高原鼠腦組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mrna表達(dá)及腦微血管密度的測(cè)定

高原鼠腦組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mrna表達(dá)及腦微血管密度的測(cè)定

血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)因子（vgf）也被稱為血管透射因子（vpf）或血管松弛素（vacurose）。廣泛分布于動(dòng)物組織中。這是血管內(nèi)皮細(xì)胞的絲狀分裂素，是細(xì)胞因子的一種。VEGF具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增加血管通透性、誘導(dǎo)血管生成等多種功能。有研究表明,低氧上調(diào)VEGF基因的表達(dá),促進(jìn)毛細(xì)血管生長(zhǎng),VEGF基因的表達(dá)水平與微血管密度(microvesseldensity,MVD)成正相關(guān)。動(dòng)物組織中MVD增加,不僅能縮短組織中氧氣擴(kuò)散到細(xì)胞中的距離,而且也增大了組織與血液進(jìn)行氣體交換的面積,從而提高組織獲取氧的效率,增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)能力。高原鼢鼠(Myospalaxbaileyi)屬嚙齒目(Rodentia),倉鼠科(Cricetidae),鼢鼠屬(Mospalax),是一種世居高海拔地區(qū)封閉洞道中的地下鼠,其洞道內(nèi)含氧量比同地區(qū)大氣中低20%,而CO2含量平均高于同地區(qū)大氣中CO2含量7.3~48.6倍。哺乳動(dòng)物的腦是代謝活動(dòng)最旺盛的器官,對(duì)氧的需求量非常大,僅占哺乳動(dòng)物體重2%左右的腦組織耗氧量卻占全身耗氧量的20%。高原鼢鼠與地面生存的高原鼠兔(Ochotonacurzniae)以及生活在低海拔地區(qū)的Sprague-Dawley(SD)大鼠相比,其洞道生境特征不僅是低氧,而且是高CO2濃度。高原鼢鼠腦組織中VEGF基因的表達(dá)以及MVD受低氧和高CO2濃度的雙重調(diào)節(jié),與高原鼠兔和SD大鼠可能存在差異。到目前為止,有關(guān)不同低氧生境下哺乳動(dòng)物物種間腦組織中VEGF基因mRNA的表達(dá)和MVD的比較研究尚未見報(bào)道。因此,本文通過測(cè)定高原鼢鼠、高原鼠兔和SD大鼠腦組織中VEGF基因mRNA的表達(dá)和MVD,并進(jìn)行比較,以期進(jìn)一步探討高原鼢鼠對(duì)低氧和高CO2環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的制備高原鼢鼠捕于青海省湟中地區(qū)(海拔約3200m),高原鼠兔捕于海北州門源縣(海拔約3200m),SD大鼠購于青海省地方病預(yù)防控制所動(dòng)物中心(海拔約2300m),所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于實(shí)驗(yàn)室中腹腔注射5%戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉,處死動(dòng)物后取腦和肝組織,置入液氮罐中保存。各組動(dòng)物樣本數(shù)為7只。1.2方法1.2.1高原地帶大鼠vegf基因克隆1.2.1.總rna的提取用UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)提取高原鼢鼠肝臟組織總RNA,提取的RNA置于1.5mL離心管中-70°C保存。1.2.1.pcr擴(kuò)增及測(cè)序引物設(shè)計(jì):在GenBank中下載大鼠(Rattusnorvegicus,NM_031836.2)、小鼠(Musmusculus,NM_001025250.3),地下鼠(Spalaxehrenbergi,AF186236.1)、金倉鼠(Mesocricetusauratus,AF063013.1)和白足鼠(Peromyscusleucopus,DQ358740.1)的VEGFmRNA序列,運(yùn)用DNA-MAN軟件進(jìn)行同源性比對(duì),用Primer5.0在保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物。上游引物:5’-ATGAACTTTCTGCT-STCTTGGRTGC-3’;下游引物:5’-TCACCGCCT-TGGCTTGTCACA-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物片段為645bp左右。目的基因的擴(kuò)增及回收:提取的RNA用EasyScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)合成第一鏈cDNA后,用設(shè)計(jì)的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段,PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:94°C5min;94°C30s,60°C30s,72°C1min,38個(gè)循環(huán);72°C5min。紫外燈下觀察為單一條帶。然后按EZ-10spincolumnDNAGelExtractionKit(上海生工生物工程有限公司)試劑盒操作,切膠回收,回收產(chǎn)物置于1.5mL離心管-20°C保存。PCR產(chǎn)物測(cè)序:進(jìn)行TA克隆,在微量離心管中依次加入PCR產(chǎn)物4μL和1μLPEASY-T1CloningVector,輕輕混合,室溫(22~37°C)反應(yīng)5min。反應(yīng)結(jié)束后,將離心管置于冰上。加連接產(chǎn)物于50μLTrans1-T1感受態(tài)細(xì)胞(在感受態(tài)細(xì)胞剛剛解凍時(shí)加入連接產(chǎn)物),輕彈混勻,冰浴20~30min。42°C熱激30~45s,立即置于冰上2min。加250μL平衡至室溫的液體培養(yǎng)基(LB),200r/min,37°C孵育1h。將LB固體培養(yǎng)基融化,降溫至55°C左右后加入氨芐青霉素至終濃度50~100μg/mL,倒板后置于37°C烘箱30min。配制500mmol/LIPTG和40mg/mLX-Gal,按每板8μLIPTG和40μLX-Gal涂板,置于37°C烘箱30min。取200μL菌液鋪板,37°C倒置培養(yǎng)過夜(為得到較多克隆,4000r/min離心1min,棄掉部分上清,保留100~150μL,輕彈懸浮菌體,取全部菌液涂板,培養(yǎng)過夜),第二天觀察藍(lán)白斑,挑取白斑單克隆于10mL液體培養(yǎng)基中,37°C水浴3~4h后混勻,提取質(zhì)粒,選擇陽性克隆,送北京華大基因有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將獲得的序列在GenBank進(jìn)行Blast比較分析。1.2.2生物信息分析1.2.3免疫組織化學(xué)每組動(dòng)物中隨機(jī)選取5只做光鏡檢測(cè)。每只動(dòng)物腦組織縱切和橫切的的切片數(shù)均不少于5片。取腦組織橫切約3mm×10mm×10mm大小,縱切3mm×10mm×10mm大小,4%中性甲醛液固定,室溫固定24h。常規(guī)脫水、石蠟包埋,LeicaRM2135切片機(jī)(德國(guó))行4μm切片。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中一抗為CD34兔抗大鼠多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司),1∶40稀釋;二抗為PV-6001檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,微波抗原修復(fù);滴加3%H2O2去離子水室溫孵育10min;滴加一抗4°C過夜;滴加山羊抗兔IgG抗體-辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)多聚體,室溫孵育20min;DAB顯色后蘇木精復(fù)染中性樹膠封片,染色結(jié)果在OlympusBX51顯微鏡(日本)下觀察,OlympusDP70圖像采集系統(tǒng)(日本)取圖。免疫組織化學(xué)染色切片按Weidmer等的方法,每張選取熱點(diǎn)區(qū)拍照8張。采用Image-ProPlus6.0圖像分析系統(tǒng)(德國(guó))測(cè)量MVD。1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量pcrTRIZOL(Invitrogenlifetechnologies)法提取每組動(dòng)物中腦組織的總RNA,用NanoDrop?ND-1000測(cè)定RNA濃度和純度,RNA溶液的A260/A280的比值都在1.8到2.1之間。瓊脂糖變性電泳檢測(cè)所提取的RNA的完整性,紫外燈下拍照,28S與18S的條帶清晰而明亮,5S條帶較淺,說明提取出的RNA較完整。然后使用樣品RNA進(jìn)行cDNA合成,合成的cDNA用于SYBRGreenΙ實(shí)時(shí)熒光定量。從GenBank中找到相關(guān)物種基因的cDNA序列,輸入到Primer5.0軟件中,通過核酸序列的同源比對(duì)找到目的基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物。GAPDH引物:F:5’-AAGAAGGTGGT-GAAGCAGGC-3’;R:5’-TCCACCACCCTGTTGCT-GTA-3’。VEGF引物:F:5’-CTGGTGGACATCTTC-CAGGAG-3’;R:5’-CTCATCTCTCCTATGTGCTGG-3’。分別將制備用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的梯度稀釋DNA模板針對(duì)每一需要測(cè)量的基因和管家基因,選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng),將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋:設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1,分別稀釋為1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7這幾個(gè)梯度濃度的DNA。然后進(jìn)行Real-timePCR反應(yīng),幾個(gè)梯度稀釋的DNA模板以及所有cDNA樣品分別配置RealtimePCR反應(yīng)體系。根據(jù)繪制的梯度稀釋DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線,各樣品目的基因和管家基因的濃度結(jié)果直接由機(jī)器生成。每個(gè)樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度,即為此樣品此基因的校正后的相對(duì)含量(實(shí)際處理方法:目的基因濃度的對(duì)數(shù)除以內(nèi)參濃度的對(duì)數(shù))。1.3正態(tài)性和方差的同質(zhì)性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)用SPSS(version11.0)統(tǒng)計(jì)軟件處理,采用Kolmogorov-Simirnov和Levence分別檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差的同質(zhì)性。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布并具有同質(zhì)性,用One-WayANOVA進(jìn)行方差分析,采用Duncan’s多重比較,數(shù)據(jù)表示為mean±SD。2結(jié)果2.1高原上的大鼠vegf基因編碼區(qū)域及其蛋白預(yù)測(cè)2.1.1高原鼠vegf基因編碼區(qū)與高原鼠兔、大鼠和小鼠的同源性分析高原鼢鼠VEGF基因的編碼區(qū)為645bp,通過DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì),結(jié)果表明,高原鼢鼠VEGF基因編碼區(qū)與高原鼠兔、大鼠和小鼠的同源性分別為92.1%、93.6%和93.8%。2.1.2vegf-堿基的檢測(cè)高原鼢鼠VEGF基因編碼區(qū)編碼214個(gè)氨基酸,在N端包含一個(gè)26個(gè)氨基酸的信號(hào)肽,成熟的蛋白含188個(gè)氨基酸。因此命名高原鼢鼠VEGF的異型體為VEGF188。圖2顯示其堿基和多肽全長(zhǎng)序列、信號(hào)肽及功能域位點(diǎn)。預(yù)測(cè)的功能域位點(diǎn)包括酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(CK-2)、N-糖基化位點(diǎn)(N-glocosylationsite),N-酰基化位點(diǎn)(N-myristoylationsite),蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(PKC)和cAMP依賴的蛋白磷酸化位點(diǎn)(cAMP)。2.2在高原鼠兔和高原鼠兔之間的生長(zhǎng)特性高原鼢鼠大腦組織中VEGF基因mRNA表達(dá)水平顯著低于SD大鼠(P<0.05),與高原鼠兔沒有明顯的差異。無論是橫切還是縱切,高原鼢鼠腦組織中MVD顯著大于高原鼠兔(P<0.05),高原鼠兔顯著大于SD大鼠(P<0.05)(表1和圖4)。3vegf基因前體mna的基因表達(dá)高原鼢鼠和高原鼠兔是生活在青藏高原高海拔地區(qū)的兩種動(dòng)物,高原鼢鼠是終生生活在封閉洞道中的地下鼠。因此,兩種高原動(dòng)物都生存在低氧環(huán)境中,只是低氧程度不同。有研究顯示,高原鼢鼠和高原鼠兔肺擴(kuò)散容量大、心率低、紅細(xì)胞數(shù)高、紅細(xì)胞壓積低和平均紅細(xì)胞容積低、血紅蛋白氧親和力高、動(dòng)脈血與靜脈血的氧血紅素飽和度差值高,這些生理特征利于提高肺的氧擴(kuò)散能力,增加血液攜氧量,減小血液循環(huán)阻力,從而提高血氧利用率,這是兩種高原動(dòng)物長(zhǎng)期適應(yīng)低氧的結(jié)果。研究表明,在腦組織中VEGF基因的高表達(dá)和MVD的明顯增加發(fā)生在胚胎發(fā)育期和幼鼠期。本文研究結(jié)果表明,高原鼢鼠、高原鼠兔和SD大鼠腦組織中MVD依次減小,且差異顯著(P<0.05),與其所處的環(huán)境低氧程度的差異表現(xiàn)出一致性,而促進(jìn)毛細(xì)血管增生的VEGF基因在mRNA水平的表達(dá)量卻呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。我們認(rèn)為這與高原鼢鼠、高原鼠兔和SD大鼠的個(gè)體發(fā)育階段有關(guān),本文研究所用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為成年動(dòng)物,高原鼢鼠、高原鼠兔和SD大鼠胚胎和幼鼠所處環(huán)境的低氧程度顯然不同,在不同環(huán)境低氧條件的誘導(dǎo)下,在個(gè)體發(fā)育的早期形成了高原鼢鼠、高原鼠兔和SD大鼠腦組織MVD的顯著差異。其次,可能與高原鼢鼠、高原鼠兔和SD大鼠腦組織中VEGF的亞型組成、不同亞型VEGF的表達(dá)水平高低以及不同亞型VEGF對(duì)低氧的敏感性不同有關(guān)。VEGF基因前體mRNA不同剪接方式形成5種VEGF亞型,所有的亞型都包含1~5外顯子,不同亞型中外顯子6~8的組合方式不同。5種VEGF亞型根據(jù)氨基酸的長(zhǎng)短分別命名為VEGF206(包含所有外顯子及部分第7個(gè)內(nèi)含子)、VEGF189(包含所8個(gè)外顯子)、VEGF165(缺少外顯子6)、VEGF145(缺少外顯子7)及VEGF121(缺少外顯子6和7)。由于VEGF進(jìn)化上有高度的保守性,人與鼠類的差異只有一個(gè)氨基酸,所以在鼠中相應(yīng)為VEGF120、VEGF144、VEGF164、VEGF188和VEGF205。不同的組織含有不同種類、比例的亞型,一般情況下VEGF165為最主要的亞型。目前無論是在正常組織還是病理中,都以VEGF165的表達(dá)最高,是其生物學(xué)作用的主要形式。體外研究表明,VEGF121和VEGF165能促進(jìn)培養(yǎng)的牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,而VEGF189和VEGF206不能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。研究表明,在高原鼢鼠腦組織中主要有VEGF120、VEGF164和VEGF188,其中以VEGF164和VEGF120為主,在高原鼠兔腦組織中主要有VEGF189和VEGF165,其中以VEGF189為主,在大鼠腦組織中主要有VEGF120、VEGF164、VEGF188和VEGF205,其中以VEGF164和VEGF120為主。隨著高原鼠兔生存海拔高度的升高(從3200m到4700m),其腦組織中總VEGFmRNA表達(dá)量顯著升高,其中VEGF165mRNA表達(dá)量沒有變化,但VEGF189mRNA表達(dá)量顯著升高。上述結(jié)果提示,高原鼢鼠和大鼠腦組織中VEGF主要亞型組成為VEGF164和VEGF120,高原鼠兔腦組織中VEGF主要亞型組成為VEGF165和VEGF189,并且在高原鼠兔腦組織中VEGF189mRNA表達(dá)水平顯著高于VEGF165mRNA表達(dá)水平,而在高原鼢鼠和大鼠中VEGF164mRNA表達(dá)水平顯著高于VEGF188mRNA表達(dá)水平。但是高原鼢鼠、高原鼠兔和SD大鼠組織中不同VEGF亞型表達(dá)水平、不同VEGF亞型表達(dá)對(duì)低氧的敏感程度以及不同VEGF亞型對(duì)微血管生長(zhǎng)的作用強(qiáng)弱,到目前為止尚無系統(tǒng)的比較研究,需進(jìn)一步探討。另外,在單純慢性低氧條件下,大鼠腦組織MVD增加,而在低氧、高CO2濃度條件下,大鼠腦組織MVD減小。因此,高原鼢鼠腦組織表現(xiàn)出較低總VEGFmRNA表達(dá)水平,可能與環(huán)境高濃度CO2對(duì)VEGF基因表達(dá)的抑制作用有關(guān)。終生生活在地下洞道中的鼴鼠,其組織MVD顯著高于平原大鼠。本文研究結(jié)果表明,在高原鼢鼠、高原鼠兔和SD大鼠腦組織中,