2024版高考生物一輪總復習第10單元生物技術與工程第40課基因工程教師用書

第40課基因工程?學業(yè)質(zhì)量水平要求?1．結合具體的應用實例，說明基因工程技術的原理、工具和操作過程。(科學思維)2．通過對比分析蛋白質(zhì)工程和傳統(tǒng)基因工程的不同及應用價值。(科學思維、社會責任)3．通過實際操作學會細胞中DNA的提取和鑒定方法，學習PCR技術原理和操作。(科學思維、科學探究)考點一重組DNA技術的基本工具1．基因工程的概念(1)手段：按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術，賦予生物新的遺傳特性。(2)目的：創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。(3)水平：分子水平。(4)基礎：生物化學、分子生物學和微生物學等學科。2．基因工程的基本工具(1)限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術刀”(2)DNA連接酶——“分子縫合針”(3)基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”①作用：將外源基因送入受體細胞中。②種類：質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒等。③條件：a．具有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA插入其中。b．能在受體細胞中進行自我復制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復制。c．具有標記基因，便于重組DNA分子的篩選。1．重組DNA技術所需要的工具酶有限制酶、DNA連接酶和載體。 (×)2．切割質(zhì)粒的限制性內(nèi)切核酸酶均能特異性地識別6個核苷酸序列。 (×)3．DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事。 (×)4．DNA連接酶可以連接目的基因與載體的氫鍵，形成重組DNA。 (×)5．載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選的標記基因。 (×)1．基因工程的理論基礎2．限制酶的選擇方法根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點、質(zhì)粒上的限制酶切割位點以及是否破壞目的基因和標記基因來確定限制酶的種類。(1)應選擇酶切位點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ；不能選擇酶切位點位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。(2)為避免目的基因及質(zhì)粒的自身環(huán)化、反向連接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和質(zhì)粒(雙酶切)，如圖甲可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切割位點)。(3)切割質(zhì)粒的限制酶不能同時切開質(zhì)粒上的所有標記基因，即至少要保留一個標記基因，以用于重組DNA的鑒定和選擇，如圖乙中的質(zhì)粒不能使用SmaⅠ切割。3．標記基因的作用：用于檢測目的基因是否導入受體細胞?？枷?|基因工程中工具酶的分析1．下表為常用的限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶)及其識別序列和切割位點，由此推斷以下說法中，錯誤的是()限制酶名稱識別序列和切割位點限制酶名稱識別序列和切割位點BamHⅠG↓GATCCKpnⅠGGTAC↓CEcoRⅠC↓AATTCSau3AⅠ↓GATCHindⅡGTY↓RACSmaⅠCCC↓GGG(注：Y＝C或T，R＝A或G)A．HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶切割后形成平末端B．Sau3AⅠ限制酶的切割位點在識別序列的外部C．BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制酶切割后形成相同的黏性末端D．一種限制酶一定只能識別一種核苷酸序列D解析：HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶沿著中軸線切口切開，切割后形成平末端，A正確；Sau3AⅠ限制酶識別GATC序列，切割位點在識別序列的外部，B正確；BamHⅠ限制酶識別GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶識別GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC—，C正確；一種限制酶也可以識別多種核苷酸序列，如HindⅡ能識別GTYRAC序列，其中Y可以是C或T，R可以是A或G，D錯誤。2．下列關于DNA連接酶的相關敘述，正確的是()A．DNA連接酶需要模板，連接的是兩條鏈堿基對之間的氫鍵B．DNA連接酶連接的是黏性(平)末端兩條鏈主鏈上的磷酸和脫氧核糖C．T4DNA連接酶只能連接黏性末端兩條鏈主鏈上的磷酸和核糖D．E．coliDNA連接酶既能連接平末端，又能連接黏性末端B解析：DNA連接酶不需要模板，催化形成的是磷酸二酯鍵，A錯誤；DNA連接酶連接的是黏性(平)末端兩條鏈主鏈上的磷酸和脫氧核糖，使兩者之間形成磷酸二酯鍵，B正確；T4DNA連接酶既可以連接黏性末端，也可以連接平末端，連接的是兩條鏈主鏈上的磷酸和脫氧核糖，C錯誤；E．coliDNA連接酶只能連接黏性末端，D錯誤?？枷?|基因工程中的載體的判斷3．質(zhì)粒是基因工程中最常用的目的基因運載工具。下列有關敘述正確的是()A．質(zhì)粒是只存在于細菌細胞質(zhì)中能自主復制的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子B．在所有的質(zhì)粒上總能找到一個或多個限制酶切割位點C．攜帶目的基因的重組質(zhì)粒只有整合到宿主細胞的染色體DNA上才會隨后者的復制而復制D．質(zhì)粒上的抗性基因常作為標記基因供重組DNA的鑒定和選擇D解析：質(zhì)粒不只分布于原核生物中，在真核生物——酵母菌細胞內(nèi)也有分布，A錯誤；并不是所有的質(zhì)粒都能找到限制酶的切割位點而成為合適的運載目的基因的工具，B錯誤；重組質(zhì)粒進入受體細胞后，可以在細胞內(nèi)自我復制，也可以整合后復制，C錯誤；質(zhì)粒上抗性基因常作為標記基因，D正確?！疽族e分析】細胞膜上的載體與基因工程中的載體的兩個“不同”(1)化學本質(zhì)不同①細胞膜上的載體的化學成分是蛋白質(zhì)。②基因工程中的載體可能是物質(zhì)，如質(zhì)粒(DNA)，也可能是生物，如噬菌體、動植物病毒等。(2)功能不同①細胞膜上的載體的功能是協(xié)助細胞膜控制物質(zhì)進出細胞。②基因工程中的載體是一種“分子運輸車”，把目的基因?qū)胧荏w細胞?？键c二基因工程的基本操作程序1．目的基因的篩選與獲取(1)篩選合適的目的基因①目的基因：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產(chǎn)物等的基因。主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。②篩選目的基因的方法：從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。(2)利用PCR獲取和擴增目的基因①原理：DNA復制。②基本條件參與的組分在DNA復制中的作用高溫打開DNA雙鏈DNA母鏈提供DNA復制的模板4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料耐高溫的DNA聚合酶催化合成DNA子鏈2種引物使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸③擴增過程(3)構建基因文庫來獲取目的基因2．基因表達載體的構建——核心(1)構建基因表達載體的目的①使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。②使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。(2)基因表達載體的組成(3)基因表達載體的構建過程3．將目的基因?qū)胧荏w細胞類型方法說明特點植物細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA上→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→用農(nóng)桿菌侵染植物細胞→將目的基因整合到植物細胞的染色體DNA上→目的基因表達經(jīng)濟、有效，適用于雙子葉植物和裸子植物，尤其適用于雙子葉植物，但單子葉植物也獲得了成功花粉管通道法用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊簡便、經(jīng)濟，我國科學家獨創(chuàng)的一種方法動物細胞顯微注射技術將含有目的基因的表達載體→顯微注射到受精卵中→注射了目的基因的受精卵，經(jīng)胚胎早期培養(yǎng)后，移植到雌性動物的輸卵管或子宮內(nèi)→獲得具有新性狀的動物將目的基因?qū)雱游锛毎顬橛行У姆椒ㄎ⑸锛毎鸆a2+處理法Ca2+處理細胞→細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)→基因表達載體導入簡便、經(jīng)濟、有效4．目的基因的檢測與鑒定檢測水平檢測目的檢測方法分子水平目的基因是否插入到轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上RCR目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交個體水平轉(zhuǎn)基因生物是否表現(xiàn)出相應的特性如抗蟲、抗病的接種實驗1．目的基因就是指編碼蛋白質(zhì)的基因。 (×)2．用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列。 (√)3．基因工程操作的核心步驟是目的基因的獲取。 (×)4．基因表達載體中含有啟動子和密碼子。 (×)5．抗蟲基因即使成功地插入植物細胞染色體DNA上也未必能正常表達。 (√)6．從大腸桿菌細胞中獲得人胰島素基因的mRNA，說明目的基因完成了表達。 (×)【教材細節(jié)命題】1．(選擇性必修3P77相關信息改編)Bt抗蟲蛋白怎樣造成害蟲死亡？當Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細胞的特異性受體結合，導致細胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。2．(選擇性必修3P77相關信息改編)如何理解PCR的引物？引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。用于PCR的引物長度通常為20～30個核苷酸。1．PCR技術與DNA復制的比較2．基因表達載體的構建(1)根據(jù)質(zhì)粒的特點確定限制酶的種類(2)根據(jù)Ti質(zhì)粒的T-DNA片段選擇限制酶，圖中甲、乙、丁Ti質(zhì)粒均不宜選取，而丙Ti質(zhì)粒宜選取(設切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ)。3．篩選出含有目的基因的受體細胞(1)原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會導致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入了四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。(2)被轉(zhuǎn)化的細菌有三種：含環(huán)狀目的基因的細菌、含重組質(zhì)粒的細菌、含質(zhì)粒的細菌。(3)篩選方法：將細菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組質(zhì)粒的細菌和含質(zhì)粒的細菌，如上圖1、2、3、4、5菌落。再利用滅菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如上圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如上圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進行培養(yǎng)?？枷?|PCR技術與應用分析1．(2021·湖北卷)某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應中非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是()A．增加模板DNA的量B．延長熱變性的時間C．延長延伸的時間D．提高復性的溫度D解析：增加模板DNA的量可以提高反應速度，但不能有效減少非特異性條帶，A錯誤；延長熱變性的時間和延長延伸的時間會影響變性延伸過程，但對于延伸中的配對影響不大，故不能有效減少非特異性條帶，B、C錯誤；非特異性產(chǎn)物增加的原因可能是復性溫度過低使引物與模板的結合位點增加，故可通過提高復性的溫度來減少反應中非特異性條帶的產(chǎn)生，D正確。2．新型冠狀病毒的檢測可以采用實時熒光RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應)的方法，RT-PCR的具體過程如圖。下列有關敘述錯誤的是()A．過程①以mRNA為模板合成單鏈DNAB．過程②③擬對單鏈cDNA進行n次循環(huán)的擴增，理論上需要n個引物BC．該技術用于對某些微量RNA病毒的檢測，可提高檢測的靈敏度D．游離的脫氧核苷酸只能從引物的3′端開始連接B解析：過程①是由mRNA形成單鏈DNA的過程，表示逆轉(zhuǎn)錄，A正確；決定實時熒光RT-PCR擴增片段的是引物，過程②③擬對單鏈cDNA進行n次循環(huán)的擴增，根據(jù)DNA分子半保留復制特點可知，該過程理論上至少需要2n-1個引物B，B錯誤；利用實時熒光RT-PCR技術對某些微量RNA病毒進行檢測時可提高檢測的靈敏度，是因為增加了待測RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生DNA的數(shù)量(或濃度)，便于檢測，C正確；游離的脫氧核苷酸只能從引物的3′端開始連接，D正確?！疽族e提醒】PCR過程的兩點提醒(1)復性不一定均為引物與DNA模板結合。復性時，引物與DNA模板的結合是隨機的，也存在DNA解開的兩條鏈的結合。(2)PCR反應的結果不都是所需的DNA片段。因為第一次循環(huán)得到的DNA片段只有一種引物，比所需的DNA片段要長，從第二次循環(huán)才出現(xiàn)所需的DNA片段，這樣的片段存在兩種引物?？枷?|基因表達載體的構建3．下圖是利用基因工程技術培育轉(zhuǎn)基因植物，生產(chǎn)可食用疫苗的部分過程示意圖，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ為四種限制性內(nèi)切核酸酶。下列說法錯誤的是()A．圖示過程是基因工程的核心步驟B．表達載體構建時需要用到限制酶SmaⅠC．抗卡那霉素基因的存在有利于將含有抗原基因的細胞篩選出來D．除圖示組成外，表達載體中還應該含有啟動子和終止子等結構B解析：題圖過程為基因表達載體的構建過程，是基因工程中的核心步驟，A正確。構建過程中需要將目的基因完整切割下來，此時要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，B錯誤?？箍敲顾鼗蚴菢擞浕颍康氖潜阌阼b定和篩選含有目的基因的細胞，C正確?；虮磉_載體包括復制原點、啟動子、目的基因、終止子和標記基因等，D正確。4．利用某目的基因(圖甲)和P1噬菌體載體(圖乙)構建重組DNA。限制性內(nèi)切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位點分別如下圖所示(已知這三種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端不同)。下列分析錯誤的是()A．構建重組DNA時，可用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體B．構建重組DNA時，可用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體C．圖乙中的P1噬菌體載體只用EcoRⅠ切割后，含有兩個游離的磷酸基團D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體，再用DNA連接酶連接，只能產(chǎn)生一種重組DNAD解析：構建重組DNA時，如果用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體，目的基因兩端將形成不同的黏性末端，同樣P1噬菌體載體也形成這兩種黏性末端，因此它們可構成重組DNA，A正確；分析圖甲，HindⅢ的酶切位點在第二個EcoRⅠ酶切位點的左側(cè)，因此用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段，目的基因兩端將形成不同的黏性末端，同樣用EcoRⅠ和HindⅢ切割P1噬菌體載體也形成這兩種黏性末端，因此它們可構成重組DNA，B正確；P1噬菌體載體為環(huán)狀DNA，其上只含有一個EcoRⅠ的酶切位點，因此用EcoRⅠ切割后，該環(huán)狀DNA分子變?yōu)殒湢頓NA分子，因每條DNA單鏈各含有一個游離的磷酸基團，故切割后含有兩個游離的磷酸基團，C正確；用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體后形成的黏性末端相同，可正向連接或反向連接，故可產(chǎn)生兩種重組DNA，D錯誤。【易錯提醒】(1)基因工程中的基因表達載體≠載體：基因表達載體與載體相比增加了目的基因。(2)目的基因插入位點不是隨意的：基因表達載體需要啟動子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應插入啟動子和終止子之間的部位，若目的基因插入啟動子部位，啟動子將失去原功能。(3)切割目的基因和載體并非只能用同一種限制酶。如果兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA連接酶的作用下目的基因與載體也可以連接起來。考向3|將目的基因?qū)胧荏w細胞及目的基因的檢測與鑒定的判斷5．菊花是一種雙子葉植物，易感桃蚜。桃蚜不但直接影響植物生長，還是多種植物病毒的傳播媒介。雪花蓮凝集素基因GNA的表達產(chǎn)物能有效抑制桃蚜生長，某科研團隊運用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得了轉(zhuǎn)GNA基因菊花。下列有關敘述錯誤的是()A．受體細胞可以選擇菊花葉片細胞或桃蚜細胞B．將目的基因GNA插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上構建表達載體C．可以將菊花葉片取下與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細胞D．應用抗蟲接種實驗，檢測轉(zhuǎn)基因菊花對桃蚜的抗性及抗性的程度A解析：要獲得轉(zhuǎn)基因菊花，可以選擇菊花葉片細胞作為受體細胞，但不能選擇桃蚜細胞作為受體細胞，A錯誤；Ti質(zhì)粒的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞中，并且整合到受體細胞染色體的DNA上，根據(jù)這一特點，構建表達載體時，應該將目的基因GNA插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上，B正確；可以將菊花葉片取下與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細胞，并再生成植株，C正確；已知雪花蓮凝集素基因GNA的表達產(chǎn)物能有效抑制桃蚜生長，故應用抗蟲接種實驗，檢測轉(zhuǎn)基因菊花對桃蚜的抗性及抗性的程度，D正確。6．在全球氣候變暖和水資源缺乏加劇的情況下，保障我國“糧食安全”問題尤為重要。玉米是重要的糧食作物，其葉片細胞中的P蛋白是一種水通道蛋白，由P基因編碼，在植物生長發(fā)育過程中對水分的吸收具有重要的調(diào)節(jié)功能。為了探究P蛋白的超量表達對玉米生長的影響，科研人員進行了超量表達P蛋白轉(zhuǎn)基因玉米的生理特性等研究。超量表達P蛋白轉(zhuǎn)基因玉米獲得與鑒定在超量表達P基因載體的構建中，所用DNA片段和Ti質(zhì)粒的酶切位點如圖1所示，P蛋白在玉米株系的表達量如圖2所示。回答下列問題：(1)強啟動子是一段有特殊結構的DNA片段，能被______________識別并結合，驅(qū)動基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄。為使P基因在玉米植株中超量表達，應優(yōu)先選用________________酶組合，將片段和Ti質(zhì)粒切開后構建重組表達載體。T-DNA在該實驗中的作用是____________________________________。(2)將農(nóng)桿菌浸泡過的玉米愈傷組織進行植物組織培養(yǎng)，培養(yǎng)基中需加入________進行篩選，篩選出的愈傷組織________形成叢芽，最終獲得多個轉(zhuǎn)基因玉米株系。(3)據(jù)圖2分析，選擇a1、a2、a3玉米株系，作為超量表達P蛋白轉(zhuǎn)基因玉米的生理特性研究的實驗材料，理由是________________________________________________________________________________________________________。解析：(1)根據(jù)“驅(qū)動基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄”可知，強啟動子能被RNA聚合酶識別并結合。為使P基因在玉米植株中超量表達，應確保強啟動子和P基因不被破壞，故應優(yōu)先選用BamHⅠ和SacⅠ酶組合，將片段和Ti質(zhì)粒切開后構建重組表達載體。T-DNA在該實驗中的作用是將強啟動子和P基因帶入玉米細胞并整合到玉米細胞的染色體DNA上。(2)由圖1可知，潮霉素抗性基因位于Ti質(zhì)粒的T-DNA上，能隨T-DNA整合到玉米細胞的染色體上，故將農(nóng)桿菌浸泡過的玉米愈傷組織進行植物組織培養(yǎng)，培養(yǎng)基中需加入潮霉素進行篩選，篩選出的愈傷組織可(再)分化形成叢芽，最終獲得多個轉(zhuǎn)基因玉米株系。(3)據(jù)圖2分析，a1、a2、a3玉米株系的P蛋白表達量顯著高于野生型玉米，故可以選擇a1、a2、a3玉米株系，作為超量表達P蛋白轉(zhuǎn)基因玉米的生理特性研究的實驗材料。答案：(1)RNA聚合酶BamHⅠ和SacⅠ將強啟動子和P基因帶入玉米細胞并整合到玉米細胞染色體DNA上(2)潮霉素(再)分化(3)a1、a2、a3玉米株系的P蛋白表達量顯著高于野生型玉米考點三基因工程的應用和蛋白質(zhì)工程1．基因工程的應用(1)基因工程在農(nóng)牧業(yè)方面的應用：轉(zhuǎn)基因抗蟲植物、轉(zhuǎn)基因抗病植物、轉(zhuǎn)基因抗除草劑植物、改良植物的品質(zhì)、提高動物的生長速率、改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)。(2)基因工程在醫(yī)藥衛(wèi)生領域的應用①對微生物或動植物的細胞進行基因改造，使它們生產(chǎn)藥物。②讓哺乳動物批量生產(chǎn)藥物。③嘗試將建立移植器官工廠的設想成為現(xiàn)實。(3)在食品工業(yè)方面的應用：利用基因工程菌生產(chǎn)食品工業(yè)用酶、氨基酸和維生素等。2．蛋白質(zhì)工程的原理和應用(1)蛋白質(zhì)工程的概念(2)蛋白質(zhì)工程的基本原理(3)蛋白質(zhì)工程的應用①醫(yī)藥工業(yè)方面：研發(fā)藥物，如延長干擾素的保存時間；降低小鼠單克隆抗體誘發(fā)免疫反應的強度。②其他工業(yè)方面：改進酶的性能或開發(fā)新的工業(yè)用酶。③農(nóng)業(yè)方面：通過改造某些參與調(diào)控光合作用的酶，增加糧食產(chǎn)量；改造微生物蛋白質(zhì)的結構，設計優(yōu)良微生物農(nóng)藥，防治病蟲害。1．來自蘇云金桿菌的Bt抗蟲蛋白基因只能應用于棉花。 (×)2．“轉(zhuǎn)基因抗蟲植物”也可以用于抵抗各種植物疾病。 (×)3．干擾素是我國批準生產(chǎn)的第一個基因工程藥物。 (√)4．用基因工程的方法，使得外源基因得到高效表達的菌類一般稱為基因工程菌。 (√)5．對蛋白質(zhì)的改造是通過直接改造相應的mRNA來實現(xiàn)的。 (×)1．乳腺生物反應器與工程菌生產(chǎn)藥物的區(qū)別比較內(nèi)容乳腺生物反應器工程菌含義指將外源基因在哺乳動物的乳腺中特異表達，利用動物的乳腺組織生產(chǎn)藥物蛋白指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的菌類基因表達合成的藥物蛋白與天然蛋白質(zhì)相同微生物合成的藥物蛋白可能沒有活性受體細胞動物受精卵微生物細胞目的基因?qū)敕绞斤@微注射法感受態(tài)細胞法生產(chǎn)條件不需嚴格滅菌；溫度等外界條件對其影響不大需嚴格滅菌，嚴格控制工程菌所需的溫度、pH、營養(yǎng)物質(zhì)濃度等外界條件藥物提取從動物乳汁中提取從微生物細胞或其培養(yǎng)液中提取2．蛋白質(zhì)工程與基因工程的區(qū)別和聯(lián)系考向1|基因工程的應用1．(2022·江蘇卷)采用基因工程技術調(diào)控植物激素代謝，可實現(xiàn)作物改良。下列相關敘述不合理的是()A．用特異啟動子誘導表達iaaM(生長素合成基因)可獲得無子果實B．大量表達ipt(細胞分裂素合成關鍵基因)可抑制芽的分化C．提高ga2ox(氧化赤霉素的酶基因)的表達水平可獲得矮化品種D．在果實中表達acs(乙烯合成關鍵酶基因)的反義基因可延遲果實成熟B解析：生長素能促進果實發(fā)育，用特異啟動子誘導表達iaaM(生長素合成基因)可獲得無子果實，A正確；大量表達ipt(細胞分裂素合成關鍵基因)，細胞分裂素含量升高，細胞分裂素與生長素的比值較高時，有利于芽的分化，B錯誤；赤霉素能促進細胞伸長，從而引起莖稈伸長和植物增高，提高ga2ox(氧化赤霉素的酶基因)的表達水平使赤霉素含量降低從而能獲得矮化品種，C正確；乙烯有催熟作用，在果實中表達acs(乙烯合成關鍵酶基因)的反義基因，即抑制乙烯的合成，果實成熟會延遲，D正確?？枷?|蛋白質(zhì)工程的原理與應用分析2．(2021·廣東卷)非細胞合成技術是一種運用合成生物學方法，在細胞外構建多酶催化體系，獲得目標產(chǎn)物的新技術，其核心是各種酶基因的挖掘、表達等。中國科學家設計了4步酶促反應的非細胞合成路線，可直接用淀粉生產(chǎn)肌醇(重要的醫(yī)藥食品原料)，以期解決高溫強酸水解方法造成的嚴重污染問題，并可以提高產(chǎn)率?；卮鹣铝袉栴}：(1)研究人員采用PCR技術從土壤微生物基因組中擴增得到目標酶基因。此外，獲得酶基因的方法還有_____________________________________________________________________________________________________________________(答出兩種即可)。(2)高質(zhì)量的DNA模板是成功擴增出目的基因的前提條件之一。在制備高質(zhì)量DNA模板時必須除去蛋白，方法有___________________________________________________________________________________________________________(答出兩種即可)。(3)研究人員使用大腸桿菌BL21作為受體細胞、pET20b為表達載體分別進行4種酶的表達。表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌時，首先應制備____________細胞。為了檢測目的基因是否成功表達出酶蛋白，需要采用的方法有______________。(4)依如圖所示流程，在一定的溫度、pH等條件下，將4種酶與可溶性淀粉溶液混合組成一個反應體系。若這些酶最適反應條件不同，可能導致的結果是______________________________________________________________________________________________________________________________________。在分子水平上，可以通過改變__________，從而改變蛋白質(zhì)的結構，實現(xiàn)對酶特性的改造和優(yōu)化。解析：(1)目前獲取目的基因常用的方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增、用化學方法人工合成等。(2)制備高質(zhì)量DNA模板時，可直接在濾液中加入蛋白酶分解蛋白質(zhì)，而不破壞DNA。中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，當鹽濃度較高時，蛋白質(zhì)的溶解度下降并析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析。利用DNA對高溫的耐受性，嚴格控制溫度范圍，使蛋白質(zhì)變性沉淀而DNA分子不發(fā)生變性，可將DNA與蛋白質(zhì)分離。(3)將表達載體導入大腸桿菌細胞最常用的轉(zhuǎn)化方法是首先用Ca2+處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，這種細胞稱為感受態(tài)細胞。然后將重組DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細胞混合，在一定的溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化過程。為了檢測目的基因是否表達出相關的酶蛋白，可以從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應的抗體進行抗原—抗體雜交，若有雜交帶出現(xiàn)，表明目的基因已表達出蛋白質(zhì)產(chǎn)品。(4)酶的作用條件較溫和，在溫度過高、過酸、過堿的環(huán)境中會失活，不同酶的最適溫度、最適pH一般不同，將4種酶放在同一體系中，控制溫度、pH等條件一致，則部分酶可能會因溫度或者pH不適宜而失活，不能達到實驗目的，即無法獲得肌醇?；蛑笇У鞍踪|(zhì)的合成，可以通過改造酶基因的結構，從而改變蛋白質(zhì)的結構，進而實現(xiàn)對酶特性的改造和優(yōu)化。答案：(1)從基因文庫中獲取、用化學方法人工合成(2)蛋白酶水解法、鹽析法、60～75℃恒溫水浴法(3)感受態(tài)抗原—抗體雜交(4)部分酶失活，無法獲得肌醇基因結構【技法總結】基因工程與蛋白質(zhì)工程的判斷方法考點四(探究·實踐)DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴增及電泳鑒定1．DNA的粗提取與鑒定(1)實驗原理(2)實驗步驟2．DNA片段的擴增及電泳鑒定(1)實驗原理①PCR原理：利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合。②電泳：DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。③PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。(2)實驗步驟(3)DNA的測定：凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300_nm的紫外燈下被檢測出來。1．DNA的粗提取與鑒定的注意事項(1)加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。(2)本實驗不能用哺乳動物成熟的紅細胞作為實驗材料，原因是哺乳動物成熟的紅細胞無細胞核(無DNA)?？蛇x用雞血細胞作為材料。(3)鑒定DNA時，一支試管為對照組，另一支試管為實驗組。兩支試管中都先加物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液；在實驗組試管中加DNA絲狀物，對照組不加；加入二苯胺試劑后沸水浴加熱。結果可以看到加DNA絲狀物的試管呈現(xiàn)藍色，對照組無色。如果實驗組藍色較淺，說明提取出的DNA量太少。2．DNA片段的擴增及電泳鑒定(1)為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。(2)該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在－20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。(3)在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換，避免試劑的污染。(4)在進行操作時，一定要戴好一次性手套。(5)觀察DNA帶的分布及粗細程度來評價擴增的效果?？枷?|DNA粗提取與鑒定1．(2022·山東卷)關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法錯誤的是()A．過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進行是為了防止DNA降解B．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀C．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍色D．粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)B解析：低溫時，DNA酶的活性較低，過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進行是為了防止DNA降解，A正確；離心研磨液是為了使細胞碎片沉淀，B錯誤；在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍色，C正確；某些不溶于酒精的蛋白質(zhì)，在95%的冷酒精中與DNA同時析出，故粗提取的DNA中可能含有少量蛋白質(zhì)，D正確。2．下圖是“DNA的粗提取和鑒定”實驗中幾個重要操作的示意圖，下列敘述錯誤的是()A．圖①的原理是DNA不溶于酒精，某些蛋白質(zhì)可溶于酒精B．圖①和圖③都需用玻棒沿一個方向輕緩攪拌，以防止破壞DNAC．若圖③操作后接圖②操作，則DNA留在濾液中D．若圖④操作后接圖②操作，則DNA留在紗布上B解析：DNA不溶于酒精，95%的冷酒精凝集效果最佳，所以圖①的原理是DNA不溶于酒精，某些蛋白質(zhì)可溶于酒精，以便除去溶于酒精的雜質(zhì)，提取含雜質(zhì)較少(或較純凈)的DNA，A正確；圖①玻棒攪拌，目的是提取出含雜質(zhì)較少的DNA，圖③玻棒攪拌，目的是溶解細胞核內(nèi)的DNA，B錯誤；圖③操作是加入蒸餾水，破碎細胞，圖②操作是過濾，獲取含DNA的濾液，使DNA留在濾液中，C正確；圖④操作是去除濾液中雜質(zhì)，析出DNA，圖②操作是過濾，將DNA留在紗布上，D正確?？枷?|DNA片段的擴增及電泳鑒定3．在基因工程操作過程中，科研人員利用識別兩種不同序列的限制酶(R1和R2)處理基因載體，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結果如下圖所示。以下相關敘述中錯誤的是()A．該載體最可能為環(huán)狀DNA分子B．兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點C．限制酶R1與R2的切點最短相距約200bpD．限制酶作用位點會導致氫鍵和肽鍵斷裂D解析：當僅用一種限制酶切割載體時，僅產(chǎn)生一種長度的DNA片段，因此該載體最有可能為環(huán)狀DNA分子，A正確；當僅用一種限制酶切割載體時，兩種限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段等長，而兩種限制酶同時切割時則產(chǎn)生兩種長度的DNA片段，所以兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點，B正確；兩種限制酶同時切割時則產(chǎn)生600bp和200bp兩種長度的DNA片段，所以兩種限制酶的酶切位點至少相距200bp，C正確；限制酶切割DNA分子，破壞的是作用位點上兩個脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵，D錯誤。4．人體內(nèi)一些正常或異常細胞脫落破碎后，其DNA會以游離的形式存在于血液中，稱為cfDNA。近幾年，結合PCR及電泳鑒定、DNA測序等技術，cfDNA在臨床上得到了廣泛應用。下列相關說法錯誤的是()A．PCR反應中設置不同的溫度是為了使DNA聚合酶催化不同的反應B．在瓊脂糖凝膠中，cfDNA的遷移速率與cfDNA分子的大小、構象等有關C．在進行電泳時，要預留一個加樣孔，加入指示分子大小的標準參照物D．對cfDNA進行檢測，可以用于腫瘤的早期篩查A解析：PCR反應中溫度的周期性改變是為了解旋變性、復性、延伸，A錯誤；分子的大小、形態(tài)，凝膠的種類、密度，電泳的電壓大小等都會影響分子遷移速率，B正確；在進行電泳時，要預留一個加樣孔，加入指示分子大小的標準參照物，C正確；cfDNA是人體內(nèi)一些正?；虍惓＜毎撀淦扑楹笮纬傻挠坞xDNA，所以可通過檢測cfDNA中的相關基因，判斷其來自正常或異常細胞，并進行癌癥的篩查，D正確?！久}動態(tài)】針對人類生產(chǎn)或生活的某一需求，在基因工程中設置真實情境考查基因工程的操作工具、操作程序，特別是基因工程的應用。難度高檔，常以非選擇題形式呈現(xiàn)。1．(2022·河北卷)蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)化是作物抗蟲育種的新途徑。某研究團隊將胰蛋白酶抑制劑(NaPI)和胰凝乳蛋白酶抑制劑(StPin1A)的基因單獨或共同轉(zhuǎn)化棉花，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。回答下列問題：(1)蛋白酶抑制劑的抗蟲機制是___________________________________________________________________________________________________________。(2)____________是實施基因工程的核心。(3)利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法時，必須將目的基因插入質(zhì)粒的________上，此方法的不足之處是________________________________________________________。(4)為檢測目的基因在受體細胞基因組中的整合及其轉(zhuǎn)錄和翻譯，可采用的檢測技術有____________________(寫出兩點即可)。(5)確認抗蟲基因在受體細胞中穩(wěn)定表達后，還需進一步做抗蟲的________以鑒定其抗性程度。圖為三種不同遺傳操作產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因棉花抗蟲實驗結果，據(jù)結果分析__________(填“NaPI”“StPin1A”或“NaPI＋StPin1A”)轉(zhuǎn)基因棉花的抗蟲效果最佳，其原因是_________________________________________________________________________________________________________________。(6)基因突變可產(chǎn)生新的等位基因，在自然選擇的作用下，昆蟲種群的基因頻率會發(fā)生________，導致昆蟲朝著一定的方向不斷進化。據(jù)此推測，被蛋白抑制劑基因作物長期選擇后，某些昆蟲具有了抗蛋白酶抑制劑的能力，其分子機制可能是______________________________________________________________________________________________________________________(寫出兩點即可)。解析：(1)胰蛋白酶抑制劑和胰凝乳蛋白酶抑制劑為兩種消化酶，蛋白酶抑制劑的抗蟲機制是阻斷或減弱消化酶，導致害蟲無法對外來蛋白起消化作用而發(fā)育異?；蛩劳?。(2)基因表達載體的構建是基因工程的核心步驟。(3)農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞，并且整合到受體細胞的染色體DNA上。根據(jù)農(nóng)桿菌的這一特點，如果將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以把目的基因整合到植物細胞中染色體的DNA上，其不足之處是該方法不適用于大多數(shù)單子葉植物。(4)為檢測目的基因在受體細胞基因組中的整合及其轉(zhuǎn)錄和翻譯，可采用的檢測技術有DNA分子雜交技術、分子雜交技術、抗原—抗體雜交技術。(5)欲確定抗蟲基因在蟲體內(nèi)是否表達，在個體水平上需要做抗蟲接種實驗。與對照組相比，導入NaPI和StPin1A的蟲體質(zhì)量最小，且每株棉鈴數(shù)最多。(6)在自然選擇的作用下，昆蟲種群的基因頻率會發(fā)生定向改變。被蛋白質(zhì)酶抑制劑轉(zhuǎn)基因作物長期選擇后，某些昆蟲具有了抗蛋白酶抑制劑的能力，其分子機制可能是昆蟲發(fā)生基因突變后，產(chǎn)生了抗蛋白酶抑制劑基因，在蛋白酶抑制劑的作用下，抗性基因頻率逐漸提高，從而增強了其抗蛋白酶抑制劑的能力；蛋白酶抑制劑基因發(fā)生突變后不能編碼出蛋白酶抑制劑。答案：(1)阻斷或減弱消化酶的作用，導致害蟲無法對外來蛋白有消化作用而發(fā)育異?；蛩劳?2)基因表達載體的構建(3)T-DNA農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法適用于大多數(shù)雙子葉植物和裸子植物，不適用于單子葉植物(4)DNA分子雜交技術、分子雜交技術、抗原—抗體雜交技術(5)接種實驗NaPI＋StPin1A與對照組相比，導入NaPI和StPin1A的蟲體質(zhì)量最小，且每株棉鈴數(shù)最多(6)定向改變昆蟲發(fā)生基因突變后，產(chǎn)生了抗蛋白酶抑制劑基因，在蛋白酶抑制劑的作用下，抗性基因頻率逐漸提高，從而增強了其抗蛋白酶抑制劑的能力；蛋白酶抑制劑基因發(fā)生突變后不能編碼出蛋白酶抑制劑2．(2021·山東卷)人類γ基因啟動子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結合位點，該位點結合BCL11A蛋白后，γ基因的表達被抑制。通過改變該結合位點的序列，解除對γ基因表達的抑制，可對某種地中海貧血癥進行基因治療?？蒲腥藛T擴增了γ基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入表達載體中進行轉(zhuǎn)化和熒光檢測，以確定BCL11A蛋白結合位點的具體位置。相關信息如圖所示。(1)為將擴增后的產(chǎn)物定向插入載體指導熒光蛋白基因表達，需在引物末端添加限制酶識別序列。據(jù)圖可知，在F1～F7末端添加的序列所對應的限制酶是____________，在R末端添加的序列所對應的限制酶是______________。本實驗中，從產(chǎn)物擴增到載體構建完成的整個過程共需要________種酶。(2)將構建的載體導入除去BCL11A基因的受體細胞，成功轉(zhuǎn)化后，含F(xiàn)1～F6與R擴增產(chǎn)物的載體表達熒光蛋白，受體細胞有熒光，含F(xiàn)7與R擴增產(chǎn)物的受體細胞無熒光。含F(xiàn)7與R擴增產(chǎn)物的受體細胞無熒光的原因是_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，含F(xiàn)1～F4與R擴增產(chǎn)物的受體細胞不再有熒光，而含F(xiàn)5～F6與R擴增產(chǎn)物的受體細胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對應的位置不含有BCL11A蛋白的結合位點序列，據(jù)此結果可推測，BCL11A蛋白結合位點位于____________________________，理由是__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。[思維培養(yǎng)]解析：(1)首先分析載體的序列，在不能破壞熒光蛋白基因的前提下，能插入的位點只有MunⅠ和XhoⅠ這2個限制酶的切割位點(因為熒光蛋白基因中有EcoRⅠ的切割位點，所以排除此處作為插入位點)，而熒光蛋白基因的終止子在左側(cè)，故插入的調(diào)控序列應左右顛倒進行插入，即R段插入載體的MunⅠ酶切位點，F(xiàn)1～F7末端插入載體的XhoⅠ酶切位點。分析題中所給的5種限制酶的識別序列，可以看出MunⅠ和EcoRⅠ互為同尾酶，XhoⅠ和SalⅠ互為同尾酶，即可形成相同的黏性末端。剪切擴增產(chǎn)物時，F(xiàn)1～F7末端添加的序列所對應的限制酶應選擇SalⅠ，這樣可以與載體中的XhoⅠ酶切位點結合，又不會導致調(diào)控序列中的XhoⅠ位點被切斷，故只能選SalⅠ。而調(diào)控序列中有MunⅠ酶切位點，所以R末端應該選擇與MunⅠ同尾的EcoRⅠ切割，而不能選擇MunⅠ。從產(chǎn)物擴增到載體構建完成需要SalⅠ、EcoRⅠ(這兩個酶用于切γ基因上游不同長度的片段)、MunⅠ、XhoⅠ(這兩個用于切載體的結合位點)，載體構建過程中還用到PCR技術，所以還需要TaqDNA聚合酶，而載體構建完成還需要DNA連接酶將DNA片段連接起來，所以一共需要SalⅠ、EcoRⅠ、MunⅠ、XhoⅠ、TaqDNA聚合酶、DNA連接酶這6種酶。(2)受體細胞中已經(jīng)除去BCL11A基因，故擴增產(chǎn)物中的BCL11A蛋白結合位點，不會抑制熒光蛋白基因的表達；基因的表達需要RNA聚合酶與啟動子結合，才能完成熒光蛋白基因的轉(zhuǎn)錄過程；含F(xiàn)1～F6與R擴增產(chǎn)物的載體表達熒光蛋白，受體細胞有熒光，含F(xiàn)7與R擴增產(chǎn)物的受體細胞無熒光，則可能是F7與R擴增產(chǎn)物不含完整的啟動子，熒光蛋白基因不表達。(3)向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，此時重組載體上的BCL11A基因表達，產(chǎn)生BCL11A蛋白，BCL11A蛋白與BCL11A蛋白結合位點結合后，導致熒光蛋白基因被抑制；含F(xiàn)1～F4與R擴增產(chǎn)物的受體細胞不再有熒光，則說明BCL11A蛋白結合位點在引物F4與引物R之間的序列上；含F(xiàn)5～F6與R擴增產(chǎn)物的受體細胞仍有熒光，則說明BCL11A蛋白結合位點在引物F5的上游序列，據(jù)此結果可推測，BCL11A蛋白結合位點位于引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應序列之間的區(qū)段上。答案：(1)SalⅠEcoRⅠ6(2)F7與R擴增產(chǎn)物不含完整的啟動子，熒光蛋白基因不表達(3)引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應序列之間的區(qū)段上根據(jù)有無熒光情況判斷，F(xiàn)1～F4與R擴增產(chǎn)物上均有結合位點，因此結合位點位于F4所對應調(diào)控序列的下游(右側(cè))；F5～F6與R擴增產(chǎn)物上均無結合位點，可知結合位點位于F5所對應調(diào)控序列的上游(左側(cè))，所以結合位點位于引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應序列之間的區(qū)段上1．(科學實驗和探究情境)大腸桿菌β-半乳糖苷酶(Z酶)可催化白色底物(X-gal)水解產(chǎn)生藍色物質(zhì)。在pUC18質(zhì)粒中，lacZ′編碼Z酶氨基端的一個片段(稱為α-肽)，該質(zhì)粒結構及限制酶識別位點如圖甲所示。已知α-肽、缺失α-肽的Z酶片段單獨存在時均無Z酶活性，共同存在時就會表現(xiàn)出Z酶活性。利用圖乙中的目的基因與pUC18質(zhì)粒進行基因工程操作。(1)獲得目的基因后，需要通過PCR技術擴增。PCR反應中需要用到的酶是Taq酶，其不能從頭開始合成DNA，而只能____________________________，因此PCR擴增需要引物。在擴增圖乙目的基因時，與之對應的引物結合部位應該是圖中的________(填數(shù)字)。為了使目的基因插入pUC18質(zhì)粒中，需要在引物的________端添加限制酶的識別序列。(2)若計劃用1個目的基因為模板獲得m(m大于2)個目的基因，則需要的引物總量是________個。(3)用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后將大腸桿菌接種到含____________的固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，由于未發(fā)生轉(zhuǎn)化的大腸桿菌沒有該質(zhì)粒，因而在該培養(yǎng)基上不能生長。(4)當上述培養(yǎng)基中含有X-gal時，生長出的菌落有藍色和白色兩種類型，其中含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌的菌落顏色為__________。為了保證能通過菌落顏色辨別是否含有重組質(zhì)粒，本實驗作為受體細胞的大腸桿菌中Z酶基因應滿足的條件是___________________________________________________________________________________________________________________________________。解析：(1)Taq酶不能從頭開始合成DNA，而只能從引物的3′端延伸DNA鏈，因此PCR擴增需要引物。DNA分子中含游離的磷酸基團的為5′端，含游離羥基的為3′端；由于Taq酶只能從引物的3′端延伸DNA鏈，引物與目的基因所在DNA分子遵循堿基互補配對原則，所以擴增圖乙目的基因時，與之對應的引物結合部位應該是目的基因所在DNA分子的3′端，即圖中的2、3。為了使目的基因完整地插入pUC18質(zhì)粒中，需要在引物的5′端添加限制酶的識別序列。(2)若計劃用1個目的基因為模板獲得m(m大于2)個目的基因，因為每個新合成的目的基因的兩條脫氧核苷酸鏈的兩端都各含有一個引物，故m個基因應該有2m個引物，原來的模板鏈中不含引物，則需要的引物總量是(2m－2)個。(3)重組質(zhì)粒上有氨芐青霉素抗性基因(標記基因)，因此應該將大腸桿菌接種到含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，由于未發(fā)生轉(zhuǎn)化的大腸桿菌沒有該質(zhì)粒，因而不具有氨芐青霉素抗性，在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上不能生長。(4)從圖中可知，重組質(zhì)粒是用酶SalI或HindⅢ處理過的質(zhì)粒和目的基因片段形成的，限制酶處理后，重組質(zhì)粒的lacZ′基因被破壞，不能合成β-半乳糖苷酶(Z酶)，不能催化底物(X-gal)水解產(chǎn)生藍色物質(zhì)，故菌落呈白色。已知α-肽、缺失α-肽的Z酶片段單獨存在時均無Z酶活性，共同存在時就會表現(xiàn)出Z酶活性，為保證能通過菌落顏色辨別出含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，本實驗作為受體細胞的大腸桿菌中Z酶基因應滿足的條件是編碼α-肽的DNA序列缺失，其他序列正常。答案：(1)從3′端延伸DNA鏈2、35′(2)2m－2(3)氨芐青霉素(4)白色編碼α-肽的DNA序列缺失，其他序列正常2．(科學實驗和探究情境)結核病是由結核桿菌引起的人畜共患病。結核桿菌通常以氣溶膠形式傳播，氣溶膠顆粒被肺泡吞噬細胞吞噬，吞噬細胞破裂導致結核桿菌在機體內(nèi)進一步傳播。羊癢病是由正常細胞的非致病性朊蛋白異構化為癢病朊蛋白所致。為研制既能抗結核病又能抗羊癢病的雙抗羊，科學家進行了如下操作。(1)將山羊吞噬細胞特異性啟動子MRS與小鼠SP110基因形成融合基因，用__________________將融合基因與質(zhì)粒構建成重組質(zhì)粒，導入山羊肺泡吞噬細胞(組2)。以____________________________________________(組3)和轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒的山羊吞噬細胞為對照組(組1)。分別接種等量的結核桿菌，72h后加入________使吞噬細胞破裂，取裂解液進行涂布培養(yǎng)，結果如圖1。由圖可知小鼠SP110基因可用于雙抗羊的研制，依據(jù)是___________________________________________________________________________________________________________。(2)非致病性朊蛋白是由山羊13號染色體上的PRNP基因的第三外顯子控制合成的，PRNP基因的結構如圖2。以L4和R1為識別位點設計TALEN敲除載體，對山羊成纖維細胞L4與R1之間的序列實施定點敲除。請根據(jù)上述信息，寫出檢測敲除是否成功的思路，并描述敲除成功的實驗結果______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)將TALEN敲除載體與供體DNA載體共轉(zhuǎn)化幼羊成纖維細胞，可將SP110基因定點敲入PRNP基因的第三外顯子中，原理如圖3。請指出圖4中的數(shù)字分別代表的結構。1______；2______；3______；4______。經(jīng)__________________檢測，成纖維細胞的SP110基因表達量明顯下降。(4)欲用上述細胞獲得雙抗羊，需要用到的技術有__________________________________________________________________________________________。解析：(1)構建重組質(zhì)粒時需要限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，然后用DNA連接酶將目的基因和質(zhì)粒連接，形成重組質(zhì)粒，組2是實驗組，導入了重組質(zhì)粒，對照組分別導入空質(zhì)粒和只含目的基因，分別為組3和組1，組3中轉(zhuǎn)入廣泛表達小鼠SP110基因的重組質(zhì)粒的山羊吞噬細胞。吞噬細胞破裂的方式是加入蒸餾水。由題圖可知小鼠SP110基因可用于雙抗羊的研制，依據(jù)是組2的吞噬細胞裂解后釋放的結核桿菌數(shù)量與組3接近，顯著小于組1。(2)檢測敲除是否成功的思路及實驗結果為：提取成纖維細胞DNA，根據(jù)第三外顯子的序列設計引物，進行PCR，并對PCR產(chǎn)物用BamHⅠ進行切割，電泳，若僅有一條帶，則敲除成功(或提取成纖維細胞DNA，根據(jù)第三外顯子的序列設計引物，進行PCR，并對PCR產(chǎn)物進行測序，若不存在GGATCC序列，則敲除成功)。(3)圖4表示基因表達載體，其上包括有啟動子、終止子、目的基因和標記基因等，所以1是L4序列，2是MRS啟動子，3是終止子，4是R1序列。MRS是山羊吞噬細胞特異性啟動子，經(jīng)抗—原抗體雜交技術檢測，成纖維細胞的SP110基因表達量明顯下降。(4)欲用上述細胞獲得雙抗羊，需要用到的技術有核移植、動物細胞培養(yǎng)、胚胎移植。答案：(1)限制酶和DNA連接酶轉(zhuǎn)入廣泛表達小鼠SP110基因的重組質(zhì)粒的山羊吞噬細胞蒸餾水組2的吞噬細胞裂解后釋放的結核桿菌數(shù)量與組3接近，顯著小于組1(2)提取成纖維細胞DNA，根據(jù)第三外顯子的序列設計引物，進行PCR，并對PCR產(chǎn)物用BamHⅠ進行切割、電泳，若僅有一條帶，則敲除成功(或提取成纖維細胞DNA，根據(jù)第三外顯子的序列設計引物，進行PCR，并對PCR產(chǎn)物進行測序，若不存在GGATCC序列，則敲除成功)(3)L4序列MRS啟動子終止子R1序列抗原—抗體雜交技術(4)核移植、動物細胞培養(yǎng)、胚胎移植課時質(zhì)量評價(四十)(建議用時：40分鐘)一、選擇題：每小題給出的四個選項中只有一個符合題目要求。1．(2023·遼寧大連開學考)下列關于生物學中常見的幾種酶的敘述，正確的是()A．DNA連接酶將目的基因的黏性末端與載體的黏性末端之間的堿基黏合形成氫鍵B．用限制酶從質(zhì)粒上切下一個目的基因需消耗4個水分子C．Taq酶是PCR擴增儀擴增DNA分子時常用的一種耐高溫的DNA連接酶D．在解離根尖分生區(qū)細胞時加入纖維素酶有利于提高解離的效果B解析：DNA連接酶是將目的基因的黏性末端與載體的黏性末端之間黏合形成磷酸二酯鍵，堿基之間的氫鍵自動形成，A錯誤；用限制酶從質(zhì)粒上切下一個目的基因需打開2個切口，破壞4個磷酸二酯鍵，消耗4個水分子，B正確；Taq酶是PCR擴增儀擴增DNA分子時常用的一種耐高溫DNA聚合酶，C錯誤；在解離根尖分生區(qū)細胞時加入鹽酸使植物細胞相互分散開，纖維素酶可用于除去細胞壁，D錯誤。2．(2022·云南聯(lián)考)戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，ORF2基因編碼的結構蛋白(pORF2)位于病毒表面，構成病毒的衣殼。我國科研人員利用基因工程技術，在大腸桿菌中表達pORF2，制備戊型肝炎疫苗，過程如下圖。下列關于該疫苗的敘述，正確的是()A．過程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、CB．重組基因表達載體上的啟動子需來源于戊型肝炎病毒C．過程⑤需要用聚乙二醇處理大腸桿菌使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)D．過程⑥大量制備pORF2蛋白前應做相應的檢測與鑒定D解析：戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，過程①是以病毒RNA為模板合成DNA，獲取目的基因的過程，需要的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶，原料是四種脫氧核苷酸，A錯誤；啟動子是一段有特殊結構的DNA片段，其作用是供RNA聚合酶的識別、結合以驅(qū)動目的基因的轉(zhuǎn)錄，啟動子具有物種或組織特異性，構建在大腸桿菌細胞內(nèi)特異表達pORF2蛋白的載體時，需要選擇大腸桿菌細胞的啟動子，而不能選擇其他物種和組織細胞的啟動子，B錯誤；將目的基因?qū)氪竽c桿菌前，需要先用Ca2+處理大腸桿菌，改變大腸桿菌細胞膜的透過性，使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，C錯誤。3．(2021·江蘇卷)下圖是剔除轉(zhuǎn)基因植物中標記基因的一種策略，下列相關敘述錯誤的是()A．分別帶有目的基因和標記基因的兩個質(zhì)粒，都帶有T-DNA序列B．該方法建立在高轉(zhuǎn)化頻率基礎上，標記基因和目的基因須轉(zhuǎn)到不同染色體上C．若要獲得除標記基因的植株，轉(zhuǎn)化植株必須經(jīng)過有性繁殖階段遺傳重組D．獲得的無篩選標記轉(zhuǎn)基因植株發(fā)生了染色體結構變異D解析：農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的DNA上，故分別帶有目的基因和標記基因的兩個質(zhì)粒，都帶有T-DNA序列，進而成功整合到受體細胞染色體上，A正確；該方法需要利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，在高轉(zhuǎn)化頻率的基礎上，將目的基因和標記基因整合到染色體上，由圖可知，標記基因和目的基因位于細胞中不同的染色體上，B正確；通過雜交分離結果可知，經(jīng)過有性繁殖階段遺傳重組后獲得了三種類型細胞，其中包括只含目的基因的，只含標記基因的和既含目的基因又含標記基因的，C正確；獲得的無篩選標記轉(zhuǎn)基因植株發(fā)生了基因重組，D錯誤。4．不對稱PCR是利用不等量的一對引物來產(chǎn)生大量單鏈DNA的方法。這兩種引物分別為限制性引物與非限制性引物，其最佳比例一般為1∶50～1∶100，在PCR反應的最初10～15個循環(huán)中，其擴增產(chǎn)物最初主要是雙鏈DNA，但當限制性引物消耗完后，非限制性引物引導的PCR就會產(chǎn)生大量的單鏈DNA。下列相關說法錯誤的是()A．可以利用不對稱PCR來制備探針B．復性溫度過高可能導致PCR反應得不到任何擴增產(chǎn)物C．用不對稱PCR方法擴增目的基因時需知道基因的全部序列D．因為雙鏈DNA和單鏈DNA的分子量大小不同，可通過電泳方法將其分離C解析：探針即是單鏈DNA，根據(jù)題意可知不對稱PCR可用來合成大量的單鏈DNA，A正確；復性溫度過高會導致引物無法與模板結合，從而無擴增產(chǎn)物形成，B正確；PCR時不需要知道擴增基因的全部序列，只需要知道兩端的部分序列即可，C錯誤；單鏈DNA和雙鏈DNA的分子量不同，電泳可以將其分離，D正確。5．(2023·廣東廣州模擬)自然界中很少出現(xiàn)藍色的花，天然藍色花產(chǎn)生的主要原因是花瓣細胞液泡中花青素在堿性條件下顯藍色。我國科學家利用鏈霉菌的靛藍合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)構建基因表達載體(如下圖所示)，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導入白玫瑰中，在細胞質(zhì)基質(zhì)中形成穩(wěn)定顯色的靛藍。下列相關敘述錯誤的是()A．上述獲得藍色玫瑰的方案中無需轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因B．將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠC．sfp和idgS基因具有各自的啟動子，表達是相互獨立進行的D．農(nóng)桿菌可將Ti質(zhì)粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色體DNA上B解析：靛藍能夠穩(wěn)定顯色，不受pH的影響，故本題方案中無需轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因，A正確；將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時若使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ，則會將終止子一同切除，故只能用BamHⅠ，B錯誤；sfp和idgS基因具有各自的啟動子，表達是相互獨立進行的，C正確；將目的基因?qū)胫参锛毎刹捎棉r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，故農(nóng)桿菌可將Ti質(zhì)粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色體DNA上，D正確。6．(2022·山東臨沂三模)脫氧核苷三磷酸(dNTP)和雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP，ddN-Pα～Pβ～Pγ)的結構均與核苷三磷酸(NTP)類似，僅是所含五碳糖的羥基(—OH)數(shù)目不同。在DNA復制時，ddNTP可以與dNTP競爭核苷酸鏈延長位點，從而終止DNA片段延伸。現(xiàn)有一些序列為5′—GACTATGATCGTA—3′的DNA分子單鏈片段，將其作為模板與引物、底物、TaqDNA聚合酶、Mg2+及緩沖溶液加入反應管中，底物中僅有一種被32P標記。通過PCR獲得被32P標記且3′端為堿基A的不同長度子鏈DNA。下列敘述錯誤的是()A．dNTP作PCR的原料時也可為DNA復制提供能量B．反應底物是dCTP、dGTP、dTTP、dATP和γ位32P標記的ddATPC．ddNTP與dNTP競爭的延長位點是脫氧核苷酸鏈的3′末端D．實驗結束后最多可得到4種被32P標記的子鏈DNAB解析：分析題意可知，dNTP水解可得到脫氧核苷酸，同時水解化學鍵可釋放能量，故作PCR的原料時也可為DNA復制提供能量，A正確；題干中要對模板DNA分子單鏈片段通過PCR進行擴增，且要獲得堿基A的不同長度的DNA分子，說明需要ddATP作為競爭底物參與PCR過程，則反應底物是dCTP、dGTP、dTTP、dATP和α位32P標記的ddATP，B錯誤；DNA復制時，由5′端向3′端延伸，因此ddNTP與dNTP競爭的延長位點是脫氧核苷酸鏈的3′末端，C正確；分析題意可知，5′—GACTATGATCGTA—3′的DNA分子單鏈片段共有4個堿基“A”，內(nèi)部有4個堿基“T”，因此利用PCR反應體系，最多可得到4種被32P標記的子鏈DNA，D正確。7．20世紀70年代，科學家發(fā)明了雙脫氧終止法對DNA進行測序。其原理如圖，在4個試管中分別加入4種脫氧核苷三磷酸(dNTP)和1種雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)；ddNTP可以與dNTP競爭核苷酸鏈延長位點，并終止DNA片段的延伸。在4個試管中DNA鏈將會分別在A、G、C及T位置中止，并形成不同長度的DNA片段。這些片段隨后可被電泳分開并顯示出來。下列說法中錯誤的是()A．這種測序方法需要引物和耐高溫的DNA聚合酶B．電泳圖譜中的箭頭所指的DNA片段以鳥嘌呤結尾C．測得未知DNA的序列為5′—GATTCGAGCTGA—3′D．ddNTP與dNTP競爭的延長位點是核苷酸鏈的3′末端C解析：這種測序方法需要引物和耐高溫的DNA聚合酶，A正確；電泳圖譜中的箭頭所指的DNA片段以鳥嘌呤結尾，B正確；測得未知DNA的序列為5′-TCAGCTCGAATC－3′，C錯誤；ddNTP與dNTP競爭的延長位點是核苷酸鏈的3′末端，D正確。8．研究表明，服用α-干擾素在慢性乙肝、丙肝及部分腫瘤的治療中有一定療效。人參是一種名貴藥材，具有較好的滋補作用。下圖為科研人員制備能合成干擾素的人參愈傷組織細胞的流程，①～④表示相關的操作。若限制酶EcoRⅠ識別G↓AATTC，BamHⅠ識別G↓GATCC。下列選項錯誤的是()A．步驟①中，利用PCR技術擴增干擾素基因時，設計引物序列的主要依據(jù)是干擾素基因兩端的部分核苷酸序列B．在過程③中T-DNA整合到受體細胞的染色體DNA上C．科研人員在兩種引物的一端分別加上了GAATTC和GGATCC序列，目的是方便后續(xù)的剪切和連接D．過程④中，科研人員最終未能檢測出干擾素基因，其原因可能是干擾素基因未能導入人參愈傷組織細胞B解析：步驟①中，利用PCR技術擴增干擾素基因時，設計引物序列的主要依據(jù)是干擾素基因兩端的部分核苷酸序列，A正確；在過程③將重組質(zhì)粒導入根瘤農(nóng)桿菌，而在侵染人參愈傷組織細胞時，T-DNA整合到受體細胞的染色體DNA上，B錯誤；由于需要用EcoRⅠ、BamHⅠ兩種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，因此科研人員還在兩種引物的一端分別加上了GAATTC和GGATCC序列，以便于后續(xù)的剪切和連接，C正確；干擾素基因未能導入人參愈傷組織細胞或?qū)肴藚⒂鷤M織細胞的干擾素基因未能轉(zhuǎn)錄，這會導致通過該方法不能檢測出干擾素基因，D正確。二、非選擇題9．(2021·遼寧卷)PHB2蛋白具有抑制細胞增殖的作用。為初步探究某動物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細胞增殖的原因，研究者從基因數(shù)據(jù)庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列(簡稱phb2基因)，大小為0.9kb(1kb＝1000堿基對)，利用大腸桿菌表達該蛋白?；卮鹣铝袉栴}。(1)為獲取phb2基因，提取該動物肝臟組織的總RNA，再經(jīng)____________過程得到cDNA，將其作為PCR反應的模板，并設計一對特異性引物來擴增目的基因。(2)圖1為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識別序列及切割位點見下表。為使phb2基因(該基因序列不含圖1中限制酶的識別序列)與載體正確連接，在擴增的phb2基因兩端分別引入________和__________兩種不同限制酶的識別序列。經(jīng)過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進行連接時，可選用______________(填“E．coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”)。圖1表相關限制酶的識別序列及切割位點名稱識別序列及切割位點名稱識別序列及切割位點HindⅢA↓AGCTTTTCGA↑AEcoRⅠG↓AATTCCTTAA↑GPvuⅡCAG↓CTGGTC↑GACPstⅠCTGC↓AGGA↑CGTCKpnⅠG↓GTACCCCATG↑GBamHⅠG↓GATCCCCTAG↑G注：箭頭表示切割位點(3)轉(zhuǎn)化前需用CaCl2處理大腸桿菌細胞，使其處于__________的生理狀態(tài)，以提高轉(zhuǎn)化效率。