí)刺激時(shí)間0.1s,刺激氣流體積2mL,兩次間隔刺激大于1min。測試樣品隨機(jī)選取,并與溶劑對(duì)照交替測試,測定樣品的EAG反應(yīng)值與正己烷EAG的差值作為觸角點(diǎn)位反應(yīng)值(表2)。在劑量反應(yīng)研究中,由于觸角的EAG反應(yīng)會(huì)隨著測試時(shí)間的延長而逐漸降低,為了消除觸角生理狀態(tài)變化帶來的影響,以100μg濃度為1μg/μL的順-3-己烯-1-醇作為標(biāo)準(zhǔn)參照刺激,對(duì)各測試樣品的刺激反應(yīng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。每次進(jìn)行樣品刺激前先進(jìn)行1次對(duì)照(正己烷)和標(biāo)準(zhǔn)參照刺激,然后測試3個(gè)樣品,再進(jìn)行對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)參照刺激。將兩次鄰近的標(biāo)準(zhǔn)參照刺激的EAG平均值減去兩次鄰近的對(duì)照刺激的EAG平均值作為標(biāo)準(zhǔn)參照值,其他樣品的EAG值減去對(duì)照的EAG平均值后再除以標(biāo)準(zhǔn)參照值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。1.5金龜子誘導(dǎo)物測試本部分研究僅對(duì)EAG測試中反應(yīng)值較為明確(>0.4mV)的4種化合物(順-3-己烯-1-醇、香葉醇、茴香腦和丁香酚)進(jìn)行Y型嗅覺儀測定。Y型嗅覺儀由玻璃管制成,外徑為6cm,主臂長為30cm,兩測試臂長均為20cm,兩者的夾角為45°。不同濃度刺激樣品由正己烷配制而成,分別為0.1,1和10μg/μL。將10μL刺激樣品滴加在濾紙條上,放入某一測試臂中,將含有相同體積正己烷的濾紙條放入另一測試臂中作為對(duì)照。此裝置以氣泵為動(dòng)力,空氣流經(jīng)活性炭和蒸餾水被過濾與加濕后,每臂空氣流量計(jì)調(diào)為300mL/min。由于周圍光強(qiáng)不均勻影響金龜子的趨性行為,把嗅覺儀放在用白布和鋼架制成的布帳(100cm×80cm×80cm)中,其內(nèi)正上方放一個(gè)白熾燈(40W),盡量保持測試中光強(qiáng)一致。在實(shí)驗(yàn)過程中室溫保持24±1℃。開啟氣泵,放入1頭蘋毛麗金龜,觀察并記錄其對(duì)測試臂和對(duì)照臂的選擇情況。如果蘋毛麗金龜5min內(nèi)沒有作出選擇,則記為無反應(yīng)。每個(gè)刺激樣品測試20頭成蟲后,用蘸乙醇脫脂棉擦拭嗅覺儀內(nèi)壁,蒸餾水沖洗,用電吹風(fēng)吹干,同時(shí)更換新的濾紙條。每樣品重復(fù)5次,每重復(fù)用蟲20頭。每種樣品測定結(jié)束后,測定儀用乙醇擦拭、蒸餾水沖洗,放入180℃的烘箱內(nèi)2h。同一種樣品按照濃度由低到高的順序進(jìn)行測定,不同樣品的測定順序是隨機(jī)的。反應(yīng)百分率采用校正值,即反應(yīng)蟲數(shù)與對(duì)照反應(yīng)數(shù)的差比上測試蟲數(shù)。1.6計(jì)算機(jī)軟件分析蘋毛麗金龜?shù)腅AG反應(yīng)值和行為測試結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理都采用Duncan氏新復(fù)極差法(LSR)比較檢驗(yàn)差異顯著性(P<0.05),統(tǒng)計(jì)分析軟件為DPS3.01。2結(jié)果與分析2.1香葉醇、香葉醇、丁香酚和香腦嘴唇電位反應(yīng)11種化合物中,全部對(duì)蘋毛麗金龜雌雄觸角產(chǎn)生觸角電位反應(yīng),順-3-己烯-1-醇、香葉醇、丁香酚和茴香腦觸角電位反應(yīng)值明確(表2),其他7種化合物反應(yīng)值較弱。利用反應(yīng)值明確的幾種化合物進(jìn)行劑量反應(yīng)研究。如圖2所示,在相同刺激劑量下,雌雄間EAG無顯著性差異,EAG反應(yīng)強(qiáng)度與化合物的劑量呈正相關(guān)。2.3率呈增長率通過Y型嗅覺儀研究發(fā)現(xiàn),隨著刺激劑量增加,雌雄校正反應(yīng)百分率呈現(xiàn)增加趨勢。但香葉醇100μg引起的嗅覺校正反應(yīng)百分率都達(dá)到了70%以上,引誘效果較好,其他測試樣品低劑量和高劑量無顯著差異,說明增加劑量后,并沒有引起引誘效果的顯著增加。3順-3-己烯-1-醇對(duì)蘋毛麗金龜?shù)男袨檎T導(dǎo)作用在本研究測試的11種化合物中,苯乙醇、苯乙醛、順-2-己烯-1-醇、反-2-己烯-1-醇、反-2-己烯醛、順-3-己烯乙酸酯、丙酸苯乙酯7種化合物對(duì)蘋毛麗金龜雌雄觸角EAG反應(yīng)值較弱,而順-3-己烯-1-醇、香葉醇、茴香腦、丁香酚4種化合物有明確的EAG反應(yīng)值。采用Y型嗅覺儀測定表明,4種化合物雌雄間嗅覺反應(yīng)百分率沒有顯著性差異。香葉醇1和10μg刺激劑量間校正反應(yīng)百分率40%～54%之間,無顯著性差異;丁香酚雌雄校正反應(yīng)百分率在42%～60%之間,多重比較分析表明1,10,100μg劑量之間校正反應(yīng)百分率差異不顯著,說明較低劑量的丁香酚就能對(duì)蘋毛麗金龜雌雄成蟲產(chǎn)生引誘作用,這對(duì)將來野外組合引誘實(shí)驗(yàn)具有幫助。茴香腦1,10,100μg3個(gè)劑量校正反應(yīng)百分率在45%～58%之間,雌雄蟲間無差異,不同劑量間也沒有差異;順-3-己烯-1-醇3個(gè)劑量校正反應(yīng)百分率在41%～57%之間,雌雄蟲間無差異,不同劑量間也沒有差異。以上4種化合物隨著刺激劑量增加,反應(yīng)值呈遞增趨勢。但香葉醇1和10μg刺激劑量與100μg刺激劑量校正反應(yīng)百分率有顯著性差異,而更高的刺激劑量(如1000μg)是否能顯著提高校正反應(yīng)百分率還有待于進(jìn)一步研究。室內(nèi)電生理實(shí)驗(yàn)和嗅覺測定都表明順-3-己烯-1-醇對(duì)蘋毛麗金龜具有活性,但還不清楚其行為學(xué)作用。Melolonthahippocastani,Melolonthamelolontha和Phylloperthahorticola3種金龜子利用順-3-己烯-1-醇作為交配過程中定位寄主的線索(Reineckeetal.,2002;Rutheretal.,2002,Ruther,2004)。這一發(fā)現(xiàn)在鞘翅目幾丁蟲科害蟲花曲柳窄幾丁的研究上也有報(bào)道(deGrootetal.,2008)。在蘋毛麗金龜揚(yáng)飛的第二階段,可通過取食植物葉片和花誘導(dǎo)產(chǎn)生該種化合物,但還不清楚剛剛羽化的雌成蟲是否損害寄主植物釋放順-3-己烯-1-醇來引誘雄性成蟲。從室內(nèi)的嗅覺測定結(jié)果看,蘋毛麗金龜雌雄對(duì)順-3-己烯-1-醇引誘并無差異,如果象前述的3種金龜子一樣,借助順-3-己烯-1-醇定位寄主,近距離的雄蟲定位雌蟲可能需要依靠性信息。蘋毛麗金龜雌雄成蟲觸角具有性二型現(xiàn)象,雄蟲感受器數(shù)量是雄蟲的1.8倍(路常寬和王曉勤,2009),這可能是雄蟲保持寄主搜索和雌蟲定位的進(jìn)化證據(jù)之一。孫凡等(2006)研究發(fā)現(xiàn),東北大黑鰓金龜雌雄成蟲對(duì)反-2-己烯醛和5-甲基-1-己醇都能產(chǎn)生EAG反應(yīng),且對(duì)-5-甲基-1-己醇的反應(yīng)強(qiáng)度略高于對(duì)反-2-己烯醛的反應(yīng)強(qiáng)度;雌蟲對(duì)這些氣味的EAG靈敏度高于雄蟲,而行為測試顯示反-2-己烯醛對(duì)該成蟲具有定向作用,5-甲基-1-己醇對(duì)成蟲無顯著的行為作用。從以上報(bào)道的文獻(xiàn)看,金龜子利用植物揮發(fā)物定向的行為反應(yīng)機(jī)制是較為復(fù)雜的。目前僅在鰓金龜和麗金龜科中發(fā)現(xiàn)雄蟲對(duì)葉醇表現(xiàn)為更強(qiáng)的趨性,Hansson等(1999)證實(shí)了分異發(fā)麗金龜Phylloperthadiversa擁有調(diào)控綠葉揮發(fā)物的特化嗅感細(xì)胞,這表明這些化合物對(duì)該種金龜子行為調(diào)控具有重要作用。但Larsson等(2003)的研究認(rèn)為一種非洲果實(shí)金龜子PachnodamarginataDrury對(duì)包括順-3-己烯-1-醇在內(nèi)的4種綠葉醇都沒