植物組培脫毒技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

植物組培脫毒技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

52年，法國(guó)成功采用生長(zhǎng)點(diǎn)培養(yǎng)法獲得無(wú)病毒植物后，研究人員開始采用植物組培法對(duì)作物、園林和花卉進(jìn)行脫毒研究。目前,已報(bào)道了600種以上病毒可引起植物病害。特別是無(wú)性繁殖的植物,很容易受到一種或多種病毒的侵染。隨著種質(zhì)資源交換范圍的擴(kuò)大,生態(tài)條件的改變,各種植物侵染病毒的種類越來(lái)越多,侵染范圍日益擴(kuò)大,侵染程度日趨嚴(yán)重。目前,還沒(méi)有什么藥物能夠治愈病毒侵染植物所引起的病毒性病害。但可以通過(guò)植物組培脫毒技術(shù)來(lái)生產(chǎn)脫毒苗加以防治,因此植物組培脫毒技術(shù)顯得非常重要。脫毒技術(shù)的利用及脫毒良種的推廣,給農(nóng)業(yè)帶來(lái)一場(chǎng)新的技術(shù)革命。通過(guò)脫毒,使作物恢復(fù)種性,增強(qiáng)抗性,生長(zhǎng)健壯,光合作用增強(qiáng),明顯提高了作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。如與相同品種的普通甘薯相比,脫毒甘薯的增產(chǎn)幅度可達(dá)20%~200%。尤其是該技術(shù)在馬鈴薯和甘薯上的應(yīng)用,對(duì)其種植逐步走向規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化、區(qū)域化具有重要意義。筆者介紹了植物組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)的常用方法,主要介紹了近年發(fā)展玻璃化超低溫保存方法在植物脫毒上的應(yīng)用,旨在為其科學(xué)利用提供參考。1植物組的一般脫毒技術(shù)1.1無(wú)病毒再生植株莖尖脫毒法的主要原理是病毒在植株體內(nèi)的分布不均勻,隨植株部位及年齡而異,其中莖尖部分尤其生長(zhǎng)點(diǎn)(0.1~1.0mm區(qū)域)帶病毒最少或不帶病毒,并且越靠近尖端,病毒濃度越低,感染也越低。因?yàn)椴《驹诩闹髦参矬w內(nèi)隨維管系統(tǒng)篩管轉(zhuǎn)移,在莖尖分生組織中沒(méi)有維管束系統(tǒng),病毒運(yùn)動(dòng)困難,所以,莖尖分生組織不含病毒粒子或病毒濃度很低,病毒在寄主莖尖分生組織中的轉(zhuǎn)移速度落后于莖尖的生長(zhǎng)速度,導(dǎo)致頂端分生組織附近病毒濃度低,甚至不帶病毒。通過(guò)莖尖離體培養(yǎng)便可獲得無(wú)病毒再生植株。1955年,Moral等通過(guò)莖尖培養(yǎng),獲得了無(wú)馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯A病毒(PVA)和馬鈴薯Y病毒(PVY)的馬鈴薯植株。此后,這項(xiàng)技術(shù)快速發(fā)展,為解決馬鈴薯病毒危害提供了有效途徑,有效地解決了品種退化問(wèn)題。莖尖脫毒的關(guān)鍵是莖尖大小和脫毒率,因?yàn)槊摱镜某晒β逝c所切下莖尖分生組織的大小成反比,為了提高脫毒率必須切下足夠小的莖尖分生組織(0.2~0.5mm)。然而,太小的莖尖分生組織再生成植株很困難,因?yàn)樵偕芰εc分生組織的大小成正比。席夢(mèng)利等對(duì)宜興百合脫毒培養(yǎng)得出接種0.3~0.5mm莖尖脫毒效果最好,對(duì)黃瓜花葉病毒(CMV)的脫毒率達(dá)到40%,小于0.3mm的莖尖不能培養(yǎng)成活。陸春霞等以直徑大小為0.2mm帶1~2個(gè)葉原基的馬鈴薯莖尖為外植體,其成活率與脫毒率較高,分別為68%和56%。董偉清等選取剝離0.5~0.6mm帶有1~2個(gè)葉原基的大蒜莖尖進(jìn)行培養(yǎng),試管苗脫毒率達(dá)90%以上,脫毒效果明顯,雖然0.1~0.2mm莖尖脫毒效果好,但接種后難以成活。Wang等利用莖尖培養(yǎng)脫除葡萄病毒A時(shí),當(dāng)莖尖為0.2mm時(shí),存活率為75%,脫毒率為12%;而當(dāng)莖尖為0.1mm時(shí),存活率為0;莖尖為0.4mm時(shí),存活率為100%,而脫毒率為0。0.3~0.4mm莖尖培養(yǎng)對(duì)歐李蘋果褪綠斑病毒(ACISV)和李矮縮病毒(PDV)的脫毒率分別為71.6%和73.0%。東方百合組培脫毒時(shí),莖尖小于0.3mm,成活率只有20%;小于0.1mm,全部死亡。1.2熱處理對(duì)馬鈴薯病毒的脫毒作用高溫脫毒原理是高溫可抑制病毒的增殖,減緩病毒在植株體內(nèi)的擴(kuò)散速度,而高溫對(duì)許多植物卻有加速其生長(zhǎng)作用。針對(duì)不同植物、不同品種和不同植物病毒對(duì)溫度的敏感程度不同的特點(diǎn),對(duì)需要脫毒的植株進(jìn)行一定溫度和時(shí)間范圍內(nèi)的熱力處理,使植物的生長(zhǎng)速度明顯超過(guò)病毒在植株體內(nèi)擴(kuò)散的速度,從而使一部分正在迅速生長(zhǎng)的植物組織,如頂芽、嫩稍的尖端不含病毒,把不含有病毒的部分切下接種到適宜的培養(yǎng)基上,最終培養(yǎng)出無(wú)毒植株。熱處理脫毒的方法主要有2種:熱水浸泡和高溫空氣處理。對(duì)于采用莖尖難以去除病毒的植株,常采用高溫處理和莖尖結(jié)合的方法,熱處理結(jié)合適宜的莖尖分生組織大小是獲得無(wú)病毒植株的關(guān)鍵因素。李文安指出,康乃馨莖尖經(jīng)38℃熱處理2個(gè)月,可使其病毒全部失活。馬鈴薯在35℃下處理幾個(gè)月能獲得無(wú)PVX的莖尖,而在相同條件下處理馬鈴薯塊莖20d即可除去卷葉病毒,而馬鈴薯植株經(jīng)熱處理再切取莖尖培養(yǎng),可除去馬鈴薯S病毒(PVS)和PVX2種病毒。Sanjeev等在脫除Kinnow(柑橘)印度柑橘壞斑病毒(ICSV)時(shí),發(fā)現(xiàn)采用經(jīng)50℃水浴處理效果好于熱空氣處理,在40℃處理后的材料,切取其0.7mm莖尖,脫毒率達(dá)到60%。張藝萍等采用熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)的方法,以帶有CMV病毒的東方百合栽培品種Siberia鱗莖為外植體,將組培苗熱處理后剝?nèi)≥^大的莖尖(0.4~0.6mm)進(jìn)行培養(yǎng),待莖尖長(zhǎng)成植株后再次剝?nèi)≥^大莖尖進(jìn)行二次脫毒,經(jīng)檢測(cè)脫毒率可達(dá)80%,取得了較好的脫毒效果。席夢(mèng)利等分別用熱空氣處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)和熱水處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)對(duì)百合脫毒,從脫毒效果看,隨著熱空氣處理或熱水處理時(shí)間的延長(zhǎng),脫毒率提高。切取長(zhǎng)度0.8~1.0mm的莖尖培養(yǎng),熱空氣處理42d后,脫毒率可達(dá)40%。熱水處理40min珠芽再生的試管苗,脫毒率可達(dá)100%。Frantisek等采用熱處理蘋果,其中Idared有3個(gè)克隆完全脫除蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)和蘋果莖痘病毒(ASPV),另一個(gè)品系Sampion3種病毒ACLSV、蘋果莖溝病毒(ASGV)和ASPV都未能脫除。而蘇佳明等將紅將軍蘋果試管苗在38℃高溫條件下恒定熱處理20d,二次莖尖培養(yǎng)后,試管苗脫毒率達(dá)86.4%~100.0%,可以有效脫除ASGV、ASPV和ACLSV等主要的蘋果病毒。應(yīng)用熱處理脫毒也有一定的局限性,主要缺點(diǎn)在于并非所有病毒都對(duì)熱處理敏感。熱處理只對(duì)那些球狀的病毒(如葡萄扇葉病毒、蘋果花葉病毒)或線狀的病毒(如馬鈴薯X、Y病毒及康乃馨病毒)有效果,而對(duì)桿狀病毒(如牛蒡斑駁病毒、千日紅病毒)不起作用。1.3化學(xué)抗病毒試劑抗病毒化學(xué)藥劑能夠不同程度地脫除植物病毒,主要是利用抗病毒化學(xué)藥劑來(lái)抑制病毒核酸與蛋白質(zhì)的合成或是改變寄主的代謝方式。采用病毒抑制劑與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的脫毒方法,可以較容易地脫除多種病毒,而且這種方法對(duì)取材要求不嚴(yán),接種莖尖可大于1mm,易于分化出苗,提高存活率。目前用于植物脫毒的抗病毒藥劑主要包括嘌呤和嘧啶類似物、氨基酸、抗生素等,可在某種程度抑制植物體內(nèi)或離體葉片內(nèi)病毒的合成,但尚不能完全抑制病毒使其失活。常用于組織培養(yǎng)脫毒的化學(xué)抗病毒試劑主要有9-(2-羥二氧)甲基鳥嘌呤、2-硫尿嘧啶、疊氮胸苷、2,4-氧六氫三氮雜苯(DHT)和類似嘌呤堿基代謝物質(zhì)三氮唑核苷(病毒唑)。姜玲等將墨蘭的原球莖頂端分生組織經(jīng)過(guò)20mg/L的三氮唑核苷處理,可以獲得100%的無(wú)病毒苗。Sharma等用25mg/L病毒唑處理37%柑橘ICRSV病毒,而疊氮胸苷和DHT對(duì)脫除印度柑橘壞斑病毒(ICRSV)幾乎沒(méi)有作用。Danci等在培養(yǎng)基中添加病毒唑,發(fā)現(xiàn)35mg/L的濃度對(duì)不同品種的馬鈴薯病毒脫除效果很好,可以達(dá)到60%~80%,比沒(méi)有添加病毒唑的莖尖處理脫毒效果高27%。Paunovic等采用40和60mg/L病毒唑處理,分別獲得15.38%和16.66%無(wú)李痘病毒(PPV)的歐洲李(PrunusdomesticaL.cvCacanskaLepotica)植株。但是有些病毒比較難去除,單獨(dú)使用其中某一個(gè)方法很難獲得成功,有人將熱處理、抗病毒藥劑和莖尖培養(yǎng)相結(jié)合使用,效果更好。Chen等利用這種方法去除了花生斑駁病毒。張惠華等對(duì)東方百合進(jìn)行熱處理后結(jié)合10mg/L病毒唑來(lái)處理,百合無(wú)癥病毒(LSV)、百合斑駁病毒(LmoV)脫毒率分別達(dá)到55%和40%。1.4莖尖的脫除效果熱處理脫毒法、莖尖培養(yǎng)脫毒法、熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒法和藥劑處理等都是傳統(tǒng)的脫毒方法。利用熱處理脫毒,不僅浪費(fèi)時(shí)間,而且脫毒率很低。張志宏等利用變溫和恒溫?zé)崽幚砭茨苊摮葺p型黃邊病毒。利用莖尖培養(yǎng)脫毒法脫毒率與莖尖大小有關(guān),雖莖尖越小,脫毒率越高,但是莖尖越小,存活率越低,而且操作難度加大,容易損傷莖尖。超低溫脫除植物病毒法是基于超低溫保存(Cryopreservation)結(jié)合組織培養(yǎng)和病毒檢測(cè)技術(shù)達(dá)到脫毒的目的。超低溫保存是種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存的一種理想方法。因?yàn)樵谝旱?-196℃)不僅可以長(zhǎng)期保存植物材料,而且可以保證材料的遺傳穩(wěn)定性,并且要求的存貯空間最小,維護(hù)費(fèi)用低。在超低溫處理過(guò)程中,導(dǎo)致細(xì)胞死亡主要發(fā)生在冰凍和凍融期間,在此期間,細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能受到嚴(yán)重?fù)p傷,致死凍融的細(xì)胞難以恢復(fù)生長(zhǎng)而死亡。含有病毒的頂端細(xì)胞液泡較大,胞液中含有的水分也較多,在超低溫保存過(guò)程中易被形成的冰晶破壞致死,而增殖速度較快的分生組織含的水分少,胞質(zhì)濃,抗凍性強(qiáng),不宜被凍死(圖1)。這樣超低溫處理過(guò)的植株再生后可能是無(wú)病毒的,因此,超低溫保存作為一種可能去除病毒的方法而受到人們關(guān)注。Brison等首次報(bào)道采用莖尖超低溫保存方法成功去除了李樹PPV病毒,脫除率達(dá)到50%,而莖尖脫毒只有20%。Helliot等研究表明,香蕉莖尖通過(guò)超低溫保存,2%材料脫除香蕉(CMV),87%材料無(wú)香蕉條紋病毒(BSV)感染,而常規(guī)分生組織方法不能脫除CMV病毒,對(duì)BSV的脫除率只為76%。Wang等用玻璃化超低溫法去除了葡萄病毒A(GVA),成功率高達(dá)97%,而單獨(dú)的分生組織培養(yǎng)脫毒率僅為12%。蔡斌華等首次利用玻璃化超低溫法成功地去除了草莓輕型黃邊病毒(SMYEV),脫毒率達(dá)到95%。白建明等嘗試用超低溫保存法和常規(guī)方法(莖尖分生組織培養(yǎng)、溫?zé)岑煼ㄒ约皽責(zé)岑煼ńY(jié)合莖尖分生組織培養(yǎng))來(lái)去除馬鈴薯試管苗中的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd)和PVX。結(jié)果顯示,馬鈴薯莖尖經(jīng)過(guò)超低溫保存后,存活率和成苗率分別為83.64%和72.04%,高于莖尖分生組織培養(yǎng)(46.67%和31.49%)、溫?zé)岑煼?72.22%和44.44%)以及溫?zé)岑煼ńY(jié)合莖尖分生組織培養(yǎng)(50.54%和30.38%)。4種方法都可以去除PVX,其中超低溫保存法的脫毒率最高,為59.13%,溫?zé)岑煼ńY(jié)合莖尖分生組織培養(yǎng)為56.02%,溫?zé)岑煼ê颓o尖分生組織培養(yǎng)較低,為42.61%和35.83%。曾繼吾等采用玻璃化法超低溫保存技術(shù)保存帶有香蕉束頂病毒(BBTV)的香蕉莖尖,再生后植株BBTV脫除率達(dá)到60.6%,而常規(guī)的莖尖培養(yǎng)對(duì)BBTV的脫除率僅為26.7%。采用玻璃化法超低溫保存還可以去除病原菌的感染,如黃龍病是影響世界柑橘產(chǎn)業(yè)的一種毀滅性病害,目前尚無(wú)有效方法防治,采用玻璃化超低溫法處理使柑橘黃龍病病原菌去除率達(dá)到98.1%,而采用莖尖分生組織脫毒法只有25.3%的植株無(wú)病原菌侵染。番茄小葉病植原體去除率達(dá)100%,而采用莖尖培養(yǎng)只有7%。病毒在植物體內(nèi)的分布是不均勻的,在被感染的植株中莖尖分生組織通常不含有或病毒濃度非常小,病毒滴度隨著離分生穹頂不斷增加的距離而增加。分生穹頂?shù)募?xì)胞具有尺寸小、高核質(zhì)率和含有小液泡的濃厚細(xì)胞質(zhì)的特點(diǎn)。細(xì)胞的液泡隨著離分生穹頂距離的增加而變大。在超低溫保存過(guò)程中,莖尖分生組織細(xì)胞質(zhì)濃、自由水含量低、抗凍能力強(qiáng),這部分細(xì)胞經(jīng)過(guò)液氮保存后能夠成活,但莖尖分生組織外圍的細(xì)胞不具備分生組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),經(jīng)過(guò)液氮保存后,細(xì)胞受到了嚴(yán)重?fù)p傷而死亡,即使保存莖尖較大,能夠成活的部分仍然是位于莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)含有高濃度細(xì)胞質(zhì)的幾層分生細(xì)胞(圖1),這部分分生組織也是莖尖培養(yǎng)脫毒試圖要獲得的部位,經(jīng)過(guò)超低溫保存后再生的植株就來(lái)自這幾層不含病毒的分生細(xì)胞,所以再生材料脫除了病毒。光學(xué)顯微鏡觀察表明,香蕉經(jīng)過(guò)超低溫保存只有靠近分生組織的區(qū)域和葉原基細(xì)胞能夠成活。超微結(jié)構(gòu)研究觀察顯示,香蕉莖尖在超低溫保存過(guò)程中,較大的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化發(fā)生在冷凍或解凍環(huán)節(jié),大部分細(xì)胞發(fā)生了嚴(yán)重?fù)p傷,原生質(zhì)體濃縮嚴(yán)重,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器受到傷害,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性被破壞。但莖尖中仍有小部分細(xì)胞在保存中未造成細(xì)胞器和膜結(jié)構(gòu)的致命損傷,這小部分細(xì)胞位于莖尖(外面只有1~2層葉原基包裹)的頂端分生組織區(qū)域中,體積較小,結(jié)構(gòu)致密,核質(zhì)比率高,分裂旺盛,它們?cè)诟邼B溶液的保護(hù)下,經(jīng)過(guò)一系列合適的脫水及解凍處理,雖然結(jié)構(gòu)發(fā)生了一些變化,但培養(yǎng)后可以可逆性地恢復(fù)生活,由此再生成新的植株。Ding等對(duì)柑橘莖尖超低溫保存后光學(xué)顯微鏡和電鏡觀察結(jié)果也表明,位于頂端分生組織的無(wú)病原危害的小細(xì)胞,因?yàn)榫哂邪|(zhì)濃度大,核質(zhì)比大在液氮保存中可以存活,而有大液泡的大細(xì)胞因?yàn)樗趾扛?經(jīng)液氮保存后死亡。與莖尖培養(yǎng)脫毒法和熱處理脫毒法等傳統(tǒng)的脫毒法相比,超低溫脫毒法不僅脫毒率很高,而且明顯優(yōu)于其他3種方法,主要表現(xiàn)在易于操作;存活率、再生率和脫毒率高;不需要昂貴的儀器;短時(shí)間內(nèi)就可以生產(chǎn)出無(wú)毒植株。2早期植物病毒病的診斷和檢測(cè)技術(shù)通過(guò)不同脫毒途徑獲得的無(wú)病毒植株還必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的病毒鑒定和檢測(cè)手段證明確實(shí)是無(wú)病毒良種種源,并要采取嚴(yán)密的防病毒重復(fù)污染措施才能取得預(yù)期效果。建立快速、高靈敏度、高通量的病毒檢測(cè)體系是病毒病預(yù)防和綜合防治的先決條件。植物病毒檢測(cè)技術(shù)經(jīng)歷了傳統(tǒng)生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)3個(gè)階段。早期對(duì)于植物病毒病的診斷及檢測(cè)的方法主要包括生物學(xué)鑒定和電子顯微鏡技術(shù)。目前,酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)是植物病毒檢測(cè)最為常用的方法之一。但是ELISA方法需要制備抗體,而且一次只能檢測(cè)1種病毒。所以相比較來(lái)說(shuō),最有前途的應(yīng)當(dāng)是分子生物學(xué)技術(shù)。與其他方法相比,它特異性強(qiáng)、靈敏度高,而且不需要制備抗血清以及放射性探針,操作簡(jiǎn)單,適用廣泛,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,分子生物學(xué)方法已經(jīng)成為植物病毒檢測(cè)的重要方法,主要包括核酸雜交技術(shù)、RT-PCR、熒光定量PCR、DNA微陣列技術(shù)等,已在植物病毒檢測(cè)及植物病毒病診斷體系中占有日益重要的地位,植物病毒病診斷途徑將更加趨向多元化,