同病異證腫瘤小鼠內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的研究

同病異證腫瘤小鼠內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的研究

肝癌是我國(guó)的一種主要疾病和難治性疾病，其療效往往很慢。因此，對(duì)肝癌療效的研究和改進(jìn)是一項(xiàng)長(zhǎng)期而艱難的任務(wù)。中醫(yī)藥在我國(guó)肝癌防治中發(fā)揮著重要的作用,在改善患者生存質(zhì)量,延長(zhǎng)帶瘤生存期等方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)藥防治肝癌的特點(diǎn)是辨證論治,即依據(jù)“同病異證”實(shí)施“同病異治”。因此,揭示同病異證的發(fā)生機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ),對(duì)于探索和發(fā)展辨證論治的療效是十分必要的。在肝癌等腫瘤藥效學(xué)和療效作用機(jī)制的研究中,腫瘤小鼠是最常用的模式生物。我們的前期研究表明,H22等腫瘤小鼠會(huì)自發(fā)形成氣血陰陽(yáng)虛證,證情會(huì)發(fā)生自然演變和兼夾,與人類近似[2、3],是研究同病異證和證候發(fā)生物質(zhì)基礎(chǔ)的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物;進(jìn)而的研究發(fā)現(xiàn)同病異證腫瘤小鼠普遍存在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)大量的基因表達(dá)差異和特征。最近,我們采用標(biāo)準(zhǔn)化、計(jì)量化小鼠診法和辨證方法[4、5],在同步接種H22肝癌細(xì)胞的荷瘤小鼠中篩選出若干組同病異證小鼠,采用ELISA方法檢測(cè)其血清中內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)等多基因產(chǎn)物的含量,以進(jìn)一步揭示其同病異證的物質(zhì)基礎(chǔ),報(bào)道如下。1材料和方法1.1動(dòng)物使用許可證(1)動(dòng)物:清潔級(jí)KM小鼠250只,雄性,體質(zhì)量22g±2g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2008-0003);動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(滬)2009-0069;(2)隨機(jī)取20只為正常對(duì)照;(3)230只小鼠腋下接種H22腹水癌細(xì)胞,細(xì)胞濃度為4×107/ml,每只小鼠右腋下接種0.2ml細(xì)胞懸液。出瘤后第6~7天淘汰死亡和未出瘤小鼠,余180只腫瘤小鼠。1.2異質(zhì)腫瘤小鼠的檢測(cè)和篩選1.2.1計(jì)算跨格數(shù)及垂直監(jiān)測(cè)站數(shù)計(jì)量化檢測(cè)指標(biāo)[12、13]包括:(1)體重;(2)腋溫;(3)曠場(chǎng)及計(jì)算35s內(nèi)水平跨格數(shù)和垂直站立數(shù);(4)抓力;(5)爪和尾顯微拍照及提取反映紅色程度的r值;(6)瘤長(zhǎng)短徑。1.2.2兩組消極主動(dòng)指標(biāo)比較接種后第7天每只小鼠給予計(jì)量化辨證,證候及程度計(jì)算方法[1、2]如下:(1)估算瘤體積和瘤重(cm3)=abb/2(a代表腫瘤的長(zhǎng)徑,b代表腫瘤的短徑,單位cm/g);(2)邪盛衰度=瘤重/所有瘤重均數(shù)。辨證標(biāo)準(zhǔn):大于1.5為邪毒甚,大于2為邪毒壅盛,小于0.75為邪較弱,小于0.5為邪弱;(3)氣盛衰度=抓力/正常均數(shù)×0.5+水平/正常均數(shù)×0.3+站立/正常均數(shù)×0.2。辨證標(biāo)準(zhǔn):與正常組比較,大于1.25為氣盛,小于0.75為氣虛,小于0.5為氣虛甚,小于0.25為氣虧;(4)陽(yáng)盛衰度=腋溫/正常均數(shù)。辨證標(biāo)準(zhǔn):與正常組比較,大于1.02為陽(yáng)氣盛,小于0.98為陽(yáng)虛,小于0.95為陽(yáng)虛重,小于0.9為陽(yáng)損;(5)陰盛衰度=去瘤體重/正常體重均數(shù)。辨證標(biāo)準(zhǔn):與正常組比較,大于1.2為形豐,小于0.9為陰偏虛,小于0.85為陰虛,小于0.7為陰虧,小于0.6為液脫;(6)血盛衰度=爪r/正常均數(shù)×0.7+尾r/正常均數(shù)×0.3。辨證標(biāo)準(zhǔn):與正常組比較,大于1.1為血充盈,小于0.95為血虛,小于0.9為血虛重,小于0.85為血虧。1.2.3邪毒u不同組別的同病異證小鼠篩選方法:(1)正常對(duì)照組(正常組)。取氣血陰陽(yáng)盛衰度居中者14只,其余淘汰。腫瘤小鼠以邪盛衰度大小排序,淘汰陽(yáng)虛瀕臨死亡者;(2)邪毒壅盛瀕危者(邪危組)。取邪盛衰度最為嚴(yán)重且兼有輕度陽(yáng)氣虛者21只(實(shí)際處死14只,以免次日部分自然死亡);(3)邪毒壅盛(邪毒組)。取邪盛衰度次于上組兼證少者17只(實(shí)際處死14只,以免次日部分自然死亡);(4)邪毒居中兼氣虛小鼠14只(氣虛組);(5)邪毒居中小鼠14只(邪中組);(6)邪毒微弱小鼠14只(邪微組),其余腫瘤小鼠淘汰。1.3小鼠血清樣的采集(1)接種后第8天,摘除眼球取血制備血清,-80℃保存。各組取14只小鼠(邪危組隨機(jī)淘汰3只存活小鼠);而氣虛組僅存10只,邪中組13只。常規(guī)分離血清,血清樣本少者2只樣本合并,以保證同一份血清夠檢測(cè)所有指標(biāo);(2)引頸處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,分離腫瘤、睪丸、胸腺、脾臟等稱重。1.4mo使用tri-iofig新型疏明條件見(jiàn)表1采用的ELISA試劑盒及各自所提供的方法:(1)ACTH(1-39,mouse,rat)(美國(guó),PeninsulaLaboratories);(2)MouseTSH(美國(guó)GroundworkBiotechnologyDiagnosticateLtd.);(3)MouseAldosterone(美國(guó),AssayDesigns,Inc);(4)MouseTri-iodothyronine(美國(guó),CALBIOTECHInc.);(5)Mousethyroxine(美國(guó),CALBIOTECHInc.);(6)MouseFreeTri-iodothyronineIndes(武漢EIAabScienceCo.,Ltd);(7)MouseFreeThyroxine(武漢EIAabScienceCo.,Ltd);(8)Testoterone(美國(guó),R&DSystems,Inc.);(9)MouseIL-2(美國(guó),R&DSystems,Inc.);(10)MouseIL-10(美國(guó),R&DSystems,Inc.);(11)MouseIL-12p70(美國(guó),R&DSystems,Inc.);(12)MouseTNF-α(美國(guó),R&DSystems);(13)MouseIFN-γ(美國(guó),R&DSystems)1.5檢測(cè)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)分析(1)實(shí)驗(yàn)結(jié)果取存活并取材小鼠診法和辨證指標(biāo)統(tǒng)計(jì),以便與各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)比較:(2)采用單因素方差分析及SPSS15.0數(shù)據(jù)處理。2結(jié)果2.1結(jié)果出現(xiàn)230只小鼠在接種后,第6天去除未出瘤或出瘤不佳如破潰等小鼠10只,剩余220只,當(dāng)日有3只小鼠死亡。第7天,診法和辨證前出現(xiàn)44只小鼠死亡,提示該批次實(shí)驗(yàn)荷瘤小鼠腫瘤發(fā)展快、預(yù)后差。接種后第8天(處死小鼠當(dāng)天),邪危組21只中自然死亡4只,邪毒組17只中自然死亡3只,氣虛組14只中自然死亡4只,邪中組14只中自然死亡1只(死亡率見(jiàn)圖1)。提示:(1)邪盛衰度大小確與預(yù)后有關(guān);(2)本實(shí)驗(yàn)氣虛組死亡率偏高,可能與氣虛嚴(yán)重有關(guān)。2.2結(jié)果見(jiàn)表1(1)邪盛衰度。邪危組、邪毒組、氣虛和邪中組、邪微組等邪盛衰度依次減小,除氣虛組與邪中組接近外,差異均有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05),表明采用計(jì)量化辨證分組是可行的(圖2);(2)次日腫瘤取材。邪危組、邪毒組、邪中組、邪微組等實(shí)際瘤重依次減輕,與邪盛衰度近似(圖3),其中邪中組、邪微組與其他組比較差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05),表明體表測(cè)量及計(jì)算瘤體積方法正確。值得注意的是,氣虛組瘤重明顯大于邪中組,提示在小鼠四診檢測(cè)到處死間約20h內(nèi),氣虛組腫瘤增殖快,這也可能是該組死亡率高、預(yù)后差的原因。2.3對(duì)腫瘤發(fā)生的邪衰度造成檢測(cè),結(jié)果如下(1)腫瘤發(fā)生后,荷瘤小鼠會(huì)自發(fā)形成氣虛,并隨著病情發(fā)展和邪盛衰度嚴(yán)重而加劇。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果近似,總體上邪盛衰度愈重氣虛程度也愈重(圖4);其中與正常組比較,邪危組、邪毒組、氣虛組差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。氣虛組氣盛衰度最小,除邪危組外,與其他組比較差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。依據(jù)氣盛衰度辨證標(biāo)準(zhǔn)[4、5]與正常組比較,小于0.5為氣虛甚,表明本實(shí)驗(yàn)氣虛組的氣虛程度十分嚴(yán)重,這可能是其預(yù)后差的主要原因;(2)腫瘤發(fā)生后,荷瘤小鼠會(huì)自發(fā)形成陽(yáng)虛,并隨著病情發(fā)展與邪盛衰度嚴(yán)重而加劇。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果近似,總體上邪盛衰度愈嚴(yán)重陽(yáng)虛程度也愈嚴(yán)重(圖5)。其中與正常組比較,邪危組陰盛衰度下降,差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05);(3)當(dāng)腫瘤發(fā)展至中晚期,荷瘤小鼠會(huì)自發(fā)形成陰虛。本實(shí)驗(yàn)未見(jiàn)陰虛表現(xiàn)(圖6);(4)腫瘤發(fā)生后,荷瘤小鼠會(huì)自發(fā)形成血虛,并隨著病情發(fā)展和邪盛衰度嚴(yán)重而加劇。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果近似,總體上邪盛衰度愈嚴(yán)重血虛程度也愈嚴(yán)重(圖7)。其中與正常組比較,邪危組、邪毒組血盛衰度下降,差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。(1)在腫瘤發(fā)生的早期,應(yīng)激使垂體ACTH合成與釋放增加。本實(shí)驗(yàn)與正常組比較,各組均顯著升高(P<0.05),且總體上與邪盛衰度呈正相關(guān),但各組總量接近,沒(méi)有顯著差異(圖8)。提示:對(duì)于邪毒壅盛及瀕危荷瘤小鼠,垂體呈現(xiàn)出失代償征兆;同時(shí)垂體儲(chǔ)備有限,應(yīng)激反應(yīng)可能接近其極限;(2)與ACTH對(duì)應(yīng),腫瘤發(fā)生腎上腺醛固酮分泌增加,總體上與邪盛衰度呈正相關(guān)(圖9),邪中組與邪微組差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。其中邪危組下調(diào),提示該組小鼠腎上腺出現(xiàn)失代償。鑒于醛固酮組間差異大,提示在受到ACTH的刺激后,還存在其他因素進(jìn)一步調(diào)整和促進(jìn)腎上腺醛固酮的分泌。3.2同病異證小鼠的篩選中醫(yī)學(xué)辨證論治往往抓住反映證候本質(zhì)的四診信息,而不在于四診信息采集的多寡,因而有“但見(jiàn)一證便是”的說(shuō)法。腫瘤體積的大小,綜合反映了痰熱瘀毒病邪的嚴(yán)重程度。在相同造模條件下(接種同樣數(shù)量的腫瘤細(xì)胞,以及接種后相同的時(shí)間),腫瘤體積大者,痰熱瘀毒邪盛,腫瘤發(fā)生和增殖快,預(yù)后差;腫瘤體積小者,痰熱瘀毒邪微,腫瘤發(fā)生和增殖慢,預(yù)后好。依據(jù)我們以往大量的研究,以及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,按腫瘤體積的大小篩選的同病異證小鼠,的確存在內(nèi)分泌和免疫客觀的差異和特征性的表現(xiàn),驗(yàn)證了辨證的合理性及其同病異證的客觀性。邪毒證候的形成確有其復(fù)雜的內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ)。3.3從發(fā)病學(xué)的角度分析與TNF-α一致,腫瘤發(fā)生后IFN-γ表達(dá)量上升,與正常組比較除邪微組外,差異均有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05),且與腫瘤體積呈負(fù)相關(guān)(圖23)。與人類腫瘤的發(fā)生機(jī)制不同,H22荷瘤小鼠沒(méi)有長(zhǎng)期的肝臟受損、纖維化和異常增殖等背景,之前的免疫系統(tǒng)也處于正常狀態(tài),所有的改變均發(fā)生在外來(lái)腫瘤細(xì)胞的接種之后。因此,從發(fā)病學(xué)角度看,是因?qū)嵵绿?甲狀腺軸、性腺軸機(jī)能減退以及氣血陰陽(yáng)虛證的發(fā)生)。但是,為什么接種同樣數(shù)量的腫瘤細(xì)胞會(huì)發(fā)生如此多變的同病異證呢?其內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)與證候嚴(yán)重程度的對(duì)應(yīng)性改變,可能與腫瘤細(xì)胞及接種局部環(huán)境、內(nèi)分泌和免疫儲(chǔ)備差異有關(guān),這還需要更多的實(shí)驗(yàn)去解釋。3.4實(shí)驗(yàn)用小鼠醛固酮試劑定購(gòu)小鼠皮質(zhì)酮試劑盒進(jìn)口試劑盒周期長(zhǎng)且保質(zhì)期短,依據(jù)我們前期研究發(fā)現(xiàn),同病異證小鼠皮質(zhì)酮與醛固酮濃度有類似的改變,因而本實(shí)驗(yàn)僅采用了小鼠醛固酮試劑盒。此外,鑒于難以購(gòu)買(mǎi)到同一公司小鼠FT3、FT4試劑盒,我們采用了另一公司的產(chǎn)品,這導(dǎo)致兩類試劑盒有關(guān)濃度描述的差異,希望組間差異的對(duì)比是客觀的。總之,荷瘤小鼠存在同病異證及其內(nèi)在復(fù)雜及特征性的內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)的改變。本研究為荷瘤小鼠個(gè)體化辨證論治及其療效評(píng)價(jià)提供了客觀的依據(jù),也為比較和優(yōu)化辨證論治方案提供了模式生物的依據(jù)。2.4異質(zhì)異體大鼠顱內(nèi)免疫網(wǎng)絡(luò)的特征2.4.1腎上腺軸2.4.2ths在腫瘤中的表達(dá)(1)從邪中組和邪微組血清TSH含量升高看(與邪危組、邪毒組、氣虛組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)意義,P<0.05),在腫瘤發(fā)生的早期,垂體TSH處于積極的應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)(圖10)。但隨著腫瘤的增大,邪危組、邪毒組和氣虛組TSH含量下降。提示可能系垂體的儲(chǔ)能有限,在盡力滿足ACTH表達(dá)的同時(shí),限制了THS的表達(dá);(2)與TSH對(duì)應(yīng),小鼠甲狀腺T3、T4血清含量與腫瘤大小和增速負(fù)相關(guān)。在腫瘤早期,T3有升高趨勢(shì),而隨著邪盛衰度程度增加,如邪危組顯著下降,與邪中組比較,差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05);而T4在腫瘤發(fā)生后迅速抑制,與正常組比較,各組均顯著下調(diào)(P<0.05);其中邪中組、邪微組與其余腫瘤小鼠組比較,差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。顯然,與腎上腺軸相反,甲狀腺軸以抑制為主(圖11、12);(3)小鼠FT3、FT4血清含量T3、T4趨勢(shì)一致,但可以維持在較高和正常水平,其中FT3顯著升高(圖13,正常組比較,除邪毒組外其他各組差異均有統(tǒng)計(jì)意義,P<0.05),邪中組、邪微組與其余腫瘤各組差異均有差異(P<0.05);FT4總體上有升高趨勢(shì)(圖14),其中邪微組與邪毒組、氣虛組比較差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05),提示一些不明的機(jī)制在促進(jìn)T3、T4的轉(zhuǎn)化和利用。2.4.3對(duì)小鼠血清睪丸的ths-pcr檢測(cè)(1)在腫瘤發(fā)生的早期,荷瘤小鼠睪丸有重量減輕趨勢(shì),氣虛組與各組比較下降顯著(P<0.05,圖15),提示氣虛與性腺的關(guān)系密切,這也可能與該組預(yù)后差有關(guān);(2)各組小鼠血清睪酮含量與THS模式近似:腫瘤早期邪毒微弱者有上調(diào)趨勢(shì),而邪毒壅盛和預(yù)后差者,顯著下調(diào)(圖16)。與腎上腺軸相反,性腺軸也以抑制為主。2.4.4荷瘤小鼠血清il-2、tnf-表達(dá)變化情況(1)胸腺重量。在腫瘤發(fā)生的早期,荷瘤小鼠胸腺已見(jiàn)減輕,其中邪危組、邪毒組、氣虛組與正常組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)意義(<0.05);腫瘤邪毒程度嚴(yán)重者抑制更顯著,其中危組、邪毒組、氣虛組與邪中組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05),氣虛證尤甚(圖17);(2)脾臟重量在腫瘤發(fā)生的早期,荷瘤小鼠脾臟一致增重,與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05),但各腫瘤組間差距不大(圖18);(3)IL-2。小鼠IL