家禽用飼料品質(zhì)檢驗(yàn)-有毒有害成分的測定

項(xiàng)目三：家禽用飼料品質(zhì)檢驗(yàn)反相HPLC方法開發(fā)方法建立的一般步驟了解基本情況明確分離目的選擇分離模式前期準(zhǔn)備檢索文獻(xiàn)方法具體試驗(yàn)短柱長、高流速、標(biāo)準(zhǔn)品、高強(qiáng)度洗脫液參照文獻(xiàn)方法調(diào)節(jié)k’值改變保留值調(diào)節(jié)α值改變選擇性調(diào)節(jié)柱長度改變柱效及分離速度方法建立的一般步驟調(diào)節(jié)k’值改變保留值調(diào)節(jié)α值改變選擇性改變流動(dòng)相中有機(jī)相比例60/4050/5040/60通過改變流動(dòng)相組成改變選擇性方法建立的一般步驟調(diào)節(jié)α值改變選擇性通過改變固定相改變選擇性C-18C-81、分析時(shí)要了解的情況想辦法得到各種信息向同行了解是否做過此類樣品，或有否類似樣品的分析方法查文獻(xiàn)和方法儀器制造商的文獻(xiàn)掌握分離機(jī)理，自己開發(fā)方法充分了解自己的樣品樣品所含化合物的數(shù)目、種類（官能團(tuán)）、分子量、pKa值、UV光譜圖以及樣品基體的性質(zhì)（溶劑、填充物等）、化合物在有關(guān)樣品中的濃度范圍、樣品的溶解度等。1、分析時(shí)要了解的情況靈敏度的要求有多高?樣品的本底是否很復(fù)雜?是否已知樣品所有成分的化學(xué)特性？有多少組分要分析?是否有必要解析出樣品的所有成分？對分析的精確度、準(zhǔn)確度等有多高要求?定量分析？定性分析？是否因是日常檢驗(yàn)，而要求方法容易使用?本法將適用幾種樣品分析還是許多種樣品分析？一次分析多少樣品？2、確定樣品的預(yù)處理方式可直接進(jìn)樣的溶液需稀釋、pH緩沖、加入內(nèi)標(biāo)物或其它定容操作的溶液：多用流動(dòng)相進(jìn)行稀釋定容需要首先溶解或提取處理的固體樣品需預(yù)處理除去干擾物或消除“柱殺手”3、分離模式的選擇4、具體試驗(yàn)的一般步驟先用一根短的色譜柱用相對較高的流速使用盡可能純度高的標(biāo)準(zhǔn)品先用高強(qiáng)度的洗脫液調(diào)節(jié)k’值改變保留值調(diào)節(jié)α值改變選擇性調(diào)節(jié)柱長度改變柱效及分離速度記住∶

每次改變一個(gè)參數(shù)5、使用文獻(xiàn)方法的注意點(diǎn)色譜柱填料的種類、品牌是否相同?注意文獻(xiàn)方法的流動(dòng)相是否損害色譜柱?如色譜填料品牌不同，需要調(diào)整流動(dòng)相注意色譜柱的規(guī)格：內(nèi)徑、柱長需要調(diào)整流速、進(jìn)樣量注意梯度條件了解系統(tǒng)的滯后體積（梯度）6、反相HPLC方案的設(shè)計(jì)步驟1、確定樣品是屬于常規(guī)的還是特殊的

特殊樣品包括：無機(jī)離子對映體生物分子合成的高分子碳水化合物異構(gòu)體6、反相HPLC方案的設(shè)計(jì)步驟2、選擇分離條件，進(jìn)行第一次分離分離變量最佳的初始選擇柱填料C8

或C18柱結(jié)構(gòu)15*0.46mm

或25*0.46mm，5μm流速1.5-2.0mL/min（注意柱壓限制）流動(dòng)相乙腈—水（中性樣品）乙腈—緩沖液（離子型樣品）（緩沖液為25-50mM磷酸緩沖液，pH2—3）對初始試驗(yàn)：5→100%B梯度溫度常溫進(jìn)樣量體積＜50μL（20μL）；質(zhì)量<100μg反相HPLC首次分離的建議實(shí)驗(yàn)條件6、反相HPLC方案的設(shè)計(jì)選擇流動(dòng)相在反相色譜中常用水/乙腈pH的選擇思路

選低pH可以使柱硅羥基質(zhì)子化并降低其色譜活性低pH與常見酸堿官能團(tuán)的pKa值相差較遠(yuǎn)，組分在此條件下的tR受pH變化影響小

初期應(yīng)避免使用三乙胺和離子對試劑等添加劑選擇逐步方法開發(fā)步驟用強(qiáng)洗脫液開始等梯度洗脫，此后每次運(yùn)行降低洗脫液強(qiáng)度

梯度嘗試運(yùn)行6、反相HPLC方案的設(shè)計(jì)第一次HPLC運(yùn)行

準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)樣品

過濾樣品

安裝色譜柱

沖洗柱，平衡

平衡檢測器

進(jìn)樣

分析結(jié)果第一次HPLC運(yùn)行得到的結(jié)果可能是：

無峰/響應(yīng)

分離度差的峰

檢測方法不正確

濃度太稀提高進(jìn)樣濃度，或者在無色譜柱的條件下注射少量樣品改變流動(dòng)相優(yōu)化系統(tǒng)得到了色譜峰-是

-否檢查

HPLC系統(tǒng)6、反相HPLC方案的設(shè)計(jì)步驟3、做初次運(yùn)行并根據(jù)譜圖將樣品分類等度洗脫可行的樣品建議用梯度洗脫的樣品反相保留太弱的樣品改變pH、加入離子對試劑、改變柱子、改用正相色譜強(qiáng)保留樣品用非水反相或正相條件復(fù)雜樣品6、反相HPLC方案的設(shè)計(jì)步驟4、對等度方法，用初始梯度運(yùn)行來估計(jì)第二次等度運(yùn)行的最佳B%步驟5、評價(jià)第二次運(yùn)行中峰的質(zhì)量--柱效、峰寬、峰形

★峰太寬或不對稱：要改變初始的分離條件（柱子、pH、添加劑等）

★運(yùn)行情況良好：平行實(shí)驗(yàn)，保證柱平衡和可重復(fù)的保留時(shí)間步驟6、

★對等度方法，可以改變ACN%來改善峰間距和分離度★若有必要，將ACN改為MeOH，并根據(jù)峰間距和分離度優(yōu)化MeOH%★可以進(jìn)一步混合ACN和MeOH成為三元溶劑系統(tǒng)，并優(yōu)化步驟7、若6方法中分離不充分，則可以改變分離的選擇性和分離的附加條件6、反相HPLC方案的設(shè)計(jì)步驟8、對梯度方法，用改變梯度變化速度和柱溫來優(yōu)化峰間距和分離度

★結(jié)果滿意，可以按等度分離方法優(yōu)化溶劑類型★分離不充分，則可以改變分離的選擇性和分離的附加條件步驟9、對梯度方法，改變初始和最后的B%、梯度變化速度、梯度形狀可以改善分離度或縮短運(yùn)行時(shí)間步驟10、對等度或梯度方法，改變一個(gè)柱條件（柱長、流速、填料尺寸）可以提高分離度或降低運(yùn)行時(shí)間項(xiàng)目三：家禽用飼料品質(zhì)檢驗(yàn)分離系統(tǒng)常見故障1、手動(dòng)進(jìn)樣器常見故障側(cè)面（或接口處）滲漏轉(zhuǎn)子密封墊圈松緊不合適墊圈不配套組裝不對解決辦法重新組裝堵塞,樣品打不進(jìn)去樣品管堵塞解決辦法環(huán)管用反沖法或超聲清洗排除（或換新管)1、手動(dòng)進(jìn)樣器常見故障裝樣時(shí)針頭周圍滲漏孔道堵塞放空管和樣品管太細(xì)，阻力太大針頭密封管規(guī)格不對，針頭太細(xì)放空管有虹吸現(xiàn)象轉(zhuǎn)子密封面上孔之間有磨損解決辦法清洗進(jìn)樣閥更換進(jìn)樣針為防止虹吸,放空管末端應(yīng)在放空瓶液面以上更換磨損的轉(zhuǎn)子1、手動(dòng)進(jìn)樣器常見故障樣品滯留閥在進(jìn)樣位置停留時(shí)間不夠殘留樣品留在樣品環(huán)中或注射器中，或從放空管中虹吸回來，污染下一個(gè)樣品管路接頭有死體積滯留樣品，很難沖洗干凈解決辦法要求停留時(shí)間至少應(yīng)讓流動(dòng)相流過的體積是環(huán)體積的10-20倍，一般是在下一針進(jìn)樣前才將閥扳到裝樣位置可用5-10倍的流動(dòng)相或新樣品沖洗注射孔和注射器，若是虹吸，應(yīng)加限制管應(yīng)檢查裝配情況，確定是否需換新配件2、自動(dòng)進(jìn)樣器常見故障樣品瓶不配套

瓶小——針彎、折斷瓶大——樣品少，抽不上樣瓶破碎解決辦法更換合適的樣品瓶進(jìn)樣器針頭堵塞樣品、緩沖鹽、隔墊碎片、針頭本身解決辦法可用溶劑清洗，金屬絲疏通，或換新針頭2、自動(dòng)進(jìn)樣器常見故障樣品滯留空白溶劑出現(xiàn)色譜峰解決辦法樣品瓶隔墊污染加倍清洗調(diào)整進(jìn)樣順序，從低濃度開始，高濃度放后面在樣品瓶前放清洗液瓶3、色譜柱常見故障故障現(xiàn)象解決辦法過濾片堵塞壓力增高、n下降、峰形差倒柱沖洗或換過濾片柱頭塌陷峰分叉、n下降修補(bǔ)柱頭鍵合相流失保留值改變、峰形差、n下降換柱樣品堵塞壓力高用能溶解樣品的溶劑沖洗強(qiáng)吸收樣品n下降、保留值小強(qiáng)溶劑反沖3、色譜柱常見故障問題塔板數(shù)下降樣品處理不合適，選擇適當(dāng)?shù)臉悠穬艋椒ǎx擇合適流動(dòng)相

柱頭塌陷，填裝修補(bǔ)問題峰形變壞

出現(xiàn)拖尾峰，分叉峰，非高斯峰，與塔板數(shù)下降有關(guān)

峰形壞但保留時(shí)間不變，可能是柱堵塞（不銹鋼燒結(jié)片，更換過濾片），或柱頭有空穴，填裝修補(bǔ)3、色譜柱常見故障問題柱壓突然增大濾片被流動(dòng)相或樣品中顆粒堵住

用0.25μm濾膜除去微量雜質(zhì)

樣品沉積在柱內(nèi)

用能溶解樣品的溶劑沖洗（斷開柱和檢測器的連接）,可正向沖，反向沖

柱內(nèi)硬件有問題：

濾片堵塞，換新片或清洗

塌陷，用相同填料填充、修補(bǔ)柱床膨脹不可逆吸附細(xì)菌生長使用1：1的硝酸溶液超聲清洗5min，再用水、甲醇清洗除去水份3、色譜柱常見故障問題保留時(shí)間改變不同柱保留時(shí)間的變化，主要是填料差異造成的不同牌號柱出峰順序不變，保留時(shí)間有小的變化若峰順序變化，保留時(shí)間變化較大

考慮換柱或優(yōu)化分離條件新柱柱效低柱外死體積大

更換連接管，重新連接色譜柱，降低死體積樣品在流動(dòng)相中溶解不好，影響傳質(zhì)過程

使用合適的流動(dòng)相或使用流動(dòng)相溶解樣品問題3、色譜柱常見故障問題舊色譜柱柱效低，分離不好柱入口床層塌陷

用同型填料填補(bǔ)柱效可部分恢復(fù)填料被流動(dòng)相溶蝕而流失

對硅膠質(zhì)填料，流動(dòng)相PH值在2—7范圍內(nèi)，否則可能被溶蝕舊色譜柱柱效低分離不好，有時(shí)出現(xiàn)雙峰柱入口填料被污染變質(zhì)

用強(qiáng)溶劑沖洗

刮除被污染的床層，用同型的填料填補(bǔ)柱效可部分恢復(fù)

污染嚴(yán)重，則廢棄或重新填裝問題3、色譜柱常見故障問題新柱接到儀器上后，柱頭漏液柱接頭與儀器之間連接管的壓環(huán)變形量不夠

用扳手順時(shí)針方向擰緊1／4圈直到不漏液為止問題新柱接到儀器上后，檢測器出口不斷有小氣泡出現(xiàn)柱放置時(shí)間過長柱內(nèi)充裝的液體己揮發(fā)干

繼續(xù)開泵，用流動(dòng)相將柱內(nèi)氣體置換掉流動(dòng)相脫氣不徹底，特別是MeOH／H2O體系由于氫鍵作用很容易出現(xiàn)氣泡配好流動(dòng)相后一定要進(jìn)行脫氣處理3、色譜柱常見故障問題新柱接到儀器上后，啟動(dòng)儀器沒有柱壓降柱放置時(shí)間過長柱內(nèi)充裝的液體己揮發(fā)干

繼續(xù)開泵，用流動(dòng)相將柱內(nèi)氣體置換掉問題新柱接到儀器上后，柱壓降不斷增加，甚至超過儀器的耐壓限柱入口濾片被固體顆粒堵塞更換或清洗柱入口濾片柱入口濾片被霉菌堵塞

用0.25μm過濾膜過濾流動(dòng)相除去微小顆粒物3、色譜柱常見故障問題進(jìn)樣次數(shù)增加柱壓降逐漸增加樣品中含有不溶于流動(dòng)相的微小顆粒物

用0.25μm過濾膜過濾樣品樣品在流動(dòng)相中析出微小結(jié)晶

推薦使用流動(dòng)相溶解樣品問題進(jìn)樣量增大與峰面積增加不成正比，即進(jìn)樣量與峰面積不是線性關(guān)系樣品在流動(dòng)相中的溶解度小，只有部分樣品被流動(dòng)相沖入色譜柱中，而另一部分則沉積在柱入口端

用流動(dòng)相溶解樣品

樣品的濃度不宜太大

進(jìn)樣量不宜過大3、色譜柱常見故障問題柱使用一段時(shí)間后，柱效下降，出現(xiàn)雙峰柱入口床層被污染使柱填料變質(zhì)用強(qiáng)溶劑沖洗除去雜質(zhì)問題柱使用一段時(shí)間后，柱效下降，出現(xiàn)峰拖尾柱入口床層被污染

用強(qiáng)溶劑沖洗20-30min，若效果不明顯應(yīng)廢棄問題使用—段時(shí)間后，柱效下降，分離不好柱填料被流動(dòng)相溶解而流失如柱床層塌陷，用相同型號填料填補(bǔ)柱填料被樣品雜質(zhì)污染

推薦使用保護(hù)柱或用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱除去污染雜質(zhì)3、色譜柱常見故障問題用5μm顆粒填料柱時(shí)，以MeOH／H20作流動(dòng)相柱壓較高

MeOH與水之間由于氫鍵作用黏度增大可用乙腈／水體系使柱壓降低，分離效率更好問題使用緩沖液作流動(dòng)相時(shí)，柱壓降升高很快霉菌生長所致

如流動(dòng)相中加入有毒物質(zhì)或加疊氯化鈉防止霉菌生長實(shí)驗(yàn)結(jié)束后按要求用MeOH和水沖洗后關(guān)機(jī)問題流動(dòng)相洗滌強(qiáng)度由弱漸強(qiáng)時(shí)出現(xiàn)很多雜質(zhì)峰強(qiáng)溶劑將弱溶劑洗不出的雜質(zhì)沖出來，不影響柱的性能3、色譜柱常見故障問題柱使用一段時(shí)間后保留值逐漸縮短柱中固定相流失所致

更換色譜柱

檢查所用的色譜條件是否合適問題在UV色譜圖中，靠近死時(shí)間處出現(xiàn)負(fù)峰進(jìn)樣時(shí)壓力波動(dòng)所致

采用閥進(jìn)樣樣品溶液比流動(dòng)相的UV吸收值低采用流動(dòng)相溶解樣品項(xiàng)目三：家禽用飼料品質(zhì)檢驗(yàn)檢測系統(tǒng)常見故障1、紫外檢測器常見故障燈故障:基線噪聲大，靈敏度低氘燈壽命:1000h；汞燈和鎢燈壽命:2000h

一般使用6個(gè)月以上可能接近壽命期限,可以考慮更換新燈流通池流動(dòng)池內(nèi)有氣泡

脫氣甲醇，不同流量沖洗

池堵塞（入口、出口、池內(nèi)）

用可溶堵塞物的溶劑沖洗（緩沖鹽用水沖洗）

池污染

異丙醇、二氯甲烷、6mol/LHNO3

沖洗1、紫外檢測器常見故障量池和參比池失配

UV以空氣為參比，一般不扣流動(dòng)相本底若用有紫外吸收的流動(dòng)相，參比信號不為零，會出現(xiàn)倒峰和偽峰

此時(shí)，選擇合適的流動(dòng)相時(shí)間常數(shù)選擇（可過濾噪聲）時(shí)間常數(shù)太小,噪聲增大時(shí)間常數(shù)太大,出現(xiàn)寬峰、拖尾或矮峰

時(shí)間常數(shù)的設(shè)置一般根據(jù)經(jīng)驗(yàn)估計(jì)，小顆粒柱常數(shù)小，可選最窄峰寬的1/10作為時(shí)間常數(shù)，對4.6×(150-250)mm，5um柱，可選0.5sor1s2、其他故障響應(yīng)值超出線性范圍樣品量太大檢測器的衰減超出了其線性動(dòng)力學(xué)范圍流動(dòng)相的紫外吸收比較強(qiáng)溫度影響環(huán)境溫度變化引起基線漂移流動(dòng)相溫度變化引起折射率改變，紫外光傳導(dǎo)變化柱溫變化引起基線漂移2、其他故障信號線故障記錄儀和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)信號線插接不緊，接觸不良，信號很弱，出現(xiàn)不需要的噪音，此時(shí)按說明書檢查線路連接。地線對儀器很重要,儀器外殼和信號線的接地很嚴(yán)格，接地不良會出現(xiàn)較大的基線噪聲，接錯(cuò)線會造成短路，燒毀儀器。波長問題次級發(fā)射效應(yīng)：用氘燈作可見光范圍的光源時(shí)會發(fā)生次級發(fā)射效應(yīng)，用鎢燈沒有此影響。正確選擇波長：既照顧到靈敏度，又考慮到穩(wěn)定性。波長校準(zhǔn)：機(jī)械轉(zhuǎn)動(dòng)光柵選擇波長，因磨損造成所選波長與刻度盤上的不一致，而且重復(fù)性也差。項(xiàng)目三：家禽用飼料品質(zhì)檢驗(yàn)輸液系統(tǒng)常見故障1、儲液器常見故障脫氣不充分（噪聲大，出毛刺）

用He脫氣，真空脫氣，超聲脫氣，加熱回餾脫氣（混合流動(dòng)相不宜）流動(dòng)相供給不暢，泵壓力不穩(wěn)流動(dòng)相接近用完過濾器堵塞（有顆粒，長霉）流速過高，阻力大，造成空化現(xiàn)象。解決辦法重新脫氣解決辦法降低流速；換大孔過濾器；加大管路內(nèi)徑；抬高儲液器1、儲液器常見故障儲液器或流動(dòng)相被污染（產(chǎn)生有規(guī)則的噪聲；基線上升，梯度洗脫出鬼峰）

溶劑質(zhì)量差（含雜質(zhì)多）配流動(dòng)相的玻璃器皿不合格，微生物影響

配制流動(dòng)相的操作不當(dāng)（過濾、脫氣、攪拌）解決辦法清洗相關(guān)玻璃器皿、更換高質(zhì)量試劑、重新配置2、輸液泵常見故障球和閥座粘在一起，堵死，打不出溶劑（無流動(dòng)相流出）

*這種情況一般發(fā)生在使用緩沖鹽流動(dòng)相時(shí)解決辦法用高質(zhì)量的溶劑沖洗，不同極性溶劑沖洗,如水、甲醇、異丙醇、二氯甲烷···，更換新單向閥。球和閥座密封不嚴(yán)，壓力不穩(wěn)，氣泡進(jìn)入閥中，緊貼在閥體內(nèi)，使球難以返回閥座，引起倒流，壓力和流速變化大

*閥中可能有小晶體顆粒解決辦法打開排液閥，大流量沖洗，用脫過氣的甲醇沖洗，一般可解決問題。2、輸液泵常見故障泵墊圈磨損或破碎：高壓下壓力不穩(wěn)，從泵頭往外滲漏流動(dòng)相，色譜峰的保留時(shí)間改變解決辦法更換新墊圈。更換方法按維修說明書上的方法一步步操作。注意輸液泵的墊圈要和流動(dòng)相匹配協(xié)調(diào)。多數(shù)墊圈和流動(dòng)相是協(xié)調(diào)的,但有的墊圈適用于甲醇、水、乙腈，在四氫呋喃中溶解、變粘、變軟。2、輸液泵常見故障柱塞桿故障磨損、漏液使用不當(dāng)被折斷柱塞桿被卡住，不能運(yùn)動(dòng)解決辦法更換柱塞桿。請維修工程師幫助解決，或參照專門的操作手冊自己動(dòng)手更換。項(xiàng)目三：家禽用飼料品質(zhì)檢驗(yàn)液相色譜常見的一些故障基線噪音可能的原因：

﹠流動(dòng)池臟

﹠檢測器燈有問題

﹠如果是周期性的，電壓或泵的脈沖

﹠溫度對檢測器的影響

﹠氣泡經(jīng)過檢測器Time(min.)基線漂移可能的原因：

﹠梯度洗脫﹠溫度不穩(wěn)定(示差檢測器）﹠流動(dòng)相中有污染物﹠柱中的流動(dòng)相沒有平衡﹠體系中有污染物流出鬼峰即使不進(jìn)樣也會出現(xiàn)的峰問題1-流動(dòng)相臟問題2-容器污染問題3-柱子污染20%-100%MeOH沒有進(jìn)樣60153015037