吉林省羊傳染性膿皰病血清學(xué)檢測(cè)與分析

吉林省羊傳染性膿皰病血清學(xué)檢測(cè)與分析

綿羊感染通常被稱為“羊口傷口”。它是由羊感染的病毒（或f.v）引起的。綿羊、山羊和其他中小型反芻動(dòng)物以及人類的急性和高度接觸的動(dòng)物共同感染的。ORFV為痘病毒科(Poxviridae)副痘病毒屬(Parapoxvirus)成員,主要侵害3～6月齡羔羊,引起感染皮膚部位和黏膜的增生性病變,臨床上以在感染動(dòng)物的唇、鼻孔周圍、口腔、乳房以及尾根等部位皮膚/黏膜形成紅斑、丘疹、水皰、膿皰和疣狀痂皮為特征。該病自1787年首次發(fā)生于英國(guó)以來(lái),澳大利亞、新西蘭、南非、意大利、印度等多個(gè)養(yǎng)羊國(guó)家和地區(qū)均有報(bào)道。我國(guó)最早有關(guān)該病的文獻(xiàn)記載是廖延雄等1955年撰寫(xiě)的西北綿羊“口瘡”之初步報(bào)告。自此以后,新疆、西藏、甘肅、內(nèi)蒙、陜西、四川、云南、福建以及東北三省等多個(gè)養(yǎng)羊省區(qū)均有該病發(fā)生和流行的報(bào)道。近年來(lái),世界各養(yǎng)羊國(guó)家和地區(qū)有關(guān)ORFV感染的臨床病例報(bào)道不斷增多,其感染的宿主范圍也在逐漸擴(kuò)大,除綿羊、山羊等中小反芻動(dòng)物外,也不斷有麝牛、馴鹿、松鼠、海豹等多種野生動(dòng)物以及人發(fā)生感染的報(bào)道。此外,該病毒可通過(guò)直接接觸感染人類,嚴(yán)重威脅人類的身體健康,成為影響我國(guó)乃至全世界公共衛(wèi)生安全的一個(gè)重要隱患,具有深遠(yuǎn)的公共衛(wèi)生意義。針對(duì)該病在我國(guó)發(fā)生的嚴(yán)峻形勢(shì),本試驗(yàn)通過(guò)PCR和ELISA方法分別對(duì)病毒核酸以及血清抗體進(jìn)行檢測(cè),調(diào)查其在吉林省羊群中的感染分布情況,初步闡明其流行規(guī)律。這不僅為研究病毒的分子致病機(jī)制奠定基礎(chǔ),而且將為針對(duì)感染現(xiàn)狀日益嚴(yán)重的羊傳染性膿皰病科學(xué)防控措施的制定提供重要的理論依據(jù)。1pcr檢測(cè)和血清界定1.1材料628份痂皮組織樣本采集自2006-2010年吉林省農(nóng)安、九臺(tái)、遼源、通化、延邊、松原、白城、四平、大安等9個(gè)市縣85個(gè)養(yǎng)羊戶不同年齡不同品種疑似羊傳染性膿皰病毒感染羊只;2160份血清樣本隨機(jī)采集自上述地區(qū)同期的85個(gè)發(fā)病羊群;采集組織和血清樣本均置于-20℃保存。1.2試劑MiniBEST病毒DNA提取試劑盒、rTaqDNA聚合酶、dNTP、DNADL2000Marker等均購(gòu)自大連TaKaRa公司;GST-CBP融合蛋白由本實(shí)驗(yàn)室制備保存;ORFV陽(yáng)性羊血清由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。1.3引物根據(jù)GenBank公布發(fā)表的ORFV干擾素抗性蛋白(Interferonresistanceprotein,VIR)基因序列,用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)目的片段擴(kuò)增引物,引物由上海生物工程有限公司合成。依據(jù)VIR基因設(shè)計(jì)的引物序列如下:P15′-TTGCTGCGAGGACGGAAACCCG-3′;P25′-TGCAGGTGAAGCGCGGACAGTG-3′,預(yù)期擴(kuò)增目的片段大小為284bp。1.4DNA提取及PCR檢測(cè)用MiniBEST病毒DNA提取試劑盒提取病毒基因組DNA,操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以提取的病毒基因組DNA為模板,采用25μL的PCR反應(yīng)體系,PCR擴(kuò)增目的基因片段。PCR體系為:10×PCRBuffer2.5μL,2.5mmol/LdNTP1.5μL,rTaq酶0.5μL,25mmol/LP1、P2各1μL,模板5μL,滅菌蒸餾水13.5μL。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性2min30s;94℃30s,55℃30s,72℃40s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。1.5血清學(xué)檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)室以大腸桿菌BL21(DE3)大腸桿菌表達(dá)的ORFVGST-CBP融合蛋白作為包被抗原,通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件,建立了用于ORFV抗體檢測(cè)的間接ELISA方法。用上述建立的間接ELISA方法對(duì)臨床收集的血清樣品進(jìn)行檢測(cè),將待檢血清樣本按1∶40進(jìn)行稀釋,100μL/孔,每個(gè)血清樣本設(shè)2個(gè)重復(fù)孔,同時(shí)設(shè)有ORFV陽(yáng)性血清、陰性血清以及空白對(duì)照孔。ELISA測(cè)定結(jié)束后,通過(guò)酶標(biāo)儀讀其在490nm處的D值,所得數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(t檢驗(yàn))。2結(jié)果2.1擴(kuò)增特異性基因片段PCR檢測(cè)應(yīng)用PCR方法從采集自吉林省農(nóng)安、九臺(tái)、松原、白城等9個(gè)市縣的153份痂皮組織樣品中均擴(kuò)增到特異性的基因片段,大小約284bp,與預(yù)期結(jié)果一致(圖1);羊群感染的平均陽(yáng)性率為56.47%(48/85),痂皮組織樣本的平均陽(yáng)性率為24.36%(153/628),各地區(qū)ORFV陽(yáng)性率從16.42%～32.60%不等,其中松原、白城地區(qū)的陽(yáng)性率較高(表1)。2.2成年羊不同性別羊羊的檢出率羔羊和育肥羊的ORFV抗原檢出率較高,分別為30.27%(56/185)和31.34%(68/217);在成年羊,公羊的檢出率最低,為6.94%(5/72);母羊的抗原陽(yáng)性率稍高于公羊,為15.58%(24/154)(表2)。2.3羊及蒙古羊等抗寒羊品種的陽(yáng)性檢出情況對(duì)采自不同品種羊的痂皮樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)分析,結(jié)果顯示:小尾寒羊、東北細(xì)毛羊及蒙古羊等綿羊品種的陽(yáng)性檢出率高于波爾山羊、遼寧絨山羊以及黑山羊等山羊品種,在綿羊品種中,小尾寒羊的陽(yáng)性檢出率最高,為31.07%(32/103);遼寧絨山羊在山羊品種中的檢出率最高,為23.93%(28/117)(表3)。2.4血清抗體檢測(cè)ORFV抗體陽(yáng)性率通過(guò)間接ELISA方法對(duì)采集自吉林省農(nóng)安、九臺(tái)、松原、白城等9個(gè)市縣85個(gè)羊群的2160份血清樣本進(jìn)行血清抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn),所有被檢羊群中均存在有ORFV感染,ORFV抗體平均陽(yáng)性率為39.44%(852/2160),各地的抗體陽(yáng)性率從18.95%～53.49%不等,其中松原、白城以及農(nóng)安地區(qū)羊群中ORFV抗體陽(yáng)性率較高(表4)。2.5黨員質(zhì)量分?jǐn)?shù)造林密度羔羊和育肥羊ORFV抗體陽(yáng)性率較高,陽(yáng)性率分別為50.21%(237/472)和57.17%(335/586);在成年羊,公羊的抗體陽(yáng)性率為17.80%(94/528),母羊的抗體陽(yáng)性率為32.40%(186/574)(表5)。2.6抗體陽(yáng)性率對(duì)不同品種羊的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn),綿羊ORFV感染的血清學(xué)陽(yáng)性率明顯高于山羊,其中東北細(xì)毛羊的抗體陽(yáng)性率最高,為51.39%(221/432),在山羊品種中,遼寧絨山羊的抗體陽(yáng)性率較高,為34.06%(156/458)(表6)。3不同地區(qū)和地區(qū)羊受感染的發(fā)生率及發(fā)生情況羊傳染性膿皰病在世界各養(yǎng)羊國(guó)家和地區(qū)均有流行和發(fā)生,我國(guó)的十多個(gè)省份均有報(bào)道,其中以北方的養(yǎng)羊省份較為常見(jiàn),目前該病已成為各養(yǎng)羊國(guó)家和地區(qū)羊群中常見(jiàn)的疫病之一。由于ORFV抵抗力強(qiáng),羊群一旦被感染則不易被清除,可持續(xù)危害羊群多年。此外,近年來(lái)頻繁的從國(guó)外引種、羊群飼養(yǎng)密度的加大以及粗放的飼養(yǎng)管理,導(dǎo)致羊群感染狀況日益嚴(yán)重且常呈全群性發(fā)生,給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)應(yīng)用PCR和間接ELISA方法分別對(duì)2006-2010年間采集自吉林省農(nóng)安、九臺(tái)、遼源、四平、松原、白城等9個(gè)市縣85個(gè)羊群的628份痂皮樣本和2160份血清樣本進(jìn)行ORFV核酸以及血清抗體檢測(cè),病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,在各地區(qū)不同時(shí)期不同年齡段不同品種羊的皮膚痂皮樣本中均可檢測(cè)到ORFV,羊群中ORFV感染平均陽(yáng)性率為24.36%(153/628),這表明ORFV在羊群中長(zhǎng)期帶毒,呈持續(xù)性流行狀態(tài)。在不同年齡段的羊,以1～6月齡羔羊的抗原陽(yáng)性率最高,表明ORFV主要侵害羔羊,而對(duì)成年羊的危害相對(duì)較小。在不同品種的羊,各品種羊的抗原陽(yáng)性率不同,小尾寒羊、東北細(xì)毛羊及蒙古羊等綿羊品種的陽(yáng)性檢出率高于波爾山羊、遼寧絨山羊以及黑山羊等山羊品種,表明不同品種羊?qū)RFV的易感性不同,綿羊較山羊較為易感。血清學(xué)等調(diào)查結(jié)果顯示,吉林省各縣市的抗體陽(yáng)性率從18.95%～53.49%不等,其中松原、白城和農(nóng)安地區(qū)羊群中ORFV抗體陽(yáng)性率較高。以上這些結(jié)果表明,ORFV在吉林省大部分地區(qū)羊群中的感染已經(jīng)非常普遍,應(yīng)該根據(jù)ORFV的感染現(xiàn)狀有針對(duì)性地加強(qiáng)對(duì)該病的防控。通過(guò)對(duì)不同地區(qū)ORFV的感染率分析發(fā)現(xiàn),不同縣市的ORFV感染率存在一定的差別,其中吉林省北部的松原、白城等地區(qū)羊群的感染較為嚴(yán)重,這提示我們飼養(yǎng)環(huán)境與ORFV感染有很大關(guān)系,可以通過(guò)降低羊群的飼養(yǎng)密度、改善羊場(chǎng)的環(huán)境來(lái)降低ORFV感染的發(fā)生率。此外,對(duì)不同年齡段羊群的ORFV感染率分析發(fā)現(xiàn),ORFV主要感染羔羊,尤其是斷奶前后的羔羊,我們分析其原因:一方面可能是羔羊在吮乳過(guò)程中通過(guò)與感染的母羊接觸而感染,另一方面是由于羔羊通過(guò)與病羊接觸而傳播,這提示我們ORFV的水平傳播是一個(gè)重要的傳播途徑。因此,在引種時(shí)應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的檢疫,及時(shí)淘汰陽(yáng)性種羊,加強(qiáng)對(duì)環(huán)境的消毒等是降低ORFV感染的重要途徑。另外,在本次流行病學(xué)調(diào)查所涉及的85個(gè)羊群均未進(jìn)行過(guò)羊傳染性膿皰病毒疫苗接種,這可能是由于該病的死亡率較低而未引起養(yǎng)羊戶的高度重視,造成羊群發(fā)生普遍感染。這個(gè)現(xiàn)象也提示我們,選擇恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間進(jìn)行疫苗接種也能在一定程度上控制羊群中ORFV感染的發(fā)生。近年來(lái),羊傳染性膿皰病在世界各養(yǎng)羊國(guó)